一種與綿羊肉用性能相關(guān)的標(biāo)記物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA，其序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明利用miRNA-sep篩選出在多賽特羊和小尾寒羊肌內(nèi)脂肪組織中表達(dá)差異的miRNA，并通過了QPCR驗(yàn)證。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以通過抑制該表達(dá)差異的miRNA來實(shí)現(xiàn)改變綿羊肉用性能的目的。
【專利說明】一種與綿羊肉用性能相關(guān)的標(biāo)記物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明涉及一種與綿羊肉用性能相關(guān)的標(biāo)記物，具體 涉及一種與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA。

【背景技術(shù)】
[0002] miRNA是近年來研究發(fā)現(xiàn)的一種長20-24nt的內(nèi)源性非蛋白編碼RNA。miRNA基 因最初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有頸環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNAs。隨后pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)出核，在細(xì)胞質(zhì)中被 Dicer酶作用，加工成成熟的miRNA。通過序列互補(bǔ)與特定靶基因的mRNA結(jié)合，引起mRNA 降解或抑制mRNA翻譯從而對基因的表達(dá)起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。
[0003] 道賽特羊（Dorset)和小尾寒羊是具有不同生理特性的綿羊品種。道賽特羊體積 大、肌肉多、肌內(nèi)脂肪少，肉感差；小尾寒羊繁殖速度快、肌內(nèi)脂肪多，肉感好。在實(shí)際生產(chǎn) 中，人們常常需要大量培養(yǎng)肉感好的綿羊，因此尋找與肉感相關(guān)的基因或者調(diào)控基因表達(dá) 的miRNA成為了上述目標(biāo)實(shí)現(xiàn)的途徑。
[0004] 高通量轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-S?。┦窃谵D(zhuǎn)錄組水平上進(jìn)行深度測序的一項(xiàng)技術(shù)，測 序技術(shù)在轉(zhuǎn)錄組分析中的應(yīng)用主要集中在基因表達(dá)譜的構(gòu)建，新基因的發(fā)現(xiàn)、小分子非編 碼RNA表達(dá)譜的構(gòu)建和新小分子RNA基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)編碼基因注釋、以及如fusion transcript等轉(zhuǎn)錄組研究上。數(shù)據(jù)在最初的處理上是大體是相似的,接下來針對不同的研 究目的可以選用不同的生物信息學(xué)軟件進(jìn)行計算。
[0005] 利用大規(guī)模測序技術(shù)直接對由mRNA或小分子非編碼RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA序列進(jìn) 行測序，產(chǎn)生數(shù)以千萬計的reads數(shù)量，從而使得一段特殊的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平可以 直接通過比對到該基因組區(qū)域的reads數(shù)來衡量。該技術(shù)常用來構(gòu)建某一特定組織或細(xì)胞 的基因表達(dá)譜，通過對正常組織和異常組織進(jìn)行基因表達(dá)譜的分析，得到在兩種組織中差 異表達(dá)的基因。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的首要目的是提供一種與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA，所述miRNA是經(jīng)過 RNA-seq篩選并使用QPCR驗(yàn)證獲得的。
[0007] 本發(fā)明的第二目的是提供一種檢測與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA的試劑。
[0008] 本發(fā)明的第三目的是提供一種檢測與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的第四目的是提供上述miRNA在制備檢測與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA的 試劑盒中應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第五目的是提供上述試劑在制備檢測與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA的 試劑盒中應(yīng)用。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的實(shí)施方案如下：
[0012] 一種與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA，該miRNA的序列如SEQ ID NO :1所示。
[0013] 一種檢測與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA的試劑，所述試劑包括QPCR實(shí)驗(yàn)中使用的 反轉(zhuǎn)錄引物和/或擴(kuò)增引物，所述反轉(zhuǎn)錄引物是Oligo (dT)特異性的RT引物，優(yōu)選購自北 京信諾金達(dá)生物科技有限公司；所述擴(kuò)增引物的正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，反向 引物為通用反向引物，優(yōu)選購自北京信諾金達(dá)生物科技有限公司。
[0014] 一種檢測與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA的檢測試劑盒，該檢測試劑盒包括QPCR實(shí) 驗(yàn)中使用的反轉(zhuǎn)錄引物和/或擴(kuò)增引物，所述反轉(zhuǎn)錄引物是Oligo(dT)特異性的RT引物， 優(yōu)選購自北京信諾金達(dá)生物科技有限公司；所述擴(kuò)增引物的正向引物序列如SEQ ID NO :2 所示，反向引物為通用反向引物，優(yōu)選購自北京信諾金達(dá)生物科技有限公司。
[0015] 本發(fā)明還提供了綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA在制備檢測miRNA的試劑盒中的應(yīng) 用，該miRNA的序列如SEQ ID NO :1所示。
[0016] 本發(fā)明還提供了檢測與綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA的試劑在制備檢測miRNA的試 劑盒中的應(yīng)用，所述試劑包括QPCR實(shí)驗(yàn)中使用的反轉(zhuǎn)錄引物和/或擴(kuò)增引物，所述反轉(zhuǎn)錄 引物是Oligo(dT)特異性的RT引物，優(yōu)選購自北京信諾金達(dá)生物科技有限公司；所述擴(kuò)增 引物的正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，反向引物為通用反向引物，優(yōu)選購自北京信諾金 達(dá)生物科技有限公司。
[0017] 本發(fā)明還提供了檢測組織樣本中miRNA表達(dá)量的方法，具體的操作步驟如下：
[0018] (1)提取樣本總RNA ;
[0019] (2)將步驟（1)獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ;
[0020] (3)在熒光實(shí)時定量PCR儀上將miRNA和對照基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測；
[0021] (4)通過融解曲線和擴(kuò)增曲線分析，Λ ACT法進(jìn)行相對定量。
[0022] 步驟（1)的具體實(shí)施方法為：收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預(yù)冷 的研缽中進(jìn)行研磨，待組織樣本成粉末狀后：
[0023] ①加入Trizol,室溫保存5min ;
[0024] ②加氯仿0· 2ml，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫下放置5min-10min ;
[0025] ③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相（吸70%)到另一新離心管中，注意 不要吸到兩層水相之間的蛋白物質(zhì)。移入新管，加入等體積的_20°C預(yù)冷異丙醇，充分顛倒 混勻，置于冰上IOmin ;
[0026] ④12000rpm高速離15min后小心棄掉上清液，按lml/ml Trizol的比例加入75% DEPC乙醇洗滌沉淀（4°C保存），洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min ;
[0027] ⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉 淀；
[0028] ⑥用Nan〇dr〇p2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于_70°C。
[0029] 步驟（2)的具體實(shí)施方法為：
[0030] a.體系配制

【權(quán)利要求】
1. 一種綿羊肉用性能相關(guān)的miRNA，其特征在于，所述miRNA序列如SEQ ID NO :1所 /Jn 〇
2. -種檢測權(quán)利要求1所述的miRNA的試劑，其特征在于，所述試劑包括QPCR實(shí)驗(yàn)中 使用的反轉(zhuǎn)錄引物和/或擴(kuò)增引物；所述反轉(zhuǎn)錄引物為Oligo(dT)特異性的RT引物；所述 擴(kuò)增引物由正向引物和反向引物組成，所述正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，所述反向引 物為通用反向引物。
3. -種權(quán)利要求1所述的miRNA的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒包含權(quán)利 要求2所述的試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試劑盒還包含PCR反應(yīng)常 用的試劑和酶。
5. 權(quán)利要求1所述的miRNA在制備權(quán)利要求3或4所述的檢測試劑盒中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求2所述的試劑在制備權(quán)利要求3或4所述的檢測試劑盒中的應(yīng)用。
7. -種檢測權(quán)利要求1所述的miRNA的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 提取樣本總RNA ; (2) 將步驟（1)獲得的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ; (3) 在熒光實(shí)時定量PCR儀上將步驟⑵獲得的cDNA和對照基因進(jìn)行擴(kuò)增檢測； (4) 通過融解曲線和擴(kuò)增曲線分析，Λ ACT法進(jìn)行相對定量。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA使用的引物序列 為Olig0 (dT)特異性的RT引物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟⑶中擴(kuò)增檢測需使用擴(kuò)增引物，所 述擴(kuò)增引物的正向引物序列如SEQ ID NO :2所示，所述擴(kuò)增引物的反向引物為通用反向引 物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述對照基因?yàn)閟nRNA U6,所述對照基 因的正向引物序列如SEQ ID NO :3所示，所述對照基因的反向引物序列如SEQ ID NO :4所 /Jn 〇
【文檔編號】C12Q1/68GK104212798SQ201410480214
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】苗向陽 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所