一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝，采用價格較低的無機Na2SeO3作為硒源，以液體發(fā)酵培養(yǎng)的方式，在用馬鈴薯葡萄糖制備的液體培養(yǎng)基中加入Na2SeO3溶液，通過荷葉離褶傘菌絲體的富集轉化為有機硒，降低了硒的毒性，提高菌絲體的利用價值；將Na2SeO3在液體培養(yǎng)基的發(fā)酵中期加入，有效地降低硒對延滯期荷葉離褶傘菌絲體的抑制和毒害作用，提高荷葉離褶傘菌絲體中富硒胞內多糖的積累量。通過單因素試驗和Box-Behnken試驗設計以及響應面分析法，對富硒荷葉離褶傘胞內粗多糖發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得出最佳發(fā)酵條件，得到胞內粗多糖與各發(fā)酵條件各因素變量的二次回歸方程模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好，有一定的應用價值。
【專利說明】一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及硒多糖的生產工藝，具體涉及一種荷葉離褶傘富 硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝。

【背景技術】
[0002] 荷葉離裙傘afecasies )菌絲體中蛋白質含量高，氨基酸種類齊全， 含有多種維生素，其多糖可以抑制腫瘤的生長，降低胰島素依賴型小白鼠的血糖濃度，是一 種營養(yǎng)價值和藥用價值都很高的菌類。而且荷葉離褶傘菌絲體可以有效地富集一定量的 硒。食用菌對硒具有較強的富集能力，通過菌絲體細胞內物質代謝，使無機硒安全有效地轉 化為有機硒多糖，其生物藥理活性普遍高于多糖和硒，更容易被機體吸收和利用，同時營養(yǎng) 成分因富硒得到改善。荷葉離褶傘人工栽培困難，其抗雜菌能力較差、出菇條件要求極高、 子實體產量不穩(wěn)定、栽培周期長等問題嚴重影響該菌的全面推廣，改善荷葉離褶傘菌絲體 的營養(yǎng)成分，提高其應用價值顯得尤為重要。目前國內對食用菌中硒多糖研究僅限于從富 硒子實體和菌絲體中的提取條件的優(yōu)化，富硒多糖發(fā)酵條件的僅限于培養(yǎng)基成分，培養(yǎng)時 間和pH因素等因素的改變，在優(yōu)化的工藝條件下生產富硒粗多糖的產量仍然低，且工序復 雜。


【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明為了解決現有生產富硒粗多糖效率低的問題，提供一種荷葉離褶傘富硒胞 內粗多糖的發(fā)酵工藝。
[0004] 本發(fā)明是通過以下技術方案來實現的： 一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝，具體包括以下步驟： a) 供試菌種 荷葉離褶傘菌種由河西學院甘肅省應用真菌工程實驗室提供，菌種保藏在"中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，菌種保藏號CGMCC No. 1518,菌株號ZY48-1，專利 號：ZL200510096405. 0 ; b) 菌種活化 將荷葉離褶傘母種菌塊接入新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上，置于22°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 15d后，再轉接一次，22°C培養(yǎng)15d，備用； c) 液體培養(yǎng)基制備 將200g馬鈴薯洗凈，去皮挖眼，切成2cm2的小塊，加水煮沸2(T30min，至馬鈴薯小塊煮 爛能被玻璃棒戳破即可，然后過300目篩得濾液，取其濾液80(T9(K)mL加入20g葡萄糖，使 葡萄糖溶化后加水至l〇〇〇mL，備用； d) 荷葉離褶傘富硒胞內粗多糖發(fā)酵生產 將上述制備的液體培養(yǎng)基取l〇〇mL進行滅菌，所述的滅菌條件為115°C，20min、115°C， 30min、121°C，15min、121°C，20min、121°C，30min 其中的任意一種，冷卻至 20?25°C后接入 荷葉離褶傘活化菌種塊，接種后置于22°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵，至發(fā)酵的2~12d時，加入同 等滅菌條件下滅菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為(TlOug/mL，然后 繼續(xù)在22°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵一定時間，在所述的繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)酵期間每天測定荷葉離褶 傘菌絲體富硒胞內粗多糖含量； e)利用響應面曲線法得到最優(yōu)工藝條件 根據步驟d測定的荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的含量(mg/100mL)，得到優(yōu)化單 因素發(fā)酵條件，然后利用響應面曲線法得到荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的最優(yōu)發(fā)酵 工藝條件。
[0005] 1.荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的生產 1. 1滅菌條件對荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖生產的影響 將100mL的液體培養(yǎng)基和Na2Se03溶液，采取將液體培養(yǎng)基和Na 2Se03溶液分別滅菌后 再混合及兩者混合后再滅菌的不同方式，在115~121°C、滅菌2(T30min，混合時都使硒在液 體培養(yǎng)基中的濃度為10ug/mL，冷卻至20~25°C后，接入6片直徑為6mm的荷葉離褶傘活化 菌種塊，在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)至接種后第12d，測定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多 糖含量。
[0006] 結合圖1所示的標準曲線，從圖2中得知，液體培養(yǎng)基和Na2Se03溶液分別滅菌后 再混合的方式培養(yǎng)的荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖含量高；滅菌條件為12rC，20min 時，荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖含量達到最大，為70. 8 mg/100mL。
[0007] 優(yōu)選的液體培養(yǎng)基和Na2Se03溶液分別在121°C下滅菌20min后兩者再混合。
[0008] 1. 2硒濃度對荷葉離褶傘富硒胞內粗多糖含量的影響 分別對100mL的液體培養(yǎng)基和lmg/mL Na2Se03溶液在優(yōu)選滅菌條件：12rC，20min下 滅菌，將Na2Se03溶液加入液體培養(yǎng)基中，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為(TlOug/mL，冷卻至 20~25°C后接入6片直徑為6mm的荷葉離褶傘活化菌種塊，在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)至接 種后第12d，測定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖含量。
[0009] 從圖3中得知，隨著液體培養(yǎng)基中加入Na2Se03量的增加，荷葉離褶傘菌絲體富硒 胞內粗多糖含量呈現"N"字形，在濃度<4ug/mL和>4ug/mL時對荷葉離褶傘菌絲體中富硒 胞內粗多糖含量的分泌均有抑制作用。在加硒濃度為4ug/mL時，荷葉離褶傘菌絲體中富 硒胞內粗多糖含量達到113. 2 mg/100mL高于不加 Na2Se03時菌絲體中胞內粗多糖103. 6 mg/100mL 的量。
[0010] 優(yōu)選的硒添加量為在液體培養(yǎng)基中加入Na2Se03溶液使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度 為 4ug/mL〇
[0011] 1. 3硒添加時間對荷葉離褶傘富硒胞內粗多糖含量的影響 將100mL的液體培養(yǎng)基，在12rC，20min下滅菌，冷卻至2(T25°C后接入6片直徑為 6mm的荷葉離褶傘活化菌種塊，在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵至接種后第2~12d時，加入 同等條件下滅菌的Na 2Se03溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度均為4ug/mL，繼續(xù)在20~25°C、 121rpm下培養(yǎng)至接種后第12d，測定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖含量。
[0012] 如圖4所示，隨著硒添加時間的推遲，荷葉離褶傘菌絲體中富硒胞內粗多糖含量 呈現波浪式增加，后逐步降低的趨勢，在發(fā)酵的第6d加入Na 2Se03后，富硒胞內粗多糖含量 達到最大，為320. 6 mg/100mL，第6d后波浪式的降低，說明在菌絲體開始生長的過程中加 入Na2Se03有助于積累菌絲體中富硒胞內粗多糖。
[0013] 優(yōu)選的在液體培養(yǎng)基發(fā)酵的第6d加入硒為荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖合 成的優(yōu)選加入時間。
[0014] 1. 4培養(yǎng)時間對荷葉離褶傘富硒胞內粗多糖含量的影響 將100mL的液體培養(yǎng)基，在121°C，20min下滅菌，冷卻至2(T25°C后接入6片直徑為6mm 的荷葉離褶傘活化菌種塊，在20~25°C、121rpm下培養(yǎng)，至接種后發(fā)酵的第6d時，加入同等 條件下滅菌的Na2Se0 3溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度均為4ug/mL，繼續(xù)在22°C、121rpm 下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別設定為接種后第疒13d，測定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖含 量。
[0015] 如圖5所示，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長，荷葉離褶傘菌絲體內的富硒多糖含量呈 現先增加后降低的趨勢，在接種后發(fā)酵培養(yǎng)的第7?9d，荷葉離褶傘富硒胞內粗多糖含量 的增加比較緩慢，在接種后發(fā)酵培養(yǎng)的第9?10d，胞內粗多糖含量迅速增加，至發(fā)酵第10d 達到最大值，為320.2 mg/100mL，第10d后富硒胞內粗多糖含量開始降低，降低幅度較慢。
[0016] 優(yōu)選的培養(yǎng)時間為加入Na2Se03溶液后繼續(xù)在22°C、121rpm下培養(yǎng)，至接種后的第 10 do
[0017] 優(yōu)選工藝條件為：在250mL三角瓶中，加入100mL的液體培養(yǎng)基，在12rC，20min 下滅菌，冷卻至2(T25°C后接入6片直徑為6mm的荷葉離褶傘活化菌種塊，在22°C、121rpm 下培養(yǎng)，至發(fā)酵至接種后第6d時，加入同等條件下滅菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液體 培養(yǎng)基中的濃度為4ug/mL，繼續(xù)在22°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵至接種后第10d，得到的荷葉離 褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖含量最高為320. 2 mg/100mL。
[0018] 2. Box-Behnken 試驗設計 根據單因素實驗結果，固定滅菌條件，采用Box-Behnken試驗設計方法，以硒濃度、培 養(yǎng)時間和添加硒的時間為相應變量，分別以Xp X2和X3表示，并以_1，〇, 1分別代表變量的 水平，Box -Behnken設計試驗因素和水平見表1，以荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖為 響應值，見表2。
[0019] 表1 · Box-Behnken設計試驗因素與水平

【權利要求】
1. 一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在于：具體包括以下步 驟： a) 菌種活化 將荷葉離褶傘母種菌塊接入新鮮的固體培養(yǎng)基上，置于22°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d 后，再轉接一次，22°C培養(yǎng)15d，備用； b) 液體培養(yǎng)基制備 將200g馬鈴薯洗凈，去皮挖眼，切成2cm2的小塊，加水煮沸2(T30min，至馬鈴薯小塊煮 爛能被玻璃棒戳破即可，過300目篩得濾液，取其濾液80(T9(K)mL加入20g葡萄糖，使葡萄 糖溶化后加水至l〇〇〇mL定容，備用； c) 荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵生產 取100mL步驟b制備的液體培養(yǎng)基置于115~121°C下滅菌15~30min，冷卻后接入6片 直徑為6mm荷葉離褶傘活化菌種塊，接種后放在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵，發(fā)酵期間加 入同等條件下滅菌的Na 2Se03溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為(TlOug/mL，然后繼續(xù)在 2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)，每天測定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的含量。
2. 如權利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：所述的步驟c中接種后放在2(T25°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵，接種后發(fā)酵2~12d時加入同 等滅菌條件下滅菌的Na 2Se03溶液。
3. 如權利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：所述的步驟c中加入Na2Se0 3溶液后繼續(xù)在20~25°C、121rpm下培養(yǎng)，培養(yǎng)至接種后的第 7?13d。
4. 如權利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：所述的步驟c取100mL的液體培養(yǎng)基，在121°C下滅菌20min，冷卻至20~25°C后接入 6片直徑為6mm的荷葉離褶傘活化菌種塊置于22°C、121rpm下培養(yǎng)發(fā)酵，至接種后的第6d 時，加入同等條件下滅菌的lmg/mL Na2Se03溶液，使硒在液體培養(yǎng)基中的濃度為4ug/mL，然 后繼續(xù)在22°C、121rpm下培養(yǎng)，直至接種后第10d測定荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖 的含量。
5. 如權利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：根據步驟c得到優(yōu)化單因素發(fā)酵條件，然后利用響應面曲線法得到荷葉離褶傘菌絲體 富硒胞內粗多糖的最佳發(fā)酵工藝條件。
6. 如權利要求1所述的一種荷葉離褶傘菌絲體富硒胞內粗多糖的發(fā)酵工藝，其特征在 于：所述的步驟a的固體培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12P19/04GK104152511SQ201410371991
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權日:2014年7月31日
【發(fā)明者】高慧娟, 魏生龍, 席亞麗, 梁倩倩, 劉志芳, 袁承玲, 趙麗 申請人:甘肅祁連食用菌工程技術研究中心