本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，特別涉及一種lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒制備方法及納米粒和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、近年來(lái)，惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類健康。其中女性乳腺癌更是取代肺癌成為了全球發(fā)病率第一的惡性腫瘤。

2、乳腺癌的腫瘤免疫治療能夠通過(guò)激活和強(qiáng)化患者自身的免疫系統(tǒng)，從而達(dá)到控制和清除腫瘤的目的?，F(xiàn)階段，腫瘤免疫治療的手段主要包括免疫檢查點(diǎn)抑制劑、嵌合抗原受體t細(xì)胞免疫療法以及腫瘤疫苗等。雖然部分患者能夠通過(guò)免疫治療延長(zhǎng)一定的生存期，但是臨床數(shù)據(jù)顯示，免疫治療的應(yīng)答率較低，受益患者仍然十分有限。

3、聲動(dòng)力治療是一種超聲觸發(fā)的，能夠?qū)⒊暷芰烤劢褂谔囟▍^(qū)域，利用超聲生物效應(yīng)治療腫瘤的無(wú)創(chuàng)性治療方法。盡管聲動(dòng)力治療在抗腫瘤研究方面取得了顯著成果，但在實(shí)現(xiàn)更進(jìn)一步的臨床應(yīng)用前，仍面臨著一定的挑戰(zhàn)。一方面腫瘤原本的缺氧微環(huán)境會(huì)限制依賴氧氣的聲動(dòng)力治療效果，另一方面聲動(dòng)力治療作為局部的腫瘤治療方式，雖然能夠一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但是很難抑制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

4、雖然腫瘤治療方法多種多樣且取得了一定的治療效果，但是由于腫瘤進(jìn)展中復(fù)雜多變的腫瘤微環(huán)境，單一模式下的腫瘤治療很難取得滿意的效果。因此如何將聲動(dòng)力治療和腫瘤免疫治療相結(jié)合，以達(dá)到改善免疫抑制微環(huán)境，激活機(jī)體免疫效應(yīng)，維持腫瘤-免疫循環(huán)，高效的抑制腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的目的，是目前治療乳腺癌的重要研究方向。

5、腫瘤微環(huán)境(tumor?microenvironment，tme)是指腫瘤細(xì)胞所處的內(nèi)部環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)組成，是促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的“土壤”。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor?associated?macrophages，tams)是實(shí)體腫瘤微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞，在某些實(shí)體腫瘤中可以達(dá)到50％。tams主要包括經(jīng)典活化的m1型巨噬細(xì)胞和替代活化的m2型巨噬細(xì)胞。病理學(xué)研究顯示，腫瘤組織內(nèi)m2型tmas的浸潤(rùn)密度與患者的預(yù)后顯著相關(guān)，m2型tams浸潤(rùn)密度高的患者生存率降低，且發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的幾率明顯增加。

6、可以看出在現(xiàn)有技術(shù)中乳腺癌的治療方法效果不佳，單一模式下的腫瘤治療，不能克服腫瘤微環(huán)境的影響。因此研發(fā)一種lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒，用于清除m2型巨噬細(xì)胞，改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為克服現(xiàn)有技術(shù)中單一的乳腺癌治療方法效果不佳、無(wú)法克服腫瘤微環(huán)境的影響的缺點(diǎn)，本發(fā)明提出一種lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒及其制備方法和應(yīng)用，其詳細(xì)技術(shù)方案如下：

2、一種lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法，包括以下步驟：s1，獲取dspe-peg2k-mannose；s2，將二棕櫚酰磷脂酰膽堿、dspe-peg2k-mannose、膽固醇和血卟啉單甲醚溶于三氯甲烷中，并通過(guò)搖晃和超聲清洗機(jī)進(jìn)行溶解，獲得溶液；s3，對(duì)s2中的溶液進(jìn)行加熱，使得溶液出現(xiàn)均勻薄膜，獲得薄膜溶液；s4，對(duì)s3中的薄膜溶液進(jìn)行冰浴，并在冰浴過(guò)程中向薄膜溶液中加入全氟戊烷后進(jìn)行聲振；獲得聲振后的薄膜溶液；s5，對(duì)所述聲振后的薄膜溶液進(jìn)行離心洗滌，去除上清，獲得沉淀；s6，在磷酸鹽緩沖液或雙蒸水中加入所述沉淀和dspe-peg2k-mannose，獲得lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒。

3、進(jìn)一步地，在s1中,將甘露糖殘基連接到dspe-peg2k形成dspe-peg2k-mannose，并分析提純,獲得提純后的dspe-peg2k-mannose；

4、進(jìn)一步地，在s2中，分別稱取5mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿，3mg?dspe-peg2k-mannose，2mg膽固醇，2mg血卟啉單甲醚后放入圓底燒瓶；向s2中的圓底燒瓶?jī)?nèi)加入10ml三氯甲烷，并通過(guò)搖晃和超聲清洗機(jī)使得圓底燒瓶?jī)?nèi)的物質(zhì)充分溶解。

5、進(jìn)一步地，使用旋蒸儀對(duì)圓底燒瓶進(jìn)行加熱，使得圓底燒瓶?jī)?nèi)形成均勻的薄膜；然后通過(guò)移液槍向圓底燒瓶?jī)?nèi)加入5ml?pbs或雙蒸水，形成薄膜溶液，利用超聲清洗機(jī)將薄膜洗脫，并將薄膜溶液移至15ml離心管內(nèi)。

6、進(jìn)一步地，在s3中，在真空負(fù)壓條件下，旋蒸儀控制在50℃進(jìn)行加熱一小時(shí)。

7、進(jìn)一步地，在s4中，將帶有薄膜溶液的離心管放入到冰水中進(jìn)行冰浴，用200μl的移液槍向管內(nèi)加入200μl的全氟戊烷，并用用聲振儀進(jìn)行聲振；所述聲振儀以100w的功率按開(kāi)啟5s,關(guān)閉5s的頻率振動(dòng)5min。

8、進(jìn)一步地，在s5中,將s4中的溶液用低溫離心機(jī)進(jìn)行離心洗滌兩次，每次離心后去除上清、留取沉淀，然后用5ml?pbs或雙蒸水重懸沉淀并放置4℃冰箱低溫保存；低溫離心機(jī)在4℃下，以8000rpm的速率工作5min。

9、一種相變納米粒，其特征在于，由上述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法制備。

10、一種lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒在制備抗腫瘤系統(tǒng)中的應(yīng)用，其特征在于，包括上述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒和低強(qiáng)度聚焦超聲設(shè)備；所述低強(qiáng)度聚焦超聲設(shè)備對(duì)相變納米粒進(jìn)行低強(qiáng)度聚焦超聲輻照，以使得所述相變納米粒內(nèi)核的液體氟碳發(fā)生液氣相變，并使得血卟啉單甲醚吸收超聲能量后產(chǎn)生大量單線態(tài)活性氧，利用液氣相變空化效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)械損傷和活性氧共同消除m2型巨噬細(xì)胞。

11、進(jìn)一步地，還包括pd-l1抗體；建立balb/c小鼠單側(cè)原位乳腺癌模型；對(duì)荷瘤小鼠每間隔3天注射一次相變納米粒，并于24小時(shí)后給予lifu輻照，并在第4、8、12天注射pd-l1抗體。

12、本發(fā)明的有益效果是：提供一種lifu響應(yīng)型相變納米粒的制備方法，通過(guò)提純、稱量、溶解、旋蒸、水化、洗滌等步驟制備相變納米粒。相變納米粒的內(nèi)核中有氟碳化合物，雙分子層之間有血卟啉單甲醚。利用低強(qiáng)度聚焦超聲輻照，可使得所述相變納米粒內(nèi)核的液體氟碳發(fā)生液氣相變，并使得血卟啉單甲醚吸收超聲能量后產(chǎn)生大量單線態(tài)活性氧，利用液氣相變空化效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)械損傷和活性氧共同消除m2型巨噬細(xì)胞，促進(jìn)tams從m2表型向m1表型轉(zhuǎn)化，改善免疫抑制微環(huán)境，為pd-l1免疫治療充分發(fā)揮效果提供合適的“土壤”，以此達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的目的，為乳腺癌的可視化治療提供一種新的治療策略。

13、同時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，mph@lip有良好的相變性能，在體內(nèi)外具有明顯增強(qiáng)超聲成像、光聲成像的效果。在體外能夠殺傷m2型巨噬細(xì)胞，在體內(nèi)聯(lián)合lifu后能夠明顯增強(qiáng)乳腺癌pd-l1免疫治療的效果，從而有效地抑制乳腺癌腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。

技術(shù)特征：

1.一種lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法，其特征在于，在s1中,將甘露糖殘基連接到dspe-peg2k形成dspe-peg2k-mannose，并分析提純,獲得提純后的dspe-peg2k-mannose。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法，其特征在于，在s2中，分別稱取5mg二棕櫚酰磷脂酰膽堿，3mg?dspe-peg2k-mannose，2mg膽固醇，2mg血卟啉單甲醚后放入圓底燒瓶；向s2中的圓底燒瓶?jī)?nèi)加入10ml三氯甲烷，并通過(guò)搖晃和超聲清洗機(jī)使得圓底燒瓶?jī)?nèi)的物質(zhì)充分溶解。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法，其特征在于，使用旋蒸儀對(duì)圓底燒瓶進(jìn)行加熱，使得圓底燒瓶?jī)?nèi)形成均勻的薄膜；然后通過(guò)移液槍向圓底燒瓶?jī)?nèi)加入5mlpbs或雙蒸水，形成薄膜溶液，利用超聲清洗機(jī)將薄膜洗脫，并將薄膜溶液移至15ml離心管內(nèi)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法，其特征在于，在s3中，在真空負(fù)壓條件下，旋蒸儀控制在50℃進(jìn)行加熱一小時(shí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法，其特征在于，在s4中，將帶有薄膜溶液的離心管放入到冰水中進(jìn)行冰浴，用200μl的移液槍向管內(nèi)加入200μl的全氟戊烷，并用用聲振儀進(jìn)行聲振；所述聲振儀以100w的功率按開(kāi)啟5s,關(guān)閉5s的頻率振動(dòng)5min。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法，其特征在于，在s5中,將s4中的溶液用低溫離心機(jī)進(jìn)行離心洗滌兩次，每次離心后去除上清、留取沉淀，然后用5ml?pbs或雙蒸水重懸沉淀并放置4℃冰箱低溫保存；低溫離心機(jī)在4℃下，以8000rpm的速率工作5min。

8.一種相變納米粒，其特征在于，由權(quán)利要求1—7任意一項(xiàng)所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法制備。

9.一種lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒在制備抗腫瘤系統(tǒng)中的應(yīng)用，其特征在于，包括權(quán)利要求8所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒和低強(qiáng)度聚焦超聲設(shè)備；所述低強(qiáng)度聚焦超聲設(shè)備對(duì)相變納米粒進(jìn)行低強(qiáng)度聚焦超聲輻照，以使得所述相變納米粒內(nèi)核的液體氟碳發(fā)生液氣相變，并使得血卟啉單甲醚吸收超聲能量后產(chǎn)生大量單線態(tài)活性氧，利用液氣相變空化效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)械損傷和活性氧共同消除m2型巨噬細(xì)胞。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的lifu響應(yīng)型m2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒在制備抗腫瘤系統(tǒng)中的應(yīng)用，其特征在于，還包括pd-l1抗體；建立balb/c小鼠單側(cè)原位乳腺癌模型；對(duì)荷瘤小鼠每間隔3天注射一次相變納米粒，并于24小時(shí)后給予lifu輻照，并在第4、8、12天注射pd-l1抗體。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開(kāi)了一種LIFU響應(yīng)型M2型巨噬細(xì)胞靶向的相變納米粒的制備方法及納米粒和應(yīng)用，包括以下步驟：S1，獲取DSPE?PEG2K?Mannose；S2，將二棕櫚酰磷脂酰膽堿、DSPE?PEG2K?Mannose、膽固醇和血卟啉單甲醚溶于三氯甲烷中，并通過(guò)搖晃和超聲清洗機(jī)進(jìn)行溶解，獲得溶液；S3，對(duì)S2中的溶液進(jìn)行加熱，使得溶液出現(xiàn)均勻薄膜，獲得薄膜溶液。其有益效果是：提供一種LIFU響應(yīng)型相變納米粒的制備方法，通過(guò)提純、稱量、溶解、旋蒸、水化、洗滌等步驟制備相變納米粒?？赏ㄟ^(guò)低強(qiáng)度聚焦超聲輻照，可使得所述相變納米粒內(nèi)核的液體氟碳發(fā)生液氣相變，并使得血卟啉單甲醚吸收超聲能量后產(chǎn)生大量單線態(tài)活性氧，利用液氣相變空化效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)械損傷和活性氧共同消除M2型巨噬細(xì)胞。

技術(shù)研發(fā)人員：張琴,任正舉,張艷萍,楊華,秦僑習(xí),楊薈平
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶市中醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21