一種海馬胰蛋白酶酶解液及其作為抗氧化劑的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種蛋白酶酶解液，以及該種酶解液作為抗氧化劑的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海馬在全世界共有20多種，多數(shù)生活在近海，水藻和海草茂盛、風(fēng)浪不使很大大 的海域。我國(guó)海馬資源豐富，東南沿海均產(chǎn)海馬，以南海較多。另外，海馬作為一種著名中 藥，在很多地方藥房均有銷售，為海馬的研宄提供了可能。
[0003] 海馬有很多對(duì)人類有益的功能，如溫腎壯陽、緩解前列腺增生、耐缺氧、抗氧化、抗 疲勞、延緩衰老、抗腫瘤等，所以是珍貴的海洋生物資源，具有很重要的研宄和開發(fā)價(jià)值。根 據(jù)已有報(bào)道，目前科研人員對(duì)海馬組分的研宄主要集中在氨基酸、微量元素、留體類和磷脂 等化學(xué)成分，但對(duì)海馬蛋白質(zhì)及酶解液的研宄報(bào)道非常少。
[0004] 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研宄表明，過量的自由基會(huì)在有機(jī)體中引起一系列生物學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致組 織細(xì)胞、亞細(xì)胞核分子結(jié)構(gòu)的破壞，并隨著破壞層次逐漸擴(kuò)展造成功能損傷，引起心血管疾 病、癌癥和衰老等，它是構(gòu)成很多疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。因此抗氧化劑的研宄對(duì)有效預(yù)防和治 療某些疾病十分重要。而人工合成的抗氧化劑往往具有一定的毒副作用，使得它們?cè)缡褂?時(shí)受到嚴(yán)格的控制。而天然抗氧化劑副作用小，安全性高，有利于產(chǎn)品的進(jìn)一步應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，提出一種成本低廉、獲得容易的 海馬胰蛋白酶酶解液，以及該種海馬胰蛋白酶酶解液作為抗氧化劑的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：一種海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬 胰蛋白酶酶解液按照以下步驟制備獲得： 將質(zhì)量比為100:5的海馬粉末和胰蛋白酶置于燒杯中，并向燒杯中加入pH=8.0的PBS 緩沖溶液獲得混合溶液，且海馬粉末與PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1:200,將混合溶液在 50-60°C的條件下恒溫水浴酶解6-8h，然后將混合溶液在100°C的條件下水浴至少lOmin， 之后對(duì)混合溶液進(jìn)行離心處理并取上清液，將上清液經(jīng)0. 45 的濾膜過濾，濾后的液體 即為海馬胰蛋白酶酶解液。
[0007] 所述的海馬粉末為雄海馬粉末。
[0008] 一種如上所述的海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬胰蛋白酶酶解液 作為抗氧化劑的應(yīng)用。
[0009] 所述的海馬胰蛋白酶酶解液對(duì)DPPH自由基進(jìn)行清除的應(yīng)用。
[0010] 所述的海馬胰蛋白酶酶解液對(duì)羥基自由基進(jìn)行清除的應(yīng)用。
[0011] 所述的海馬胰蛋白酶酶解液對(duì)超氧陰離子自由基進(jìn)行清除的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明公開一種海馬胰蛋白酶酶解液，同時(shí)經(jīng)過試驗(yàn)表明，該種海馬胰蛋白酶酶解液 具有較好的抗氧化活性，對(duì)DPPH自由基（DPPH ·)、羥基自由基（· OH)和超氧陰離子自由基 (0廠·）都有較好的清除效果，因此這種海馬胰蛋白酶酶解液可以作為抗氧化活性的藥物和 保健品的原料進(jìn)行生產(chǎn)，同時(shí)該種海馬胰蛋白酶酶解液獲得容易，成本低廉，因此可以說它 具有多種優(yōu)點(diǎn)，特別適合于在本領(lǐng)域中推廣應(yīng)用，其市場(chǎng)前景十分廣闊。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面將結(jié)合說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。一種海馬胰蛋白酶酶解液，按照以下步 驟制備獲得： 將質(zhì)量比為100:5的海馬粉末和胰蛋白酶置于燒杯中，并向燒杯中加入pH=8. 0的 PBS緩沖溶液，獲得混合溶液，且海馬粉末與PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1:200,將混合 溶液在50-60°C的條件下恒溫水浴酶解6-8h，然后將混合溶液在100°C的條件下水浴至少 lOmin，滅酶活，之后對(duì)混合溶液進(jìn)行離心處理并取上清液，將上清液經(jīng)0. 45 的濾膜過 濾，經(jīng)過濾膜過濾后的液體即為海馬胰蛋白酶酶解液；這里的海馬粉末優(yōu)選雄性海馬制成 的粉末。
[0014] 通過上述方法所獲得的海馬胰蛋白酶酶解液，可以作為抗氧化劑應(yīng)用。
[0015] 對(duì)經(jīng)過上述方法獲得的海馬蛋白酶酶解液進(jìn)行抗氧化活性研宄實(shí)驗(yàn)，具體步驟如 下： a.清除DPPH自由基（DPPH ·):吸光度值測(cè)定，準(zhǔn)確移取2. OmL海馬酶解液，然后 加入2. OmL配制好的DPPH溶液，混合均勻于25°C水浴中反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后移入比色 皿中測(cè)其吸光度值A(chǔ)i;吸光度值A(chǔ)」的測(cè)定，準(zhǔn)確移取2. OmL酶解液，加入2. OmL乙醇，在25°C 水浴中反應(yīng)30min后，測(cè)定其吸光度值A(chǔ)j;吸光度值A(chǔ) ^的測(cè)定，準(zhǔn)確移取2. OmL的DPPH，加 入2. OmL的乙醇，于25°C水浴中反應(yīng)30min后測(cè)定的吸光度值為Atl。
[0016] b.清除羥基自由基（· OH):吸光度Ai的測(cè)定，準(zhǔn)確移取海馬酶解液2. OmL，先后加 入2. OmL的？6304溶液（3_317^)、2· OmL的水楊酸一乙醇溶液（6mmoL/L)，最后加入2. OmL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 75%的雙氧水啟動(dòng)反應(yīng)，在37°C水浴中反應(yīng)30min，以蒸餾水為參比，在510nm 下測(cè)定吸光度值A(chǔ)i;吸光度值A(chǔ)」的測(cè)定，準(zhǔn)確移取蒸餾水2. OmL，先后加入2. OmL的FeSO4溶 液（3mmoL/L)，2. OmL的水楊酸一乙醇溶液（6mmoL/L)和2. OmL的酶解液，同樣條件下測(cè)定本 底吸收值A(chǔ)j;吸光度值A(chǔ) ^的測(cè)定，移取蒸餾水2. OmL，先后加入2. OmL的FeSO 4溶液（3mm〇L/ L)、2. OmL的水楊酸一乙醇溶液（6mm〇L/L)，最后加入2. OmL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3. 75%的雙氧水啟 動(dòng)反應(yīng)，在37°C下反應(yīng)30min，然后測(cè)定其吸光度值A(chǔ)p
[0017] c.清除超氧陰離子自由基（0廠·）：測(cè)吸光度值A(chǔ)i的測(cè)定，準(zhǔn)確移取海馬酶解液 1.0 mL，然后加入4. 5mL pH為8. 2的tris-HCl緩沖溶液（0. 05mol/L)，在25°C水浴中保溫 20min后，加入0. 5mL鄰苯三酚（25mmol/L)，混勻后，在25°C水浴中反應(yīng)5min，用1.0 mL的 HCl溶液（8mmol/L)終止反應(yīng)，在320nm下以蒸餾水作為空白對(duì)照測(cè)吸光度值A(chǔ)tl和Ai;吸 光度值A(chǔ) j的測(cè)定，準(zhǔn)確移取海馬酶解液1.0 mL，然后加入4. 5mL pH為8. 2的tris-HCl緩沖 溶液（0. 05mo 1/L)，在25°C水浴中保溫20min后，加入0. 5mL的水，混勻后，在25°C水浴中反 應(yīng)5min，用1.0 mL的HCl溶液（8mmol/L)終止反應(yīng)，在320nm下測(cè)吸光度值A(chǔ)」。
[0018] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：海馬胰蛋白酶酶解液對(duì)DPPH自由基（DPPH ·)的清除率為：雄海馬 53. 5%，雌海馬45. 8%。對(duì)羥基自由基（· 0H)的清除率為：雄海馬88. 35%，雌海馬82. 49%。 對(duì)超氧陰離子自由基（〇廠·）的清除率為：雄海馬34. 7%，雌海馬51. 5%。所以在進(jìn)行海馬 胰蛋白酶酶解液的制備時(shí)，優(yōu)選雄海馬粉末作為原料。
[0019] 通過比較與中性蛋白酶酶解液的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可以看出，海馬的胰蛋白酶酶解液 對(duì)DPPH ·的清除率要好于中性蛋白酶酶解液，雄海馬酶解液對(duì)DPPH ·的清除率要好于雌海 馬。如表1所示。
[0020] 通過比較與中性蛋白酶酶解液的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可以看出，海馬胰蛋白酶酶解液 對(duì)·ΟΗ有顯著的清除效果。其中，雄海馬酶解液對(duì)·ΟΗ的清除率要好于雌海馬。如表2所 不O
[0021] 通過比較與中性蛋白酶酶解液的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較可以看出，海馬的胰蛋白酶酶解液 對(duì)O廠·的清除率要好于中性蛋白酶酶解液，雄海馬酶解液對(duì)O廠?的清除率要好于雌海馬。 如表3所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬胰蛋白酶酶解液按照以下步驟 制備獲得： 將質(zhì)量比為100:5的海馬粉末和胰蛋白酶置于燒杯中，并向燒杯中加入pH=8.O的PBS緩沖溶液獲得混合溶液，且海馬粉末與PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1:200,將混合溶液在 50-60°C的條件下恒溫水浴酶解6-8h，然后將混合溶液在100°C的條件下水浴至少lOmin， 之后對(duì)混合溶液進(jìn)行離心處理并取上清液，將上清液經(jīng)0. 45 的濾膜過濾，濾后的液體 即為海馬胰蛋白酶酶解液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬粉末為雄海 馬粉末。
3. -種如權(quán)利要求1所述的海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬胰蛋白酶 酶解液作為抗氧化劑的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬胰蛋白酶酶 解液對(duì)DPPH自由基進(jìn)行清除的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬胰蛋白酶酶 解液對(duì)羥基自由基進(jìn)行清除的應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬胰蛋白酶酶 解液對(duì)超氧陰離子自由基進(jìn)行清除的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種海馬胰蛋白酶酶解液，其特征在于：所述的海馬胰蛋白酶酶解液按照以下步驟制備獲得：將質(zhì)量比為100:5的海馬粉末和胰蛋白酶置于燒杯中，并向燒杯中加入pH=8.0的PBS緩沖溶液獲得混合溶液，且海馬粉末與PBS緩沖溶液的質(zhì)量體積比為1:200，將混合溶液在50-60℃的條件下恒溫水浴酶解6-8h，然后將混合溶液在100℃的條件下水浴至少10min，之后對(duì)混合溶液進(jìn)行離心處理并取上清液，將上清液經(jīng)0.45μm的濾膜過濾，濾后的液體即為海馬胰蛋白酶酶解液。這是一種成本低廉、獲得容易的海馬胰蛋白酶酶解液，以及該種海馬胰蛋白酶酶解液作為抗氧化劑的應(yīng)用。
【IPC分類】C12P21-06, A23L1-305, A61P39-06, A61K38-01
【公開號(hào)】CN104689294
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510067879
【發(fā)明人】李敏晶, 王旭瑩, 孔亮, 李偉, 靳艷
【申請(qǐng)人】大連海洋大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年6月10日
【申請(qǐng)日】2015年2月10日