專利名稱：一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌及其應(yīng)用方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
氨基葡萄糖(Glucosamine，2-amino-2-deoxy-D-glucose)是葡萄糖的一個羥基被 氨基取代后的化合物。幾乎存在與所有有機(jī)體中，包括細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、植物以及動物 體，是糖蛋白和蛋白聚糖的主要組成成分。氨基葡萄糖能特異性地作用于關(guān)節(jié)軟骨，恢復(fù) 軟骨細(xì)胞正常的代謝功能，能刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生具有正常多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白多糖，抑制損 傷軟骨的酶，延緩骨性關(guān)節(jié)炎的病理過程和疾病的進(jìn)展，改善關(guān)節(jié)活動，緩解疼痛。因此，臨 床上多用于治療骨關(guān)節(jié)炎。此外，氨基葡萄糖還具有肝腎解毒，發(fā)揮抗炎、護(hù)肝的作用；刺激 嬰兒腸道中雙歧桿菌的增生；在醫(yī)藥上作為抗菌消炎藥物，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和胃潰 瘍疾病。在食品中，是嬰兒配方乳中添加的一種重要微量糖類成分，還是合成VB6和核黃素 中間體的起始原料，此外也可用于化妝品和飼料添加劑中。甲殼素水解法是我國目前生產(chǎn)氨基葡萄糖的主要方法，甲殼素水解法轉(zhuǎn)化效率 低，產(chǎn)生大量酸性廢水，因而產(chǎn)品成本高、污染嚴(yán)重。目前，國內(nèi)外對生物法生產(chǎn)氨基葡萄糖 的報道較少，發(fā)酵產(chǎn)量也較低，尚未達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌，該菌株可用于 發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖。所述基因工程菌是將氨基葡萄糖合成酶的基因、glmS、導(dǎo)入大腸桿菌得到的基因 工程菌。所述基因工程菌的構(gòu)建方法為通過克隆五cWi BL21(DE3)基因組(GenBank No. CP001509. 3)中氨基葡萄糖合成酶的基因^ Λ 片斷，用限制性內(nèi)切酶fee I私Hind III對^ Λ 基因片斷和pET18a(+)進(jìn)行酶切，并通過連接反應(yīng)將^ Λ 基因片斷插入質(zhì)粒 pET-28a(+)的fee I私Hind III位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pETj8a(+)-g/ffi ，再將攜帶有 glmS的質(zhì)粒pET-28a (+) -glmS轉(zhuǎn)化大腸桿菌五coli K-12中得到基因工程菌五coli K-12-^7 成所述五coli K-12 購自 ATCC (ATCC No 25947)，所述質(zhì)粒為 pET48a (+)。本發(fā)明還解決的技術(shù)問題是提供了一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基 葡萄糖的方法。為解決上述問題，具體方法如下
將基因工程菌五coli在37°C條件下培養(yǎng)12 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 rpm，待
0D_達(dá)到0.8時，按照10%濃度加入乳糖(使發(fā)酵液中乳糖終濃度為5 g/L)進(jìn)行誘導(dǎo)。所述培養(yǎng)基組成為種子培養(yǎng)基蛋白胨12 g，酵母膏24 g，甘油4ml，按照50 μ g/ml加入卡那霉 素，PH自然；
發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨12 g，酵母膏24 g，葡萄糖10 g，按照50 μ g/ml加入卡那霉素，PH自然。本發(fā)明采用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖，具有發(fā)酵時間短，生產(chǎn)強(qiáng)度高，生產(chǎn) 成本低，對環(huán)境污染小，無過敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。生產(chǎn)得到的氨基葡萄糖可以廣泛用于醫(yī)藥、食 品等領(lǐng)域。
具體實施例方式實施例1 五co/i構(gòu)建方法 設(shè)計引物
上引物5’-CGA GCT CAT GTG TGG AAT TGT TGG C_3，(下劃線序列表示限制性內(nèi)切酶 識別位點(diǎn)I)
下引物5’-CCC AAG CTT TTA CTC AAC CGT AAC CGA-3’(下劃線序列表示限制性酶切 佐為、Hind III)
氨基葡萄糖合成酶基因glmS是利用E. coli BL21 (DE3)基因組(GenBank No. CP001509.3)作為模版進(jìn)行PCR得到的。用限制性內(nèi)切酶fee I _ind III對基因片 斷和pET-28a (+)進(jìn)行酶切，并通過連接反應(yīng)將^ Λ 基因片斷插入質(zhì)粒pET_28a (+)的Sac I私Hind III位點(diǎn)之間，得到重組質(zhì)粒pET-28a(+)-g/ffl 。將重組質(zhì)粒pET_28a (+)飛·/ 轉(zhuǎn) itB. coli K-12 (ATCC No: 25947)，得到重組大腸桿菌五 coli HglmS。實施例2 氨基葡萄糖的檢測方法；
氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制準(zhǔn)確稱取氨基葡萄糖0.0100 g，加入20.0 ml蒸餾水， 配制成0.5000 g/Ι的氨基葡萄糖溶液，然后分別稀釋成濃度為0.2500 g/1,0. 1250g/l, 0. 0625g/l,0. 0313 g/1的溶液。分別取相應(yīng)濃度氨基葡萄糖溶液0. 5 ml于玻璃塞試管中， 加入乙酰丙酮試劑1. 0 ml，90°C水浴處理lh，冷卻至室溫，慢慢加入96% (ν/ν)乙醇10. OmL (勿攪動)，然后加入DMAB試劑1.0 ml，混合均勻。因反應(yīng)體系由堿性變?yōu)樗嵝裕枳⒁庥写?量二氧化碳?xì)怏w產(chǎn)生?；旌虾笫覝胤胖?小時穩(wěn)定，530nm比色。以試樣濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氨基葡萄糖的檢測取發(fā)酵液5. 0 ml，加入6 mol/1 HCl 8.0 ml，重新懸浮菌體， 將該菌懸液轉(zhuǎn)移至具塞試管中，100°C水浴4.0 h，冷卻至室溫，用12 mol/L的NaOH調(diào)pH至 7.0，補(bǔ)蒸餾水至20.0 ml，取0.5 ml加入乙酰丙酮試劑1. 0 ml，90°C水浴處理lh，冷卻至室 溫，慢慢加入96%乙醇10 ml (勿攪動)，然后加入對二甲胺基苯甲醛(DMAB)試劑1.0 ml，混 合均勻。混合后室溫放置1小時，530nm處比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌體氨基葡萄糖濃度。實施例3:五coli [\2-glmS纖卞法
用LB斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌五coli HglmS，培養(yǎng)12 h后用接種環(huán)取1環(huán) 接入裝有20 mL種子培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基為種子培養(yǎng) 基蛋白胨12 g，酵母膏24 g，甘油4ml，按照50 μ g/ml加入卡那霉素，pH自然。培養(yǎng)時 間為12 h，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm。以5%的接種量接入裝有100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500 ml的三角瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨12 g，酵母膏24 g，葡萄糖10 g，同時按照50 yg/ml加入卡那霉素， PH自然。培養(yǎng)時間為12 h，溫度37°C，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，待OD6c 達(dá)到0.8時，按照10%濃 度加入乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中氨基葡萄糖濃度可以達(dá)到20g/L。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的 人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng) 該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。序列表
<110>江南大學(xué)
<120> 一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌及其應(yīng)用 <160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計用于擴(kuò)增。 <400> 1
cgagctcatg tgtggaattg ttggc25
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213>人工合成序列
<220>
<223>根據(jù)基因序列設(shè)計用于擴(kuò)增。 <400> 2
cccaagcttt tactcaaccg taaccga2權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌，是將氨基葡萄糖合成酶的基因?qū)氪竽c桿菌得到的 基因工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述氨基葡萄糖合成酶的基因來源 于 GenBank No. CPOO1509. 3 基因組中 片斷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的構(gòu)建方法為1)用限制性內(nèi)切酶feeI私Hind III對^ Λ 基因片斷和pET48a(+)進(jìn)行酶切，并通 過連接反應(yīng)將^ Λ 基因片斷插入質(zhì)粒pET48a(+)的fee I私Hind III位點(diǎn)之間，得到重 組質(zhì)粒 pET-28a (+) -glmS ；2)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌五co/iK-12中得到基因工程菌五coli K-12-^7 成
4.一種權(quán)利要求1所述基因工程菌的發(fā)酵方法，其特征在于，將基因工程菌在37°C條 件下培養(yǎng)12 h，搖床轉(zhuǎn)速為200 rpm，待0D_達(dá)到0. 8時，加入濃度為10%的乳糖進(jìn)行誘 導(dǎo)，使乳糖濃度維持在5 g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，每升種子培養(yǎng)基組成為蛋白胨12g，酵 母膏M g，甘油細(xì)1，按照50 yg/ml加入卡那霉素，pH自然。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，每升發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨12g，酵 母膏M g，葡萄糖10 g，按照50 μ g/ml加入卡那霉素，PH自然。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)氨基葡萄糖基因工程菌及其應(yīng)用，是將氨基葡萄糖合成酶的基因(glmS)導(dǎo)入大腸桿菌E.coliK-12得到的基因工程菌E.coliK-12-glmS，該菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)氨基葡萄糖，具有發(fā)酵時間短，生產(chǎn)強(qiáng)度高，生產(chǎn)成本低，對環(huán)境污染小，無過敏反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)得到的氨基葡萄糖可以廣泛用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。
文檔編號C12P19/02GK102071164SQ20101057870
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者劉龍, 陳堅 申請人:江南大學(xué)