一種可用于細胞粘附的水凝膠及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水凝膠的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于細胞粘附的水凝膠及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]理想的組織工程材料不僅需要具備支持并連接組織的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，而且需要在調(diào)節(jié)組織發(fā)生和細胞的生理活動方面具有優(yōu)勢。目前大多數(shù)支架材料多采用生物大分子(殼聚糖，海藻酸鹽，膠原蛋白)或合成高分子(聚乙二醇)等，用以提供支撐細胞生長的微環(huán)境。但化學殘留，病源傳播及合成成本等問題限制了其深入應用。
[0003]自然界中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于人體、高級動物、植物和微生物中，可以催化?；D(zhuǎn)移反應，它能催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的γ-碳酰胺與賴氨酸的氨基之間形成共價鍵，形成ε-(γ-谷氨酰)賴氨酸異肽鍵，這種交聯(lián)反應在自然界中主要發(fā)生在生物體內(nèi)傷口愈合和以及形成和穩(wěn)定細胞外基質(zhì)的過程中。由于這種酶具有很高的催化活性，反應條件溫和，同時依賴Ca2+，反應過程簡單可控。因此可以被用于多肽自組裝體的修飾，超分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)筑等方面，有著廣闊的生物應用前景。
[0004]目前，水凝膠的主要制備方法有物理交聯(lián)和化學交聯(lián)兩種途徑。物理交聯(lián)型水凝膠的形成主要靠次級鍵價力的作用，因靜電作用、氫鍵、疏水相互作用等的存在而形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。但物理交聯(lián)形成的水凝膠一般力學性能較弱，交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)容易因離子強度、pH值和溫度等外部環(huán)境的改變而破壞，一般不能滿足組織工程的實際應用需要；化學交聯(lián)型水凝膠通常運用傳統(tǒng)的合成聚合物的方法或光聚合、輻射聚合等技術(shù)，引發(fā)共聚或縮聚反應產(chǎn)生共價鍵而形成的共價交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。在制備過程中往往需要大量使用光引發(fā)劑、交聯(lián)劑以及有機溶劑等具有細胞毒性的添加劑，造成水凝膠具有較差的生物相容性，同時無引發(fā)劑的光引發(fā)方式不但效率相對較低，而且局部溫度過熱會損傷周圍的細胞和組織。這種方法得到的水凝膠其生物學性能(如細胞粘附，迀移，分化等)會因原料分子、交聯(lián)密度及親疏水性各不相同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種可用于細胞粘附的水凝膠及其制備方法，選用Ac-1IISLGK-NH2與左旋谷氨酰胺在酶促反應的作用下制備水凝膠，其以Ac-1IISLGK-NH 2作為支架，在酶促反應的作用下，將左旋谷氨酰胺(L-Gln)連接在納米纖維表面，能夠很好的促使細胞的粘附。
[0006]本發(fā)明的任務(wù)之一是提供一種可用于細胞粘附的水凝膠的制備方法。
[0007]—種可用于細胞粘附的水凝膠的制備方法，其是以Ac-1I1左旋谷氨酰胺在酶促反應的作用下形成的，其中，Ac-1IISLGK-NHd^N端乙?；?，C端氨基化，Ac-1 11311*-順2與左旋谷氨酰胺的摩爾比為1:1，Ac-1 IISLGK-NH 2的摩爾濃度為4?16mM，反應溫度為37?40 °C，反應時間為24?48h。
[0008]作為本發(fā)明的一個優(yōu)選方案，上述Ac-1IISLGK-NH2的摩爾濃度為7.27mM。
[0009]作為本發(fā)明的另一個優(yōu)選方案，上述酶促反應中選用的混合液為谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶溶液和含Ca2+的緩沖液。
[0010]優(yōu)選的，上述谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶溶液的制備方法為:
[0011 ] a配置底物溶液，將6L 7mg DTT溶于20mL 50mM Tris-HCl且pH為7.8緩沖溶液中，冷藏于4°C待用；
[0012]b取lmL所得底物溶液，將lmg 200U/g TG酶溶于該底物溶液中，即得lmL濃度為200U/mL的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶溶液。
[0013]優(yōu)選的，上述含Ca2+的緩沖液是將6.17mg DTT和(λ Ollg CaCl 2溶于20mL純水中制備得到的。
[0014]本發(fā)明的任務(wù)之二是提供上述制備方法得到的水凝膠。
[0015]上述水凝膠為具有網(wǎng)格狀的纖維結(jié)構(gòu)。
[0016]本發(fā)明所帶來的有益技術(shù)效果:
[0017]從原料的選取上，本發(fā)明選用氨基酸組成較少的兩親性短肽Ac-1IISLGK_NH2作為支架，通過酶促反應將左旋谷氨酰胺(L-Gln)嫁接之上，從而使其形成酶催化水凝膠，為多肽的表面修飾提供了新思路，豐富了水凝膠的種類。
[0018]本發(fā)明涉及的兩親性短肽Ac-1IISLGK_NH2，氨基酸含量較少，本發(fā)明制備方法合成成本低，合成條件易于控制，且能誘導細胞粘附，即:本發(fā)明制備得到的水凝膠能使細胞很好的粘附在細胞表面(見說明書附圖7)，同時制備得到的水凝膠毒性低、生物相容性好且不引起淋巴細胞產(chǎn)生非特異性免疫反應，是一類較為理想的納米組織工程材料，對人類生命健康具有重要意義。
【附圖說明】
[0019]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步說明:
[0020]圖1為本發(fā)明兩親性短肽Ac-1I 1511*-見12在Tris_HCl溶液中的原子力顯微鏡形貌圖；
[0021]圖2為本發(fā)明兩親性短肽Ac-1I 1511*-見12在Tris_HCl溶液中的透射電子顯微鏡形貌圖；
[0022]圖3為本發(fā)明兩親性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶溶液中24小時后的原子力顯微鏡形貌圖；
[0023]圖4為本發(fā)明兩親性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶溶液中24小時后的透射電子顯微鏡形貌圖；
[0024]圖5、圖6為本發(fā)明兩親性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶溶液中24小時后形成水凝膠的機械強度(存儲模量和損耗模量)與頻率之間的關(guān)系圖；
[0025]圖7為本發(fā)明兩親性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶溶液中24小時后形成水凝膠對MC 3T3細胞的粘附圖；
[0026]圖8為本發(fā)明兩親性短肽Ac-1IISLGK-MV^ L_Gln在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶溶液中24小時后形成水凝膠對淋巴細胞產(chǎn)生炎癥因子的影響效果圖。
【具體實施方式】
[0027]為了使本發(fā)明的優(yōu)點、技術(shù)方案更加清楚、明確，下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細說明。
[0028]首先對本發(fā)明制備方法及其性能檢測中所用到的主要實驗儀器的型號及規(guī)格做簡要說明:
[0029]電熱恒溫孵育箱(DNP-9082，上海精宏試驗設(shè)備有限公司);
[0030]干燥消毒烤箱(DHG-9246A，上海精宏試驗設(shè)備有限公司)；
[0031]臺式離心機(艾本德，德國)；
[0032]原子力顯微鏡(AFM)(Nanoscope Iva MultiMode AFM，布魯克，德國)
[0033]透射電子顯微鏡(TEM) (JEM1400Plus，捷歐路，日本)
[0034]流變儀(MarsIII，哈克)
[0035]超凈工作臺(Airtech，江蘇安泰)
[0036]恒溫細胞培養(yǎng)箱(HERACELL 150i，賽默飛世爾，法國)
[0037]倒置顯微鏡(TS100，尼康，日本)
[0038]熒光倒置顯微鏡(DMI3000B，萊卡，德國)
[0039]一次性細胞培養(yǎng)瓶(25cm2，康寧)
[0040]一次性移液管(5mL，康寧)
[0041]一次性細胞培養(yǎng)板(3599，康寧)
[0042]一次性細胞培養(yǎng)板(3548，康寧)
[0043]液氮容器(YDS-30-125，東亞液氮容器)
[0044]微波輔助多肽合成儀(微波多肽自動合成儀，華盛昌)。
[0045]其次，對本發(fā)明所選用的主要原料做詳細說明，本發(fā)明所選用的Ac-1IISLGK-NH2是自制的，其具體制備方法為:
[0046]步驟1、蒸饋N, N-二甲基甲酰胺(DMF)和呢啶(Piperidine)溶劑
[0047]將購買的DMF溶液在60°C條件下減壓蒸餾，去除蒸餾前后液各10mL左右，得到純的DMF溶劑；將購買的哌啶中加入少量CaHdP熱回流1_2小時，接收沸點溫度(106°C )的餾分，得到純的哌啶溶劑；
[0048]步驟2、氨基酸、樹脂、活化劑、蓋帽劑、去保護劑等的配制
[0049]多肽固相合成儀上計算出制備0.25mM Ac-1IISLGK-NH2所需氨基酸和其他試劑的用量(為保證多肽合成時，兩親性短肽的純度，氨基酸的用量加倍，其終濃度為0.2M):
[0050]Lys (賴氨酸):1.03g 溶于 1 lmL DMF 中；
[0051]Gly (甘氛酸):0.65g 溶于 llmL DMF 中；
[0052]lie (異亮氨酸):2.26g 溶于 32mL DMF 中；
[0053]Leu(亮氨酸):0.78g 溶于 llmL DMF 中；
[0054]Ser (絲氛酸):0.84g 溶于 llmL DMF 中；
[0055]樹脂(載量為0.6mmol/g):0.417g ；
[0056]注意:氨基酸的a-氨基均為Fmoc保護，Lys的側(cè)鏈氨基也被保護；
[0057]活化劑:苯并三氮唑-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU):5.29g ； 1_羥基苯并三唑(Η0ΒΤ):1.88g ;溶于 3 lmL DMF ；
[0058]活化堿:N,N- 二異丙基乙胺(DIEA):5.57mL ；DMF:10.43mL ；
[0059]蓋帽劑:乙酸酐:2.2ml ；N, N_ 二異丙基乙胺(DIEA):0.239g ；H0BT:0.022g ;溶于8.8mL DMF 中；
[0060]裂解劑:三氟乙酸(TFA):14.25mL ;三異丙基硅烷(TIS):0.375mL ；H20:0.375mL ；
[0061]去保護劑:哌啶:39.6mL ；DMF:158.4mL ；1-羥基苯并三唑(HOBT):2.67g ；
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