專利名稱：一種選育新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種選育新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法。
背景技術(shù)：
利用雄性不育系生產(chǎn)雜交種是我國許多作物雜種優(yōu)勢利用的主要途徑。我國油菜雜種優(yōu)勢利用存在多樣性，包括細(xì)胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)、細(xì)胞核雄性不育(含PGS系統(tǒng))、化學(xué)殺雄和自交不親和等。細(xì)胞質(zhì)雄性不育性的研究和利用， 是當(dāng)前和今后長期采用的雜種優(yōu)勢育種的主要途徑。目前國內(nèi)外利用的油菜CMS主要有 pol CMS、Shan2A CMS、ogu CMS 禾口 nap CMS 等。
Pol CMS起源于一個(gè)歐洲甘藍(lán)型油菜品系波里馬，傅廷棟于1972年在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)Polima CMS(polCMS)，由于其不育性相對穩(wěn)定，恢復(fù)系和保持系相對容易尋找而最早實(shí)現(xiàn)三系配套，被認(rèn)為是世界上第一個(gè)有實(shí)用價(jià)值的細(xì)胞質(zhì)雄不育類型(傅廷棟，2000)。但是pol CMS的缺點(diǎn)是在低溫或高溫條件下，易出現(xiàn)微量花粉而影響雜交種純度。Sian 2A CMS是李殿榮于1976年在甘藍(lán)型油菜品種間S74-3x(豐收4號(hào)+7207混合授粉)〕復(fù)交組合后代中發(fā)現(xiàn)，并且實(shí)現(xiàn)了三系配套。陜2A與polCMS是否屬于同一系統(tǒng)尚無定論。Sian 2A CMS不育系也容易受溫度影響而影響雜交種純度。Ogu CMS是一個(gè)新的油菜胞質(zhì)雄性不育類型(劉后利，1985;傅廷棟，2000)。改良的Ogu CMS在不同的溫光條件下不育性表現(xiàn)非常穩(wěn)定，不受環(huán)境條件影響。但其恢復(fù)基因來源單一。在利用時(shí)，不育系和恢復(fù)系需要同時(shí)轉(zhuǎn)育，操作相對漫長。Tcms的恢保關(guān)系相同，它們被認(rèn)為屬同一類型，合稱nap CMS。它的優(yōu)點(diǎn)是恢復(fù)品種多，缺點(diǎn)是不育性不穩(wěn)定，對溫度十分敏感，難以用于生產(chǎn)實(shí)踐。因此，發(fā)掘和創(chuàng)建新型雄性不育細(xì)胞質(zhì)一直是油菜雜種優(yōu)勢利用的重要課題。甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜雜交屬于種間雜交，不是一般遠(yuǎn)緣雜交的范疇，甘白種間雜交表現(xiàn)雜交親和性強(qiáng)，容易得到雜交種子，且Fl三倍體雜交種(AAC)不育性表現(xiàn)為結(jié)實(shí)率較低，但每一角果可以得到正常發(fā)育的種子2—4粒，這些雜交種種子能正常發(fā)芽，少數(shù)能得到較為正常的后代。通過甘白種間雜交將白菜型油菜的優(yōu)良性狀導(dǎo)入甘藍(lán)型油菜是改良甘藍(lán)型油菜的一個(gè)重要途徑(劉后利，2002)。甘藍(lán)型油菜的染色體組為AACC，而白菜型油菜的染色體組為AA，兩者有一個(gè)共同的染色體組AA，但長時(shí)間的分化使兩者差異顯著，并且A和C基因組有75%以上的同源性。甘白雜交Fl為三倍體(AAC)，其自交的F2代分離明顯，容易出現(xiàn)各種分離狀態(tài)的油菜，如白菜型、甘藍(lán)型和中間型或畸形的出現(xiàn)，葉片有些表現(xiàn)畸形，裂片眾多，雌雄蕊出現(xiàn)不育等現(xiàn)象。所以在甘白雜交后代(AAC)中極易發(fā)生大量的非同源染色體的重組，導(dǎo)致染色體的重排、基因突變、表觀遺傳學(xué)的變化和轉(zhuǎn)座子的激活等，導(dǎo)致控制育性的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)模式的改變，產(chǎn)生新的不育系。若細(xì)胞質(zhì)為不育胞質(zhì)，對應(yīng)的細(xì)胞核基因發(fā)生突變，就有可能出現(xiàn)新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育。盡管甘白雜交后代出現(xiàn)的不育單株有可能是由于染色體不正常引起，但也有可能是由于部分同源片段的重組造成不育，然而傳統(tǒng)觀念認(rèn)為不育都是由于染色體不正常引起，所以忽視了基因突變造成的
不育單株?，F(xiàn)有甘藍(lán)型油菜中細(xì)胞質(zhì)雄性不育系存在諸多問題，如Pol CMS和Sian 2A CMS 不育系容易受環(huán)境影響，出現(xiàn)微量花粉，影響了雜交種產(chǎn)量潛力的發(fā)揮；Ogu CMS恢復(fù)基因單一，不育系和恢復(fù)系需要同時(shí)轉(zhuǎn)育，過程繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種選育新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法，該方法利用異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜與其二倍體親本種白菜型油菜雜交，從雜交后代中選擇出新的白菜型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系，與甘藍(lán)型油菜測交，篩選出保持系和恢復(fù)系，同時(shí)將表現(xiàn)為全不育的測交種繼續(xù)與對應(yīng)的測驗(yàn)種回交數(shù)次，直至得到穩(wěn)定的不育系和對應(yīng)的保持系，實(shí)現(xiàn)三系配套，培育一種新的甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育。從甘藍(lán)型油菜和白菜型油菜雜交衍生的后代中選擇的不育單株不育徹底，沒有死蕾、閉蕾和柱頭外露等不良性狀出現(xiàn)，將其不育系轉(zhuǎn)育到甘藍(lán)型油菜中對拓寬甘藍(lán)型油菜不育系統(tǒng)的范圍具有重要意義。本發(fā)明依次通過下列步驟實(shí)現(xiàn)
(1)將白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交；Fl代隔離自由授粉，得到F2代；
(2)將收獲的F2種子播種種植，淘汰花蕾黃化、死蕾和柱頭外露的植株，保留花瓣形態(tài)較正常的不育白菜型油菜單株；
(3)選擇長勢正常的不育白菜型油菜單株，分別與10個(gè)白菜材料測交；一個(gè)月后觀察田間生長情況，選擇自交不結(jié)實(shí)但自由授粉結(jié)實(shí)正常的不育單株；
(4)種植白菜測交種，觀察表型；
(5)將步驟(3)所選不育單株用常規(guī)方法檢測確認(rèn)是否為新的白菜型油菜細(xì)胞質(zhì)不育
系；
(6)將新的白菜型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系與甘藍(lán)型油菜測交，得到Fl種子；
(7)種植F1，若Fl表現(xiàn)不育，則對應(yīng)的測驗(yàn)種為保持系；若Fl表現(xiàn)可育，則對應(yīng)的測驗(yàn)種為恢復(fù)系；將表現(xiàn)為全不育的測交種與對應(yīng)的保持系繼續(xù)回交，得到BC1，其中全不育的測交種特征表現(xiàn)為不育系生長發(fā)育正常，不育性徹底，沒有死蕾、閉蕾和柱頭外露等不良性狀出現(xiàn)；
(8)種植BC1，選擇與保持系表型接近的優(yōu)良不育單株與保持系繼續(xù)回交得到BC2；
(9)種植BC2，重復(fù)步驟(8)的方法，循環(huán)4次，最終得到BC6，在每次回交過程中，選擇與保持系表型接近的優(yōu)良不育單株，同時(shí)淘汰自由授粉結(jié)實(shí)不正常的不育單株；
(10)將所選不育單株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)染色體數(shù)目鑒定，染色體數(shù)目為38并且自由授粉和雜交結(jié)實(shí)都正常的不育單株即為新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；
上述方法步驟3所述的10個(gè)白菜材料是指黃巖寧波種、五峰紅桿子、余井花籽、三都黃油菜、德清金菜籽、杭州八月菜、溫江七星劍、邱北苦菜子、遂川油菜和宜昌小油菜。將不育系、保持系和恢復(fù)系組合在一起，實(shí)現(xiàn)三系配套。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是以新的白菜型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系與甘藍(lán)型油菜雜交，回交數(shù)次選育出新的甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及相對應(yīng)的保持系。此方法創(chuàng)建的新的不育系具有現(xiàn)有不育系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，并且其育性徹底，受環(huán)境溫度影響較小，沒有死蕾、閉蕾和柱頭外露等不良性狀出現(xiàn)；恢復(fù)系和保持系同時(shí)存在，且恢復(fù)系較多，易配組合。
具體實(shí)施例方式
(1)將白菜型油菜品種浠水油菜白和甘藍(lán)型油菜中雙7號(hào)雜交；Fl代隔離自由授粉，得到F2代；
(2)將收獲的F2種子播種1051株，淘汰花蕾黃化、死蕾和柱頭外露的植株，保留花瓣形態(tài)較正常的不育白菜型油菜單株15株；
(3)選擇長勢正常的不育白菜型油菜單株，分別與10個(gè)白菜材料測交；一個(gè)月后觀察田間生長情況，選擇自交不結(jié)實(shí)但自由授粉結(jié)實(shí)正常的不育單株一株，編號(hào)為BR18 ；
(4)種植白菜測交種，觀察表型
I有5個(gè)材料(分別為黃巖寧波種、五峰紅桿子、余井花籽、三都黃油菜和德清金菜籽) 測交后表現(xiàn)為全不育，則對應(yīng)的測驗(yàn)種為不育系的保持系。選擇不育性徹底，無不良性狀并與保持系表型接近的不育單株做母本，與保持系回交。按照同樣的原則回交5次，直至培育出表現(xiàn)穩(wěn)定的不育系及相對應(yīng)的保持系。最后用顯微鏡觀察確定染色體數(shù)目為20條，確定其不育不是由于染色體不正常引起；
II有3個(gè)材料(分別為杭州八月菜、溫江七星劍和邱北苦菜子)測交種出現(xiàn)可育，另外 2個(gè)材料測交種(分別為遂川油菜和宜昌小油菜)出現(xiàn)半不育，則這5個(gè)材料含有BR18不育系的恢復(fù)基因，其中3個(gè)材料為BR18恢復(fù)系；
(5)將BR18白菜型油菜不育單株，分別與現(xiàn)有的30個(gè)波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育 (polCMS)、蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育(OguCMS)、Shan2A CMS和nap CMS的不育系和保持系測交， 測定恢保關(guān)系，確定編號(hào)為BR18的不育材料為新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型。其中中雙11號(hào)是BR18不育系的恢復(fù)系，浙雙72為其保持系；
(6)將新的白菜型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系BR18與甘藍(lán)型油菜浙雙72號(hào)測交，得到Fl種子；
(7)種植Fl種子表現(xiàn)不育。選擇不育單株與浙雙72號(hào)繼續(xù)回交，得到BC1，不育單株的選擇標(biāo)準(zhǔn)為不育系生長發(fā)育正常，不育性徹底，沒有死蕾、閉蕾和柱頭外露等不良性狀出現(xiàn)；
(8)種植BC1，選擇表型與浙雙72號(hào)表型接近的優(yōu)良不育單株與浙雙72號(hào)繼續(xù)回交得到BC2 ；
(9)種植BC2，重復(fù)步驟(8)的方法，循環(huán)4次，最終得到BC6，在每次回交過程中，選擇與浙雙72號(hào)表型接近的優(yōu)良不育單株，同時(shí)淘汰自由授粉結(jié)實(shí)不正常的不育單株；
(10)將不育單株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)染色體數(shù)目鑒定，染色體數(shù)目為38并且自由授粉和雜交結(jié)實(shí)都正常的不育單株即為新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。將不育系，保持系和恢復(fù)系中雙11號(hào)組合在一起，實(shí)現(xiàn)三系配套。
權(quán)利要求
1. 一種選育新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法，其特征在于依次通過下列步驟實(shí)現(xiàn)(1)將白菜型油菜與甘藍(lán)型油菜雜交；Fl代隔離自由授粉，得到F2代；(2)將收獲的F2種子播種種植，淘汰花蕾黃化、死蕾和柱頭外露的植株，保留花瓣形態(tài)較正常的不育白菜型油菜單株；(3)選擇長勢正常的不育白菜型油菜單株，分別與10個(gè)白菜材料測交；一個(gè)月后觀察田間生長情況，選擇自交不結(jié)實(shí)但自由授粉結(jié)實(shí)正常的不育單株；(4)種植白菜測交種，觀察表型；(5)將步驟(3)所選不育單株用常規(guī)方法檢測確認(rèn)是否為新的白菜型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系；(6)將新的白菜型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系與甘藍(lán)型油菜測交，得到Fl種子；(7)種植F1，若Fl表現(xiàn)不育，則對應(yīng)的測驗(yàn)種為保持系；若Fl表現(xiàn)可育，則對應(yīng)的測驗(yàn)種為恢復(fù)系；將表現(xiàn)為全不育的測交種與對應(yīng)的保持系繼續(xù)回交，得到BC1，其中全不育的測交種特征表現(xiàn)為不育系生長發(fā)育正常，不育性徹底，沒有死蕾、閉蕾和柱頭外露等不良性狀出現(xiàn)；(8)種植BC1，選擇與保持系表型接近的優(yōu)良不育單株與保持系繼續(xù)回交得到BC2；(9)種植BC2，重復(fù)步驟(8)的方法，循環(huán)4次，最終得到BC6，在每次回交過程中，選擇與保持系表型接近的優(yōu)良不育單株，同時(shí)淘汰自由授粉結(jié)實(shí)不正常的不育單株；(10)將所選不育單株進(jìn)行細(xì)胞學(xué)染色體數(shù)目鑒定，染色體數(shù)目為38并且自由授粉和雜交結(jié)實(shí)都正常的不育單株即為新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；上述方法步驟3所述的10個(gè)白菜材料是指黃巖寧波種、五峰紅桿子、余井花籽、三都黃油菜、德清金菜籽、杭州八月菜、溫江七星劍、邱北苦菜子、遂川油菜和宜昌小油菜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種選育新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的方法，屬于遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。該方法利用異源四倍體物種甘藍(lán)型油菜與其二倍體親本種白菜型油菜雜交，在其后代中選擇新型白菜型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系，然后與甘藍(lán)型油菜測交，篩選出保持系和恢復(fù)系，同時(shí)將表現(xiàn)全不育的測交種與其對應(yīng)的測驗(yàn)種回交數(shù)次，直至得到穩(wěn)定的不育系和對應(yīng)的保持系，實(shí)現(xiàn)三系配套。該發(fā)明培育的新型甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)不育系不育性徹底，受環(huán)境影響小，并且具有配制組合容易和不育基因不存在不良基因累贅問題等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A01H1/02GK102150613SQ201110099178
公開日2011年8月17日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月20日
發(fā)明者付東輝, 張海煥, 李加納, 錢偉, 魏麗娟 申請人:西南大學(xué)