專利名稱:雞蛋清殼素的分離方法
本發(fā)明涉及雞蛋清殼素的分離，含有殼素(Cystatin)的抗病毒劑及其作為病毒蛋白質(zhì)水解過程抑制劑的應用。
已知生物組織含有蛋白(水解)酶以及相應的抑制劑，它們參與生物體在機體正常及致病的情況下的各種生物功能的控制和調(diào)節(jié)過程。因此各種動物病毒的蛋白(水解)酶，例如細小RNA(核糖核酸)病毒，在病毒的復制中起著重要的作用。病毒蛋白酶將前體蛋白分解成較小的產(chǎn)物，并將分解產(chǎn)物裝配成更大、更復雜的病毒結(jié)構(J.Putnak and B.Phillips，Microb.Rev.45，287(1982))。因此，蛋白酶抑制劑也表現(xiàn)為潛在的治療物。
已知細小RNA病毒蛋白酶對巰基蛋白酶抑制劑非常敏感，例如汞制劑，碘乙酸鹽，α2-巨球蛋白及其它(B.D.Korant，K.Lonberg-Holm and P.Lacolla，inTargets for the design of antiviral agents，E.De Clercg and R.T.Walker，eds.，Plenum Press，pp.61-98，1984)。巰基蛋白酶的一種特異抑制劑也是低Mr蛋白雞殼素，它是從蛋清中分離出來的(A.Anastasi，M.A.Brown，A.A.Kembhavi，M.J.H.Nicklin，C.A.Sayers，D.C.Sunter and A.J.Barrett，Biochem.J.211，129-138，1983;V.Turk，et al.，Hoppe-Seyler′S Z.Physioi.Chem.364，1487-1496，1983)。雞殼素以兩種形式被分離出來，其等電點不同，PI5.6和6.5。其氨基酸序列已經(jīng)確定(V.Turk et al.，Biochem.J.214，813-817，1984)。已發(fā)現(xiàn)雞卵殼素為植物蛋白酶木瓜蛋白酶和哺乳動物蛋白酶組織蛋白酶B.H和L的有效抑制劑(A.Anastasi et al.，Biochem.J.211，129-138.1983)。
雖然已經(jīng)公開的方法業(yè)已給出了純的產(chǎn)物，但產(chǎn)率相當?shù)汀?br>因此，作為本發(fā)明的首要方面，我們提出了一種新的，從天然來源的雞蛋清中分離雞殼素的方法。將雞蛋清水溶液加熱至最高80℃(60-70℃間任意溫度)沉淀非活性蛋白質(zhì)。溶液隨后冷卻并離心。往上清液中加入lM Nacl并在羧甲基(Cm)木瓜蛋白酶-Sepharose 4B上在PH8.0，1.0M Nacl存在的情況下用0.01M Tris緩沖液進行親和層析。抑制劑殼素用0.01M PH11.5 NaoH洗脫，超濾或冷凍干燥濃縮，并在0.01M Tris緩沖液PH8.0的條件下于Sephadex G50上分離。收集抑制活性成份，超濾濃縮，在單Q柱上(Pharmacia Sweden)以起始緩沖液為0.01M PH8.0 Tris的快速蛋白液相層析(FPLC)的方法分離，往起始緩沖液中加入0.5M Nacl洗脫出雞殼素抑制劑。該抑制劑被洗脫出兩個抑制峰，PI值為5.6和6.5，用等電聚焦法測定。
本發(fā)明應用的所有化學制劑都是商業(yè)上已知并可買到的。本發(fā)明分離雞殼素的方法技術上簡單而且比到目前為止所描述過的方法得到的產(chǎn)率更高。
在我們的試驗中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)雞蛋清殼素抑制細小RNA病毒的水解蛋白活性。細小RNA病毒包括脊髓灰質(zhì)炎病毒，鼻病毒及A型肝炎的致病因子與口足病病原。
雞蛋清殼素的抑制活性可被列于表中的結(jié)果所證實。因此本發(fā)明的下一個目的就是雞蛋清殼素在治療細小RNA病毒侵染的哺乳動物和鳥類，以及其它所有的由相應病毒感染的生物體上的應用。
本發(fā)明的另一目的是含有生理上可接受劑量，并對細小RNA病毒水解蛋白活性的抑制有效的雞蛋清殼素的抗病毒劑。這些抗病毒劑的配制和應用在本專業(yè)領域技術人員的知識和經(jīng)驗的范圍之內(nèi)。
應該指出的是，雖然在本申請當中只討論了根據(jù)本發(fā)明方法制備的雞蛋清殼素，但我們還提出了用遺傳工程方法制取的雞殼素的應用。
本發(fā)明用下述實例進行說明，但不局限于此。
雞蛋清殼素的分離實施例1100個雞蛋的蛋清用等體積蒸餾水稀釋，用韋林氏攪切器勻漿。溶液在水浴中于60℃下加熱，十五分鐘后在冷水浴中冷卻。沉淀物在Sorvall RC-2B凍凍離心機上以15000×g離心30分鐘，往上清液中加入Nacl(結(jié)晶)至1M。溶液隨之分成五等份，加到在一玻璃燒杯中預備好的CM-木瓜蛋白酶Sepharose 4B柱上(按照Anastasi.A.et al.，Biochem.J.211，129-138，1983制備)，用含有1M Nacl的0.01M PH8.0 Tris緩沖液洗，隨后用0.01M PH11.5NaoH洗脫雞殼素。所得組份在Amicon YM-5薄膜上超濾濃縮至原體積的1/5，然后加到用含有1M Nacl的0.01M PH8.0 Tris緩沖液平衡過的SephaderG50柱上。收集洗脫下來的含有抑制活性的蛋白組份，在Amicon YM-5超濾膜上濃縮至50ml，然后用0.01M PH8.0 Tris為起始緩沖液，隨之加入0.5M Nacl形成梯度于10ml快速蛋白液相層析單Q柱上層析分離洗脫之。抑制劑被洗脫出兩個PI值為5.6和6.5的峰?？偖a(chǎn)率相當于蛋清中雞蛋殼素起始含量的32%。
雞殼素抑制活性以木瓜蛋白酶為試驗酶用苯甲酰-外消旋-精氨酸-2-萘酰胺(Bz-Arg Nap)為底物按已知方法(A.J.Barrett，Anal.Biochem.37，280-293，1972)測定。1單位抑制活性相當于1μg木瓜蛋白酶完全抑制。
實施例2100個蛋的蛋清用等體積蒸餾水稀釋，用韋林氏攪切器勻漿。溶液于水浴中加熱至80℃，15分鐘后在水浴中冷卻。以下試驗程序與實施例1所述相同。產(chǎn)率約為27%，比實施例1稍低一些。
生物活性試驗在人HeLa細胞中應用雞蛋清殼素抑制病毒復制本試驗用人HeLa細胞O系(B.korant et al，Vivology，48，71-86，1972)或人WISH細胞(Americal Type Culture Colletion CCL25)進行。
細胞單層培養(yǎng)在如前所述(B.korant et al，Virology48，71-86，1972)的塑料北特利平皿中的加有10%小牛血清的Mc Coy5A培養(yǎng)基中。試驗中用的病毒是Mahony品系的脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒和(在復制過程中不需要大量蛋白分解的棒狀病毒品種)皰疹口炎病毒。
病毒培養(yǎng)及感染滴定按標準方法進行(B.Korant etal，Virology 48，71-86 1972)。病毒感染或?qū)φ占毎臉擞浲ㄟ^往無蛋氨酸培養(yǎng)基中加入35S-L-Metionina(1200Ci/mmole)至50μCi/ml的比活性而完成。標記蛋白的分析在含有上述(B.Korant et al，Proc Natl.Acad.Sci.USA，76，2992-2995，1979)十二烷基磺酸鈉(SDS)的聚丙烯酰胺平板凝膠中進行。染色、干燥的凝膠用Dupont Cronex 4X-光膠片自動曝光照相。
結(jié)果列于下表。
表用雞蛋清殼素(100μM)處理的人HeLa細胞中脊髓灰質(zhì)炎病毒復制的抑制病毒 抑制%脊髓灰質(zhì)炎Ⅰ型病毒(Mahony) 80%+/-5%1A型鼻病毒 73%+/-8%皰疹口炎病毒 7%+/-4%表中所得結(jié)果證明，雞蛋清殼素明顯地顯示出抑制脊髓灰質(zhì)炎病毒和鼻病毒復制的抗病毒作用。
權利要求
1.一種分離雞蛋清殼素的方法，其特征在于將雞蛋清水溶液加熱至(最高)溫度為80℃，在瓊脂糖上色譜分離，隨后在葡聚糖凝膠分子篩上色譜分離，并在最后一步用快速蛋白液相層析型離子交換色譜法純化。
2.根據(jù)權利要求
1所述的方法，其中所述的瓊脂糖優(yōu)先選用羧甲基木瓜蛋白酶-瓊脂糖4B。
3.根據(jù)權利要求
1所述的方法，其中所述的葡聚糖凝膠優(yōu)先選用葡聚糖凝膠-G-50。
專利摘要
本文提出了一種從雞蛋清水溶液中分離雞蛋清殼素的新方法，通過將其加熱至最高80℃，在羧甲基木瓜蛋白酶-Sepharose4B上層析，在Sephadex G-50上分離，用快速蛋白液相層析型的離子交換層析法純化。進一步揭示了新制劑及應用雞蛋清殼素治療生物體病毒感染的方法，特別是哺乳動物和鳥類細小RNA病毒感染的療法。
文檔編號B01D15/00GK86100617SQ86100617
公開日1986年11月12日 申請日期1986年1月16日
發(fā)明者維托·吐克, 佐茨·布辛 申請人:克爾克制藥廠有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan