一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，該試劑盒包括由外引物Ⅰ、外引物Ⅱ、內(nèi)引物Ⅰ和內(nèi)引物Ⅱ配制而成的檢測引物溶液；具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶；10×反應緩沖液；dNTPs溶液；陽性DNA對照樣品；陰性DNA對照樣品；顯色劑。同時本發(fā)明還公開了該試劑盒的檢測方法。本發(fā)明具有高特異性，且具有快速高效、操作簡便，檢測成本低的特點，適合現(xiàn)場快速檢測。
【專利說明】一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒及其檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒及其檢測方法。

【背景技術】
[0002]飼料安全隱患會導致食品安全問題，危害人類健康，不利于社會穩(wěn)定，與動物生產(chǎn)、環(huán)境污染和人類健康密切相關，己成為全球關注的熱點問題。近年來，受飼料原料和飼料添加劑污染的食品曝光事件不斷，隨著飼料安全問題引發(fā)的動物源性食品安全事件此起彼伏，爆發(fā)一系列危害人類健康和生命安全事件。瘋牛病就是其中危害性很大的一個，目前尚無方法治療，為了阻斷“瘋牛病”通過養(yǎng)殖生產(chǎn)環(huán)節(jié)傳播，消除使用動物源性飼料可能帶來的安全隱患，許多國家和地區(qū)相繼出臺相關飼料法規(guī)條例以規(guī)范飼料行業(yè)，禁止在反芻動物飼料中使用動物源性蛋白飼料。
[0003]我國尚未發(fā)現(xiàn)瘋牛病，但在防范瘋牛病方面也作了大量的努力和工作。1992年發(fā)布《關于禁止用反芻動物源性飼料喂反芻動物的通知》;1999年發(fā)布《關于加強對進口飼用油脂和動物性飼料經(jīng)營和使用管理的通知》；2000年發(fā)布《關于加強肉骨粉等動物性飼料產(chǎn)品管理的通知》;2001年為更好地防止瘋牛病進入我國，農(nóng)業(yè)部又相繼發(fā)布了《關于辦理動物性飼料產(chǎn)品進口登記有關問題的通知》、《關于加強瘋牛病防治工作的通知》、《關于禁止在反芻動物飼料中添加和使用動物性飼料的通知》和關于防止瘋牛病的公告；2004年10月農(nóng)業(yè)部以部令的形式頒布《動物源性飼料產(chǎn)品安全衛(wèi)生管理辦法》。
[0004]國內(nèi)外眾多學者也對動物源性飼料的檢測技術進行了大量的研究，目前主要以樣品的組織學特性和品種特異性的生物標記物，如蛋白質、DNA和其他生物大分子等為對象檢測飼料中動物源性成分。以組織學為基礎的檢測技術，存在耗時，同時要求操作者有相當?shù)膶嶋H操作經(jīng)驗來區(qū)分哺乳動物骨片。如骨粉中仍有細胞(造骨細胞和骨細胞)存在，利用顯微技術能夠區(qū)分單一
骨骼片斷，但無法區(qū)分動物來源；結果具有一定的主觀性；盡管能夠檢出微量的動物源性成分，但通常不能區(qū)分動物種類或品種；設備要求高，以電鏡作為常規(guī)分析費用太高。以蛋白質為基礎的分析方法，需要分離品種特異性的蛋白，過程比較繁瑣，同時品種接近的蛋白間能夠發(fā)生交叉反應，甚至來自其它品種的微量蛋白常常能夠掩蓋品種特異性的條帶，因此會產(chǎn)生假陽性結果。
[0005]線粒體DNA具有分子量小、拷貝數(shù)多和結構穩(wěn)定等特點，是動物性外源成分鑒定和物種分類等技術的理想靶基因。飼料中牛、羊、豬、雞、魚等動物成分的檢測主要是通過線粒體基因組特異序列來進行檢測的?，F(xiàn)有關于動物源性飼料檢測方法存在耗時和效率低等問題。
[0006]本發(fā)明從GenBank中檢索對常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚等物種已公布的線粒體全基因組序列，并進行序列比對分析發(fā)現(xiàn)一段僅存在于脊椎動物，而在細菌、古菌、真菌和綠色植物線粒體中不存在的高度保守DNA序列，用于飼料中動物源性成分的檢測。
[0007]因此，建立快速、靈敏、可靠的動物源性飼料檢測技術，對于提高飼料質量、防止飼料摻假、控制進口飼料安全和制訂相關飼料法規(guī)等均具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種快速、高效的用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒。
[0009]本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是該用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒的檢測方法。
[0010]為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，包括
一檢測引物溶液:由濃度為4飛MmoI/L的外引物1、濃度為4飛MmoI/L的外引物I1、濃度為32?48 Mfl1l/L的內(nèi)引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內(nèi)引物II配制而成；
一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ；
一1X 反應緩沖液:200 mmol/L且pH= 8.8 的Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 舌甘菜喊;
—dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
一陽性DNA對照樣品:含有脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質粒DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；
一陰性DNA對照樣品:不含脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的DNA;
一顯色劑:1000 X SYBR GREEN I熒光染料。
[0011 ] 所述脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
[0012]所述外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
[0013]所述外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
[0014]所述內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
[0015]所述內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
[0016]如上所述的一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
⑴按常規(guī)方法提取待測樣品DNA ；
⑵配制待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 μ L PCR反應管I內(nèi)加入所述待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑶配制對照樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管II內(nèi)加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應管III內(nèi)加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶IyLUO X反應緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑷分別對所述PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應；
(5) LAMP擴增結果的鑒定:在LAMP擴增產(chǎn)物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過肉眼觀察顯色結果來判斷擴增結果；當出現(xiàn)綠色，則為陽性，即判定樣品中含有動物源性成分；當出現(xiàn)橙色，則為陰性，即判定樣品中不存在動物源性成分。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點:
1、脊椎動物線粒體高度保守DNA序列僅存在于脊椎動物，而在細菌、古菌、真菌和綠色植物線粒體中則不存在，因此，本發(fā)明利用LAMP技術可快速高效(Ih內(nèi))的檢測各種來源、各種類型的植物源性飼料中是否含有動物源性成分方法。
[0018]2、飼料在加工過程中高溫、粉碎、攪拌、擠壓制粒等工藝過程對細胞核基因組往往被破壞，但線粒體DNA具有分子量小、拷貝數(shù)多和結構穩(wěn)定，因此，本發(fā)明以動物線粒體DNA為檢測靶標，利用環(huán)介導等溫擴增技術(LAMP)快速檢測動物線粒體特征DNA序列，顯著提高了檢測方法的準確性、可靠性和特異性。
[0019]3、將玉米秸桿青貯飼料、豆柏、苜蓿等各種植物源性飼料等比例混合后，分別向其中加入10% (w/w)的牛、羊、雞、鴨和魚動物的血液、內(nèi)臟、羽毛等廢棄物，并進行粉碎、攪拌、擠壓制成顆粒飼料，采用本發(fā)明試劑盒，對上述樣品進行測試，結果顯示加入牛(3)、羊
(4)、雞(5)、鴨(6)、魚(7)源性成分的樣品和陽性對照(P)反應管顯現(xiàn)綠色，2種(1、2)植物源性飼料混合樣品和陰性對照(N)顯現(xiàn)橙色，表明本發(fā)明試劑盒及檢測方法具有很好的通用性和特異性(參見I)。
[0020]4、將玉米秸桿青貯飼料、豆柏、苜蓿等各種植物源性飼料等比例混合后，分別向其中加入100%、10%、1%、0.1%、0.01%,0.001%,0.0001%和0% (w/w)的牛內(nèi)臟等廢棄物，并進行粉碎、攪拌、擠壓制成顆粒飼料，采用本發(fā)明試劑盒分別對上述顆粒飼料進行測試，結果顯示樣品中比例為100% (P)、10% (1),1% (2),0.1% (3)和0.01% (4)的反應管中均呈現(xiàn)綠色，而0.001% (5),0.0001% (6)和0% (N)的反應管中顯現(xiàn)橙色，表明本發(fā)明試劑盒及檢測方法的靈敏度可達0.01% (參見圖2)。
[0021]5、本發(fā)明不需要特殊儀器和適合現(xiàn)場快速檢測，能快速、靈敏、可靠的檢測植物源性飼料中動物源性成分，對于提高飼料質量、防止飼料摻假、控制進口飼料安全和制訂相關飼料法規(guī)等均具有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0023]圖1為本發(fā)明LAMP檢測(有顯色劑)方法的通用性和特異性實驗結果圖。
[0024]圖2為本發(fā)明LAMP靈敏度檢測結果圖。

【具體實施方式】
[0025]實施例1 一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，包括
一檢測引物溶液:由濃度為4飛Mmol/L的外引物1、濃度為4飛Mmol/L的外引物I1、濃度為32?48 Mmol/L的內(nèi)引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內(nèi)引物II配制而成；
一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ；
—1X 反應緩沖液:200 mmol/L且pH= 8.8 的Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 舌甘菜喊;
—dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成；
一陽性DNA對照樣品:含有脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質粒DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品；
一陰性DNA對照樣品:不含脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的DNA;
一顯色劑:1000 X SYBR GREEN I熒光染料。
[0026]其中:
脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
[0027]外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
[0028]外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
[0029]內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
[0030]內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
[0031]實施例2 —種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
⑴按常規(guī)方法提取待測樣品DNA ；
⑵配制待測樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管I內(nèi)加入待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、BstDNA聚合酶IyLUOX反應緩沖液2.5 μ L、dNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25μ L ；
⑶配制對照樣品的LAMP檢測反應體系:
在200 uL PCR反應管II內(nèi)加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
在200 μ L PCR反應管III內(nèi)加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到25 μ L ；
⑷分別對PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min,80°C孵育5min終止反應；
(5)LAMP擴增結果的鑒定:在LAMP擴增產(chǎn)物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過肉眼觀察顯色結果來判斷擴增結果；當出現(xiàn)綠色，則為陽性，即判定樣品中含有動物源性成分；當出現(xiàn)橙色，則為陰性，即判定樣品中不存在動物源性成分。
[0032]應該理解，這里討論的實施例和實施方案只是為了說明，對熟悉該領域的人可以提出各種改進和變化，這些改進和變化將包括在本申請的精神實質和范圍以及所附的權利要求范圍內(nèi)。
【權利要求】
1.一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，包括 一檢測引物溶液:由濃度為4飛MmoI/L的外引物1、濃度為4飛MmoI/L的外引物I1、濃度為32?48 Mfl1l/L的內(nèi)引物I和濃度為32?48Mfflol/L的內(nèi)引物II配制而成； 一具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶:濃度為7?9U/ μ L ； —1X 反應緩沖液:200 mmol/L且pH= 8.8 的Tris-HCl，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L (NH4) 2S04,40?100 mmol/L MgSO4,6?14 mol/L 舌甘菜喊; —dNTPs溶液:由濃度分別為10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種脫氧核糖核苷酸溶液等體積混合而成； 一陽性DNA對照樣品:含有脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的大腸桿菌質粒DNA，或者食品中常見的豬、牛、羊、雞、鴨和魚的總DNA樣品； 一陰性DNA對照樣品:不含脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的DNA; 一顯色劑:1000 X SYBR GREEN I熒光染料。
2.如權利要求1所述的一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，其特征在于:所述脊椎動物線粒體高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1第I位到259位所示。
3.如權利要求1所述的一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，其特征在于:所述外引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.2第I位到18位所示。
4.如權利要求1所述的一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，其特征在于:所述外引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.3第I位到18位所示。
5.如權利要求1所述的一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，其特征在于:所述內(nèi)引物I的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.4第I位到44位所示。
6.如權利要求1所述的一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒，其特征在于:所述內(nèi)引物II的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.5第I位到46位所示。
7.如權利要求1所述的一種用于飼料中動物源性成分檢測的試劑盒的檢測方法，包括以下步驟: ⑴按常規(guī)方法提取待測樣品DNA ； ⑵配制待測樣品的LAMP檢測反應體系: 在200 μ L PCR反應管I內(nèi)加入所述待測樣品DNA 2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到.25 μ L ； ⑶配制對照樣品的LAMP檢測反應體系: 在200 uL PCR反應管II內(nèi)加入陽性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到.25 μ L ； 在200 μ L PCR反應管III內(nèi)加入陰性DNA對照樣品2?5 μ L、檢測引物溶液1.5 μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10X反應緩沖液2.SyUdNTPs溶液3 μ L，用滅菌去離子水補齊到.25 μ L ； ⑷分別對所述PCR反應管1、PCR反應管I1、PCR反應管III進行LAMP擴增反應:6(T65°C孵育2(T60min，8(TC孵育5min終止反應； (5)LAMP擴增結果的鑒定:在LAMP擴增產(chǎn)物中加入廣2 μ?顯色劑，混勻，通過肉眼觀察顯色結果來判斷擴增結果；當出現(xiàn)綠色，則為陽性，即判定樣品中含有動物源性成分；當出現(xiàn)橙色，則為陰性，即判定樣品中不存在動物源性成分。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328195SQ201410637173
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月13日 優(yōu)先權日:2014年11月13日
【發(fā)明者】臧榮鑫, 徐紅偉 申請人:西北民族大學