一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用。本發(fā)明的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子是通過(guò)發(fā)明人所設(shè)計(jì)的引物，以水稻基因組DNA為模板，利用PCR方法從水稻中分離得到。通過(guò)該啟動(dòng)子在水稻中的表達(dá)特異性實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的啟動(dòng)子使β-葡糖苷酸酶(GUS)報(bào)告基因只在水稻種子胚中特異性表達(dá)。說(shuō)明本發(fā)明的啟動(dòng)子可以啟動(dòng)外源基因在植物的胚中特異性的表達(dá)，適用于任何種子具有胚的植物，即單子葉植物或雙子葉植物。
【專利說(shuō)明】一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。具體而言，本發(fā)明涉及一種植物基因表達(dá)啟動(dòng)子及其應(yīng)用，該啟動(dòng)子能夠在單子葉植物，尤其是水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在胚中表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002]生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、 生理過(guò)程都是生物體的眾多基因有序的、并在外界環(huán)境因子的作用下特定表達(dá)的結(jié)果?；蛘６幸?guī)律的表達(dá)保證了植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。近年來(lái)，分子生物學(xué)的研究表明轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中的起始步驟，也是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式之一?；騿?dòng)子控制著基因在特定的組織、特定的發(fā)育階段以及一定的環(huán)境條件下表達(dá)。因而，分離、鑒定基因啟動(dòng)子，了解啟動(dòng)子的時(shí)空專一性表達(dá)特征及其作用機(jī)制已成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要內(nèi)容。
[0003]組織特異性啟動(dòng)子也稱器官特異性啟動(dòng)子，該類啟動(dòng)子所調(diào)控的下游基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達(dá)，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。目前，為了使外源基因在植物體內(nèi)有利、高效地發(fā)揮作用，人們開(kāi)始越來(lái)越多地研究組織特異性啟動(dòng)子、分析特異啟動(dòng)子中的順勢(shì)作用元件及作用機(jī)制，并根據(jù)需要選擇或人工構(gòu)建合適的啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)、定量三維精確調(diào)控。例如，組織特異性啟動(dòng)子在植物育種、植物生物反應(yīng)器等研究的應(yīng)用上已初見(jiàn)成效。獲得有組織專一性表達(dá)特性的啟動(dòng)子也是尋找相關(guān)功能基因的一種有效途徑。另外，植物基因工程研究中也需要具有組織特異性高表達(dá)的啟動(dòng)子，使外源目的基因能在特定的組織中高效表達(dá)。
[0004]植物種子的發(fā)育包括兩個(gè)重要的過(guò)程:胚胎發(fā)生和種子成熟。隨著胚的逐步成熟，大量貯藏產(chǎn)物，如:蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物開(kāi)始合成和積累，種子逐步成熟。胚胎發(fā)育的形態(tài)發(fā)生階段決定了植物個(gè)體的發(fā)育程序與整體結(jié)構(gòu)模式。目前對(duì)于種子的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)研究已取得了一定的進(jìn)展，但由于克隆種子胚特異性基因在技術(shù)上存在困難，例如，種子儲(chǔ)藏蛋白基因的高水平表達(dá)很容易掩蓋一些低豐度基因的信息(參見(jiàn)Goldberg et al.，celll989,56:149-160);缺少胚胎發(fā)育過(guò)程中的一些特殊分子或細(xì)胞標(biāo)記等原因，目前在分子生物學(xué)水平上對(duì)種子胚胎發(fā)育的了解還很少。
[0005]因而，分離、獲得種子胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，既有助于更細(xì)致地理解植物胚胎發(fā)育中形態(tài)發(fā)生與細(xì)胞分化的分子機(jī)理，又能廣泛應(yīng)用于植物基因工程研究中，使外源目的基因能在特定的組織中高效表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)定量三維精確調(diào)控，在改良作物品質(zhì)的同時(shí)又可減少對(duì)植物的不利影響。
[0006]水稻是世界上最重要的糧食作物之一，胚是水稻種子的重要組成部分，胚的發(fā)生和發(fā)育直接影響著水稻的繁殖和發(fā)育。因而分離、鑒定水稻種胚特異性啟動(dòng)子，了解胚特異基因表達(dá)的時(shí)空專一性特征及其相關(guān)表達(dá)機(jī)制已成為研究水稻種胚的發(fā)生和發(fā)育的主要內(nèi)容。對(duì)水稻種胚特異性表達(dá)的啟動(dòng)子的功能研究與鑒定，將有利于實(shí)現(xiàn)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物特定組織中高效表達(dá)。近年來(lái)有關(guān)水稻種子特異性的研究逐漸增多，但由于目前已知的胚發(fā)育過(guò)程中特殊分子標(biāo)記較少，具有種胚特異表達(dá)模式的功能基因的報(bào)道也不多，故對(duì)水稻種子特異性啟動(dòng)子的研究仍主要集中在胚乳特異性啟動(dòng)子上，像醇溶蛋白基因啟動(dòng)子、球蛋白基因啟動(dòng)子等，而對(duì)胚特異性啟動(dòng)子的研究及報(bào)道較少。Kuwano等研究證實(shí)水稻01el8基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)相關(guān)基因在種子種胚中特異表達(dá)(PlantBiotech J，2009，7:96-105)。Wu等通過(guò)對(duì)水稻中不同貯藏蛋白相關(guān)基因的表達(dá)模式分析，從中鑒定了一個(gè)在水稻種胚中表達(dá)強(qiáng)度較高的水稻球蛋白啟動(dòng)子Glb (參見(jiàn)Plant CellPhysiol, 1998,39:885-889)。若選擇胚特異性高強(qiáng)度表達(dá)啟動(dòng)子，有助于定時(shí)定向調(diào)控外源有用蛋白的合成，既節(jié)約能源，保證了植物正常生理活動(dòng)不受干擾，同時(shí)又能提高外源有用蛋白在種子中的儲(chǔ)藏水平。 同時(shí)，利用胚特異啟動(dòng)子可提高外源基因在植物胚中的表達(dá)和累積水平，也可改良種子品質(zhì)、將具有生理活性的蛋白或短肽導(dǎo)入種子中創(chuàng)制保健型功能新品種、利用種子作生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用外源蛋白或可食性疫苗，增加農(nóng)產(chǎn)品科技附加值等因此，胚特異啟動(dòng)子及其應(yīng)用為揭示整個(gè)植物胚胎發(fā)育的過(guò)程和機(jī)理的研究，利用生物技術(shù)改良種子品質(zhì)、分子醫(yī)藥農(nóng)場(chǎng)等研究奠定了基礎(chǔ)，具有極大的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動(dòng)外源基因在水稻胚中特異性表達(dá)的啟動(dòng)子以及該啟動(dòng)子在植物基因工程中的應(yīng)用。其中，本文中所涉及的“植物”是指單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優(yōu)選為水稻。
[0008]具體而言，一方面，本發(fā)明提供一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子包含SEQ ID No:1所示的DNA序列。
[0009]序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列為來(lái)源于日本晴水稻(Oryza sativa Lcv.Nipponbare)的水稻胚特異表達(dá)啟動(dòng)子,本文中稱為pEMBl或啟動(dòng)子pEMBl。
[0010]優(yōu)選地，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的DNA序列為SEQ ID No:1所示的DNA序列。
[0011]另一方面，本發(fā)明提供一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的DNA序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性；或者，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物；或者，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的DNA序列為具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列的植物雜交的產(chǎn)物。這些啟動(dòng)子序列與SEQ IDNo:1所示的DNA序列具有相同功能，即驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在植物胚中特異性表達(dá)，本文中稱之為“pEMBI”或“啟動(dòng)子pEMBI”。
[0012]另一方面，本發(fā)明還提供一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包含上述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
[0013]另一方面，本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體包含上述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子；
[0014]優(yōu)選地,在所述重組表達(dá)載體中，上述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子連接于待表達(dá)的基因序列的上游。優(yōu)選地，所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基因；所述重組表達(dá)載體為將SEQ IDNo:1所示的序列即pEMBl或啟動(dòng)子pEMBl構(gòu)建于pCAMBIA1391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為 pCAMBIA1391-pEMBl。[0015]另一方面，本發(fā)明還提供了一種宿主菌，所述宿主菌包含本發(fā)明提供的上述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子pEMBl、上述表達(dá)盒、或上述的重組表達(dá)載體，其中，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。
[0016]再一方面，本發(fā)明提供上述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。具體而言，所述應(yīng)用包括如下步驟:將權(quán)利要求1-3中的一項(xiàng)所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子連接于重組表達(dá)載體的待表達(dá)的基因序列上游，并且將連接于所述重組表達(dá)載體的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0017]更具體而言，培育轉(zhuǎn)基因植物是將本發(fā)明提供的上述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子連接于待表達(dá)的基因序列上游 (例如，將所述啟動(dòng)子與目標(biāo)基因融合，即合并到同一條DNAJf啟動(dòng)子序列置于目標(biāo)基因之前)，并構(gòu)建在重組表達(dá)載體中，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。待表達(dá)的基因即目標(biāo)基因包括用于改良植物品質(zhì)和積累的基因以及植物營(yíng)養(yǎng)吸收相關(guān)的基因。
[0018]并且優(yōu)選地，所述應(yīng)用可以用于改良植物胚性狀，所述植物為單子葉植物，例如水稻、小麥、玉米、大麥、高粱或燕麥，優(yōu)選為水稻；更優(yōu)選地，所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基因，所述重組表達(dá)載體為pCAMBIA1391-pEMBl，以用于改良水稻胚形狀。
[0019]本發(fā)明中所提供的啟動(dòng)子的DNA序列為(與SEQ No:1中相同):
[0020]
【權(quán)利要求】
1.一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子包含SEQID No:1所示的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的DNA序列為SEQ ID No:1所示的DNA序列。
3.一種植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子，其特征在于，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的DNA序列與SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80%同源性； 或者，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子為在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸生成的突變體或等位基因或衍生物； 或者，所述植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子的核苷酸序列具有與SEQ ID No:1所示的DNA序列的植物雜交的產(chǎn)物。
4.一種表達(dá)盒,其特征在于,所述表達(dá)盒包含權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的植物胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體包含根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子； 優(yōu)選地，在所述重組表達(dá)載體中，權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子連接于待表達(dá)的基因的序列的上游。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基因； 所述重組表達(dá)載體為pCAMBIA1391-pEMBl，其中，pCAMBIA1391為被轉(zhuǎn)入的植物雙元表達(dá)載體，pEMBl為權(quán)利要求1-3中任意`一項(xiàng)所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子。
7.—種宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子、權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒、或權(quán)利要求5或6所述的重組表達(dá)載體，其中，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。
8.—種權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的植物胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括如下步驟:將權(quán)利要求1-3中的一項(xiàng)所述的植物胚特異性表達(dá)啟動(dòng)子連接于植物雙元表達(dá)載體的待表達(dá)的基因的序列上游，并且將連接于所述重組表達(dá)載體的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103740717SQ201310727701
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年12月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月24日
【發(fā)明者】李 浩, 楊劍波, 魏鵬程, 張銀萍, 李娟 , 馬卉, 李莉, 倪大虎, 宋豐順, 楊亞春, 秦瑞英 申請(qǐng)人:安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所