專利名稱：全人源抗cd33單鏈抗體zjl101及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程，涉及全人源抗⑶33單鏈抗體的篩選、鑒定和原核表達(dá)，及其在CD33陽(yáng)性白血病靶向藥物制備中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
噬菌體展示抗體技術(shù)可以制備全人源的抗體，是將蛋白分子或肽段的基因克隆到絲狀噬菌體的基因組DNA中，與噬菌體的外殼蛋白形成融合蛋白，從而使異源分子展示于噬菌體表面。主要特點(diǎn)是將特定的分子的基因型和表達(dá)型同時(shí)出現(xiàn)在一個(gè)噬菌體顆粒內(nèi)，通過(guò)DNA測(cè)序可以獲得特定展示蛋白的序列信息。噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)模擬了人類B細(xì)胞的分化成熟過(guò)程，首先通過(guò)分子生物學(xué)手段將人類抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因連接起來(lái)形成單鏈抗體(Single-chain variablefragment, scFv),插入曬菌體載體上,使單鏈抗體scFv展示在卩遼菌體表面,再用特定的抗原篩選出特異性的噬菌體抗體，并用大腸桿菌表達(dá)可以表達(dá)大量單鏈抗體。卩遼菌體可以表達(dá)抗體結(jié)合片段(Fragmentantigen binding, Fab)、單鏈抗體(scFv)、雙鏈抗體(Diabody)和雙特異性抗體(Bispecific scFv, BsAb)等。其中單鏈抗體(scFv)是目前報(bào)道最多的一種小分子抗體，是由抗體識(shí)別抗原的可變區(qū)Fv段組成。Fv由重鏈可變區(qū)Vh和輕鏈可變區(qū)VL通過(guò)連接肽(Iinker)連接構(gòu)成scFv。所加的linker很重要，必須不影響Fv的構(gòu)象，目前最常用的是由四個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸組成的重復(fù)3次的序列(ggggs)3。將scFv基因克隆在絲狀噬菌體載體pin基因先導(dǎo)序列和pin基因之間，以融合蛋白的形式被導(dǎo)入細(xì)菌膜間隙，并組裝成scFv，在加入輔助噬菌體M13K07后，scFv以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體表面。PCANTAB-5E載體的特點(diǎn)是，在scFv基因后面含有一段編碼Tag尾肽(E-Tag)的序列,在E-Tag后面有一個(gè)琥拍(Amber)終止密碼,位于scFv基因與PlII基因之間，在抑制性細(xì)菌TGl中，這種琥珀密碼子只有20%有效，所以在蛋白翻譯過(guò)程中可以被通讀而形成scFv-pIII融合蛋白；而在非抑制性菌株中，如HB2151，此終止子被識(shí)別，同時(shí)scFv基因在pill基因前終止，形成獨(dú)立的抗體蛋白，滯留于細(xì)胞膜間隙，并在 長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后釋放于培養(yǎng)液中，形成可溶性表達(dá)。另外，用分子克隆的方法，也可以將scFv基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入pET表達(dá)體系，并在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)聞表達(dá)而獲得單鏈抗體。單鏈抗體具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相對(duì)分子量小、穿透性強(qiáng)、免疫源性低等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的載體。構(gòu)建全人源抗體庫(kù)目的是尋找一種能與特定白血病相關(guān)抗原(如CD33等)特異性結(jié)合的單鏈抗體scFv，這類特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞的單鏈抗體本身或者經(jīng)過(guò)基因工程改造成其它的抗體形式后，可以作為抗腫瘤藥物進(jìn)行開(kāi)發(fā)；其次可以作為藥物載體，如偶聯(lián)藥物、毒素或放射性同位素，進(jìn)行白血病的靶向治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種全人源抗CD33單鏈抗體Z幾101，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、相對(duì)分子量小、穿透性強(qiáng)、免疫源性低等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的藥物運(yùn)輸載體。SEQ ID NO I是該單鏈抗體的DNA序列
atggcccagg tccagcttgt gcagtctggg actgtagtga agaagcctgg gtcctcggtgaaggtctcct gcaagacttc tggaggcacc ctccccaacc atgccatcaa ctgggtgcgacaggcctctg gacaagggct tgagtggatg ggatggatga gccctaacac tggtgacacaggctatgcac ggaagttcca gggcagagtc accatgacca gggacacctc cataagcacagcctacatgg aactgagcag cctgagatct gacgacacgg ccatatatta ctgtgcgacgggcgaccccc gggttggtca ttcgtggggc cagggcaccc tggtcactgt ctcctcaggtggtggtggtt ctggcggcgg cggctccggt ggtggtggat ctgacatcca gatgacccagtctccaccct ccctgtctgc atctgtagga gacagagtca ccatcacttg ccgggcaagtcaaaccattg gcagtcattt aaattggtat cagcagaaac cagggaaagc ccctaaactcctgatctatg gtgcatccag tttgcaaagt ggggtccccg caaggttcac tggcagtggatttgggacag atttcactct caccatcagc agtctacaag ttgaagactt ggcaacttactcctgtcaac agacttacaa taccccccgg acgttcggcc aagggaccaa ggtggaaatc
總長(zhǎng)度為723 bp ；
SEQ ID NO 2是該單鏈抗體的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Val Val Lys Lys Pro Gly Ser SerVal Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Leu Pro Asn His Ala He Asn Trp ValArg Gln Ala Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Pro Asn Thr Gly AspThr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser He SerThr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys AlaThr Gly Asp Pro Arg Val Gly His Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser SerGly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp He Gln Met ThrGln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg AlaSer Gln Thr He Gly Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro LysLeu Leu He Thr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly SerGly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Val Glu Asp Leu Ala ThrTyr Ser Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val GluHe Lys
其分子量為25212，含有完整的抗體重鏈可變區(qū)Vh和輕鏈可變區(qū)\，中間連接肽為(Gly Gly Gly Gly Ser)3 ;
所述單鏈抗體的重鏈可變區(qū)(Vh)具有SEQ ID NO 3的的氨基酸序列
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Val Val Lys Lys Pro Gly Ser SerVal Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Thr Leu Pro Asn His Ala He Asn Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Met Ser Pro Asn Thr Gly AspThr Gly Tyr Ala Arg Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser He SerThr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys AlaThr Gly Asp Pro Arg Val Gly His Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser含119個(gè)氨基酸，其分子量為12764;所述單鏈抗體的輕鏈可變區(qū)(VJ具有SEQ ID NO 4的的氨基酸序列
Asp He Gln Met Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg ValThr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr He Gly Ser His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln LysPro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He Thr Gly Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val ProAla Arg Phe Thr Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu GlnVal Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Ser Cys Gln Gln Thr Tyr Asn Thr Pro Arg Thr Phe GlyGln Gly Thr Lys Val Glu He Lys
含107個(gè)氨基酸，其分子量為11519。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供全人源抗⑶33單鏈抗體ZJLlOl在制備白血病靶向藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的單鏈抗體ZJLlOl可以對(duì)CD33陽(yáng)性的白血病細(xì)胞，如髓系白血病HL-60和Kasumi-I細(xì)胞，產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制作用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(I)提供的全人源單鏈抗體ZJLlOl結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，是抗體重鏈可變EVh和輕鏈可變區(qū)'由連接肽(GGGGS)3連接而成，MW為25.212 kD，且含有完整抗原結(jié)合部位；(2)本發(fā)明的單鏈抗體ZJLlOl可以對(duì)⑶33陽(yáng)性的白血病細(xì)胞，如髓系白血病HL-60和Kasumi-I細(xì)胞，產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制作用；(3)本發(fā)明的單鏈抗體ZJLlOl分子量小、穿透性強(qiáng)、免疫源性低，可作為藥物或藥物載體運(yùn)輸藥物、同位素或毒素分子，可以治療CD33陽(yáng)性的白血病。


圖I是ELISA檢測(cè)噬菌體單鏈抗體的結(jié)合活性。圖2 A是噬菌體單鏈抗體ZJLlOl結(jié)構(gòu)Vh片段序列分析圖。圖2 B是噬菌體單鏈抗體ZJLlOl結(jié)構(gòu)\片段序列分析圖。圖3是陽(yáng)性噬菌體(展示單鏈抗體ZJLlOl)對(duì)白血病細(xì)胞株的特異抑制作用。圖4是用SDS-PAGE電泳分析單鏈抗體ZJLlOl在大腸桿菌HB2151中的表達(dá)。圖5是大腸桿菌HB2151中表達(dá)的單鏈抗體ZJLlOl的Western Blot分析圖。圖6是用SDS-PAGE電泳分析單鏈抗體ZJLlOl在大腸桿菌BL21中的表達(dá)和純化過(guò)程。圖7是單鏈抗體ZJLlOl對(duì)白血病細(xì)胞的特異抑制作用測(cè)定。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合以下實(shí)施例及附圖作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例I :噬菌體抗體庫(kù)的篩選
實(shí)驗(yàn)方法使用基因重組表達(dá)的⑶33胞外區(qū)(⑶33-E⑶)抗原篩選全人源白血病抗體庫(kù)。用Na2C03/NaHC03將抗原稀釋后，加入96孔ELISA板，4°C包被過(guò)夜。次日，封閉液封閉I h，加入噬菌體抗體庫(kù)，37°C孵育2 h。TBS洗滌(第一輪5遍，第二輪10遍，第三、四輪10遍)。用甘氨酸-鹽酸(pH 2. 2)洗脫并收集噬菌體，Tris-HCl中和至pH 7.0，侵染對(duì)數(shù)期厶 coli TG1，37°C靜置 20 min，取 10 mL 測(cè)滴度。其余轉(zhuǎn)至 20 mL 2XYT-A-G，37°C振搖培養(yǎng)至OD6tltlnm達(dá)到0. 5，然后加入輔助噬菌體，37°C振搖I h，離心，沉淀重懸于200 mL2 X YT-AK, 30°C振搖過(guò)夜，次日，收集噬菌體。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果噬菌體抗體庫(kù)經(jīng)四輪篩選后，得到105倍的富集，見(jiàn)表I。
權(quán)利要求
1.一種全人源抗⑶33單鏈抗體ZJLlOl，SEQ ID NO I是該單鏈抗體的DNA序列，SEQID NO 2是該單鏈抗體的氨基酸序列，該單鏈抗體的分子量為25212，含有完整的抗體重鏈可變區(qū)Vh和輕鏈可變區(qū)'，中間連接肽為(Gly Gly Gly Gly Ser )3，其重鏈可變區(qū)Vh的氨基酸序列為SEQ ID NO 3，含119個(gè)氨基酸，其分子量為12764，輕鏈可變區(qū)'的氨基酸序列為SEQ ID NO 4，含107個(gè)氨基酸，其分子量為11519。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種全人源抗CD33單鏈抗體ZJLlOl在制備白血病靶向藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種全人源抗CD33單鏈抗體ZJL101。通過(guò)噬菌體展示技術(shù)，以人CD33-ECD蛋白做為靶抗原從高容量的全人源白血病噬菌體抗體庫(kù)中經(jīng)多輪篩選，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出單鏈抗體ZJL101，并經(jīng)過(guò)Ni柱親和純化而獲得。本發(fā)明獲得的全人源抗CD33單鏈抗體ZJL101能夠特異抑制CD33陽(yáng)性的白血病細(xì)胞株HL-60和Kasumi-1的生長(zhǎng)，該單鏈抗體本身及其可變區(qū)序列經(jīng)過(guò)基因工程改造成其它的抗體形式后，可作為治療藥物或藥物運(yùn)載體用于CD33陽(yáng)性的白血病的靶向治療。該單鏈抗體具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、免疫源性低、特異性強(qiáng)、相對(duì)分子量小、穿透性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的靶向藥物和藥物運(yùn)載體。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102952191SQ20121034374
公開(kāi)日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月17日
發(fā)明者詹金彪, 范娜娜, 張珍珍, 林莉, 丁倩, 湯沁, 代爭(zhēng) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)