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基于脂質體的免疫療法

文檔序號:10692957閱讀:1369來源:國知局
基于脂質體的免疫療法
【專利摘要】本發(fā)明提供了封裝自身抗原的脂質體,其中所述脂質體具有500至15000nm的大小,并且所述脂質體的膜包含全部膜的脂質體組分的10重量%至40重量%的量的磷脂酰絲氨酸(PS)。還提供了包含治療有效量的所述脂質體的藥物組合物或獸用組合物。此外,本發(fā)明提供了特別是用于治療自身免疫病的作為藥物用途的如上所限定的脂質體和藥物組合物或獸用組合物。最后,本發(fā)明提供了用于恢復患有自身免疫病的患者的自身耐受性的如上所限定的脂質體和藥物組合物或獸用組合物。
【專利說明】基于脂質體的免疫療法
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學領域。具體而言,本發(fā)明提供了用于預防或治療自身免疫性病癥 的封裝自身抗原的脂質體。
【背景技術】
[0002] 自身免疫是有機體自己識別其自身構成部分的故障,從而產生針對其自身細胞和 組織的免疫應答。將由于異常免疫應答引起的任何疾病稱為自身免疫病。突出的實例包括1 型糖尿病(T1D)、紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化(MS)、愛迪生氏病、乳糜瀉、皮肌炎、 橋本氏甲狀腺炎、重癥肌無力、惡性貧血、反應性關節(jié)炎、干燥綜合征(Sjogren syndrome)。
[0003] 據計算,發(fā)達國家的人口中有7%至10%的人口患有這些疾病,其通常是慢性的、 令人衰弱的且威脅生命的。自身免疫相關的醫(yī)學護理費用持續(xù)增加,因為自身免疫性病癥 在全球范圍內增加且無可用的有效治療。
[0004] 傳統(tǒng)上,用于自身免疫病的治療是免疫抑制劑、抗炎劑(類固醇)或緩和劑。非免疫 學療法,如在橋本氏甲狀腺炎或1型糖尿病中的激素替代,治療自身侵略性應答的后果,因 此這些是姑息療法。飲食控制限制了乳糜瀉的嚴重程度。留族或NSAID的治療限制了許多疾 病的炎性癥狀。
[0005] 在發(fā)展減輕或避免不希望的免疫應答的免疫調節(jié)療法中已投入了大量的研究。然 而,對不同的自身免疫病的復雜細節(jié)的有限認識實質上放慢了該領域的進展。當前的策略 通?;趶V泛作用的免疫抑制藥物,為了維持免疫抑制,所述藥物通常是終生治療。此外, 廣泛作用的免疫抑制劑的使用與嚴重的副作用的風險相關,如腫瘤、感染、腎毒性和代謝病 癥。
[0006] 迄今為止,盡管做出了努力,但仍需要治療自身免疫性病癥的進一步治療方法,所 述治療方法有效且無不希望的副作用。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了在自身免疫病的治療中非常有效的新的自身抗原特異性 療法。具體而言,發(fā)明人發(fā)現(xiàn),通過將與意圖治療的自身免疫病相關的自身抗原封裝在具有 特定大小且包含脂質磷脂酰絲氨酸的脂質體中可以有效地治療自身免疫病。
[0009] 因此,第一方面本發(fā)明涉及封裝自身抗原的脂質體,其中(i)脂質體具有500至 15000nm的大??;以及(ii)脂質體的膜包含全部膜的脂質體組分的10重量%至40重量%的 量的磷脂酰絲氨酸(PS)。
[0010] 本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn),本發(fā)明的脂質體的特定特征,g|] 500至15,OOOnm的大小以及 存在10 %至40 %的PS,使封裝的自身抗原能夠通過抗原遞呈細胞進行致耐受性遞呈,從而 恢復對自身抗原的耐受性。
[0011] 不希望受理論束縛,發(fā)明人假設,本發(fā)明的脂質體的特定特征確保它們能被樹突 狀細胞有效吞食,并且加工封裝的自身抗原,通過MHC II類分子遞呈至⑶4+T淋巴細胞(外 源性遞呈)且以致耐受性形式遞呈至⑶8+T淋巴細胞(交叉遞呈),從而誘導對抗原的耐受性 并停滯自身免疫級聯(lián)。除非另有說明,否則本發(fā)明的封裝自身抗原的脂質體誘導對自身抗 原的耐受性,而不是自身免疫性,這導致對自身免疫性病癥的有效治療。
[0012] 在下文的實施例中展示了本發(fā)明的封裝自身抗原的脂質體的致耐受性效果以及 所述脂質體在自身免疫性病癥的治療中,尤其是在T1D和MS的治療中的令人驚訝的效果。
[0013] 如在圖2、圖3和圖4中所示,通過樹突狀細胞捕獲封裝胰島素肽的PS-脂質體,借 此,這些樹突狀細胞獲得致耐受性特征:在糖尿病的情況中,共刺激分子的表達減少、誘導 PGE2的產生以及T細胞的增殖減少。結果表明,類似于凋亡小體,脂質體在某種程度上促進 樹突狀細胞(DC)的致耐受性。此外,在促炎刺激之后,作用未減弱(要考慮的重要特征),因 為這證明了一旦自身免疫級聯(lián)持續(xù)且促刺激的刺激物存在,療法有效。
[0014] 如在下文的實施例中所示,上述全部導致自身免疫病的有效治療。圖5和圖6表明, 在單次施用本發(fā)明的脂質體下,實現(xiàn)了 N0D前驅糖尿病小鼠的治療,而圖8A顯示,當在疾病 發(fā)作之后施用時,載有胰島素肽的PS-脂質體可以逆轉N0D小鼠中的糖尿病。而且,圖9顯示, 在C57BL/6免疫小鼠中,含髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(M0G)肽的PS-脂質體可以防止實驗性 自身免疫性腦脊髓炎(EAE)病的發(fā)展。因此,與用于自身免疫性病癥的已知免疫調節(jié)或抗炎 治療相比,不會永久地需要由發(fā)明人開發(fā)的基于脂質體的療法。相反,實現(xiàn)了耐受性的長期 恢復,導致有效地預防或治療自身免疫病。在單次施用包含有效量的封裝自身抗原的脂質 體的藥物組合物之后或可選地將其施用2-4次可以實現(xiàn)該效果。
[0015] 還可以在圖5、圖6和圖8B中觀察到,當小鼠接受空脂質體時,對T1D的發(fā)病率無影 響。因此,只有當脂質體封裝合適的自身抗原時,治療才有效,這表明納米療法的抗原特異 性。
[0016] 雖然是基于抗原特異的療法,但本發(fā)明的封裝自身抗原的脂質體具有未呈現(xiàn)不希 望副作用的優(yōu)點。如上文所提到的,用于治療自身免疫病的其它免疫調節(jié)方法涉及免疫抑 制劑,其通常導致對感染的高度易感性并且有時還促進腫瘤、腎毒性或代謝病癥的發(fā)展。
[0017] 除了提供致耐受性遞呈之外,由于保護貨物免于降解以及毒性的降低/不存在,將 自身抗原封裝在本發(fā)明特別設計的脂質體中是非常期望的目標。這是由于這樣的事實:將 自身抗原限制在脂質體中直到被抗原遞呈細胞攝取,因此不會引起不良的免疫應答。
[0018] 本發(fā)明的第二方面提供藥物組合物或獸用組合物,其包含治療有效量的如上所限 定的封裝自身抗原的脂質體以及其它合適的藥學或獸醫(yī)學可接受的賦形劑或載體。
[0019] 本發(fā)明的基于脂質體的藥物組合物在穩(wěn)定性、均勻性以及便于大規(guī)模生產方面具 有若干優(yōu)勢。
[0020] 首先,可以使用低成本的常見試劑以及藥物工業(yè)中的設備來實現(xiàn)本發(fā)明的封裝自 身抗原的脂質體的生產。
[0021] 相比于傾向聚集的較小脂質體且它們的生產需要通過具有小孔徑的昂貴膜的反 復擠壓過程,本發(fā)明的脂質體,由于其大小,在溶液中非常穩(wěn)定且易于獲得。
[0022]而且,可以保證產物的均勻性,同時用于大型工業(yè)生產的按比例增加是負擔得起 的。
[0023]另一大優(yōu)點在于這樣的事實:本發(fā)明的基于脂質體的藥物組合物是限定的組合 物,其沒有不希望的污染物或副產物。封裝自身抗原的脂質體不會退化為有毒的副產物,如 壞死小體,且不會引起如在基于自體或異體細胞療法的情況下的排斥。
[0024]由于致耐受性效果,本發(fā)明的封裝自身抗原的脂質體提供了自身免疫性病癥的有 效預防(即,避免引發(fā)自身免疫),以及對臨床前階段(即,已經引發(fā)自身免疫但組織損傷和 臨床癥狀低的階段)和臨床階段(即,組織損傷較高且臨床癥狀明顯的階段)的自身免疫病 的有效治療。
[0025] 因此,在第三方面,本發(fā)明提供了用作藥物的本發(fā)明的第一方面的封裝自身抗原 的脂質體。還可將該方面表述為用于預防或治療疾病的方法,其包括向需要此類治療的哺 乳動物(包括人)施用治療有效量的本發(fā)明的封裝自身抗原的脂質體,以及一種或多種合適 的藥學可接受的賦形劑或載體。
[0026] 在第四方面,本發(fā)明提供了用于預防或治療自身免疫病的如上限定的封裝自身抗 原的脂質體??蓪⒃摲矫姹硎鰹槿缟舷薅ǖ姆庋b自身抗原的脂質體在制備用于預防或治療 自身免疫病的藥物中的用途。還可將該方面表述為用于預防或治療自身免疫病的方法,其 包括向有此需要的對象(包括人)施用治療有效量的如上所限定的封裝自身抗原的脂質體, 以及藥學可接受的賦形劑或載體。
[0027] 在第五方面,本發(fā)明提供了用于恢復患有自身免疫病的患者的自身耐受性的如上 所限定的封裝自身抗原的脂質體??蓪⒃摲矫姹硎鰹槿缟纤薅ǖ姆庋b自身抗原的脂質體 在制備用于恢復患有自身免疫病的患者的自身耐受性的藥物中的用途。還可將該方面表述 為用于恢復患有自身免疫病的患者的自身耐受性的方法,其包括向有此需要的對象(包括 人)施用治療有效量的如上所限定的封裝自身抗原的脂質體,以及藥學可接受的賦形劑或 載體。
[0028] 最后,本發(fā)明的其它方面提供了用于抑制自身免疫應答的如上限定的脂質體或者 藥物組合物或獸用組合物;以及用于預防或治療自身免疫病的如上限定的脂質體或者藥物 組合物或獸用組合物,其中所述脂質體或者藥物組合物或獸用組合物恢復對封裝的自身抗 原的耐受性。
[0029] 附圖簡述
[0030] 圖1.載有源于胰島素的自身抗原的PS-脂質體的低溫透射電子顯微鏡(cryo-TEM, JE0L-JEM 1400顯微鏡)圖像。比例尺=0.2μπι。
[0031] 圖2.對照DC(A)、DC與俄勒岡綠488DHPE標記的PS-脂質體(0G488PS-lipo)于4°C (B)和37°C(C)共培養(yǎng)30分鐘的流式細胞術(FACS)分析。X-坐標代表0G488PS-lipo;y-坐標 代表CD11 c-PECy 7染色的DC。
[0032]圖3.在DC中捕獲PS-脂質體的影響。y-坐標代表(A)通過膜聯(lián)蛋白V和7aad染色評 估的DC的活力(%),(B)CD40和⑶86膜表達的熒光強度的中值以及(C)通過ELISA定量未成 熟DC和成熟DC的培養(yǎng)上清液中前列腺素 E2(PGE2)的產生。白色符號代表在捕獲PS-脂質體 (正方形)或載有胰島素肽的PS-脂質體(圓圈)之前(三角形)和在培養(yǎng)后24小時,捕獲PS-月旨 質體或載有胰島素肽的PS-脂質體之后的未成熟DC。黑色符號代表在捕獲PS-脂質體(正方 形)或載有胰島素肽的PS-脂質體(圓圈)之前(三角形)和在促炎刺激(脂多糖,LPS)之后24 小時,捕獲PS-脂質體或載有胰島素肽的PS-脂質體之后成熟DC的活力。ELISA數(shù)據以pg/10 6 個細胞表示。
[0033]圖4.在捕獲PS-脂質體之后,即使在促炎刺激之后,DC刺激自體T細胞增殖的能力 受損。y-坐標代表由在捕獲PS-脂質體(白色正方形)或以1:10的比例載有胰島素肽(2〇yg/ ml)的PS-脂質體(白色圓圈)之前(白色三角形)和培養(yǎng)7天,捕獲PS-脂質體或以1:10的比例 載有胰島素肽(20μg/ml)的PS-脂質體之后的未成熟DC誘導的刺激之后的T細胞的自體增殖 (c.p.m.,3H胸苷分析)。黑色符號代表在捕獲PS-脂質體(黑色正方形)或載有胰島素肽的 PS-脂質體(黑色圓圈)之前(黑色三角形)和之后被促炎刺激物LPS(100ng/ml)預先活化的 成熟DC誘導的增殖。
[0034] 圖5.利用封裝胰島素肽的PS-脂質體的免疫療法降低了T1D的發(fā)病率。(A)y_坐標 代表在用載有胰島素肽的PS-脂質體(圓圈,n=12)、空PS-脂質體(正方形,n = 18)治療的 N0D小鼠中,以及在接受鹽溶液的對照組(三角形,n=16)中糖尿病的累積發(fā)病率(百分比)。 (B)y-坐標代表在用載有胰島素肽的PS-脂質體(圓圈,n=12-6)、空PS-脂質體(正方形,n = 18-3)治療的小鼠中,以及在用鹽溶液治療的對照組(三角形,n = 16-3)中體重(g)的追蹤。 X-坐標表示小鼠的周齡。
[0035] 圖6 .胰島炎得分在免疫小鼠中不太嚴重。PS-脂質體對N0D小鼠中的胰島炎的影 響。y-坐標代表(A)不同組的N0D小鼠的胰島炎得分以及⑶在不同的N0D小鼠組中被歸類在 5個浸潤類別的每一個中的胰島的百分比。浸潤類別:0,無胰島炎;1,周邊胰島的;2,輕度胰 島炎(浸潤胰島〈25% );3,25-75%的胰島浸潤;4,全部胰島浸潤。N0D小鼠組是:用鹽溶液 (S)治療的對照小鼠、用空PS-脂質體(PS)治療的小鼠以及用含自身抗原的PS-脂質體 (PSAB)治療的小鼠。在研究期結束時(30周),分析來自4-6只非糖尿病小鼠/組的胰腺。結果 是平均值土SEM。*相對于對照組的顯著性差異(p〈0.05)(非配對t-檢驗)。
[0036] 圖7:PS_脂質體的追蹤。來自腹膜內(i.p.)注射熒光標記的PS-脂質體(Alexa Fluor 750)的NOD小鼠的幾種器官在24小時的熒光信號(RFU,相對熒光單位/g組織)的直方 圖。PAT,周邊生殖腺的脂肪組織;K,腎臟;S,脾臟;P,胰腺;PLN,胰淋巴結;MLN,腸系膜淋巴 結;L,肝臟;MDLN,縱隔淋巴結;T,胸腺。示出了三次獨立實驗的一次代表性實驗的結果。Y-坐標表示RFU/g組織。
[0037] 圖8.疾病發(fā)作(第0天)之后1天、5天和8天用載有胰島素肽的PS-脂質體(A)或空脂 質體(B)治療的糖尿病小鼠中的血糖水平。Y-坐標表示血液的血糖(mg/d 1)?;疑珔^(qū)表示診 斷價值的血糖范圍。X-坐標表示從疾病發(fā)作起的時間,用天數(shù)表示。圓圈表示無胰島素施用 的天數(shù)。
[0038]圖9.針對用含M0G肽的脂質體(白色圓圈)或空脂質體(白色三角形)治療的C57BL/ 6免疫小鼠每日進行EAE的臨床得分。Y-坐標表示平均的臨床得分。X-坐標表示免疫后的時 間,用天數(shù)表示。
[0039] 發(fā)明詳述
[0040] 在第一方面,本發(fā)明提供了封裝自身抗原的脂質體。
[0041] 術語"脂質體"應被理解為包含由脂質雙層組成的一個或多個膜的自組裝結構,所 述脂質雙層各自包含含有相對朝向的兩親性脂質分子的兩個單層。兩親性脂質包含共價連 接的極性(親水性)頭基區(qū)以及一條或兩條非極性(疏水性)?;?。疏水性酰基鏈和周圍的 水性介質之間的能量上不利的接觸誘導兩親性脂質分子本身進行排列,使得它們的極性頭 基朝向雙層的表面,而?;溨囟ㄏ虺螂p層的內部。因此,形成能量上穩(wěn)定的結構,在所 述結構中,有效地防止?;溑c水性環(huán)境接觸。
[0042] 脂質體可以具有單一的雙層膜(小單層囊泡"SUV"和大單層囊泡"LUV")或多個雙 層膜(多層大囊泡"MLV")。還可以將脂質體制備為多囊狀囊泡"MVV",其為包封或封裝多個 非同心水性室的脂質體。相反,MLV具有多個同心的"洋蔥皮"樣的膜,其各自封裝水性隔室。 考慮到脂質分子的保護屏障內水性體積的這種封裝,脂質體能夠使封裝的分子(例如,肽) 隔絕遠離外部環(huán)境中存在的諸如肽酶的因子的降解作用。
[0043] 本發(fā)明的脂質體的大小是500至15,000nm(促進脂質體被抗原遞呈細胞攝取的大 小)。此外,本發(fā)明的脂質體優(yōu)選具有MVV的形態(tài),如圖1所示。當與常見的MLV或SUV相比時, 這些大的MVV脂質體具有顯著較高的裝載功效,并且還有助于將封裝的活性劑(在該情況下 是自身抗原)優(yōu)選溶于水性隔室(而不是沉淀或被錨定至膜)。所有這些在自身抗原在抗原 遞呈細胞內的生物利用度的方面具有優(yōu)勢,這導致更高的免疫調節(jié)活性。
[0044] 在一個實施方案中,本發(fā)明的脂質體具有500至12,000nm的大小。在另一實施方案 中,脂質體的大小是500至10,000nm。在另一實施方案中,脂質體的大小是600至8000nm,更 具體地為 700 至 7000nm、或 800 至 5000nm、或 900 至 3000nm,或 900 至 2000nm、或 900 至 1500nm、 或1000至1400nm。在具體實施方案中,脂質體具有1000至1300nm的大小,例如lOOOnm、 1050nm、11OOnm、1150nm或1200nm。
[0045] 在一個實施方案中,本發(fā)明的脂質體具有MVV的形態(tài)且具有500至12,000nm的大 小。在另一實施方案中,本發(fā)明的脂質體具有MVV的形態(tài)且具有500至10,000nm的大小。在另 一實施方案中,本發(fā)明的脂質體具有MVV的形態(tài)且具有600至8000nm的大小,更具體地為700 至7000nm、或800至5000nm、或900至3000nm、或900至2000nm、或900至1500nm、或1000至 1400nm。在具體實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)且具有1000至1300nm的大小,例如 1 OOOnrn、1050nm、1100nm、1150nm 或 1200nm。
[0046] 脂質體的膜可以包含但不限于諸如磷脂酰膽堿("PC")、磷酯酰絲氨酸("PS")、磷 酯酰乙醇胺("PE")、磷酯酰甘油("PG")、磷酯酰肌醇("ΡΓ )和磷酯酸("PA")的磷脂??梢詷?成納米顆粒的膜的其它脂質包括但不限于膽固醇("CH0L")和膽固醇-PEG以及熒光標記的 磷脂酰膽堿。脂質體的膜可以含有性質上非脂質的另外分子,如蛋白、碳水化合物、抗體或 聚乙二醇(PEG)鏈。脂質體可以包含特定的部分,所述部分被設計成將脂質體靶向特異位點 或靶細胞,或者保護脂質體抵抗有害環(huán)境(例如胃腸道)。對于自身抗原的致耐受性遞送,月旨 質體的組分是相關的。因此,如上文所提到的,脂質體的膜包含全部膜的脂質體組分的10重 量%至40重量%的量的PS。包含在脂質體的膜中的PS構成'吃我(eat me)'信號,其連接抗 原遞呈細胞的PS識別與耐受性誘導的后果。值得注意的是,本發(fā)明的脂質體不需要其他受 體或配體以被DC有效吞食并且實現(xiàn)自身抗原的致耐受性遞送。然而,可以將其它受體和/或 配體組裝進脂質體,以便改善攝取和/或致耐受性加工。
[0047] 術語"重量百分比(% )"指脂質體的膜的各成分相對于膜的脂質體組分的總重量 的百分比。
[0048] "膜的脂質體組分",例如,當為包含多于一個膜雙層的MVV脂質體時(如圖1中所 示),指包含在脂質體中的膜雙層的全部。當使用術語"脂質體的膜(liposome membrane)" 或"脂質體的膜(liposomal membrane)"時,應進行相同的理解,其二者均指包含在本發(fā)明 的脂質體中的全部膜雙層(不僅是外面的膜)。
[0049]在一個實施方案中,脂質體的膜包含全部膜的脂質體組分的15重量%至37重量% 的量的PS。在其他實施方案中,膜的PS是全部膜的脂質體組分的20重量%至35重量%、或22 重量%至35重量%、或22重量%至33重量%、或25重量%至32重量%、或26重量%至31重 量%、或27重量%至30重量%,例如27%、28%、29%或30%。優(yōu)選地,膜的PS是全部膜的脂 質體組分的30 %。
[0050] 除PS之外,本發(fā)明的脂質體可以包含不同濃度的其它脂質。在一些實施方案中,月旨 質體的膜還包含PC。在一些實施方案中,脂質體的膜還包含CH0L。在具體實施方案中,脂質 體的膜還包含PC和CH0L。
[0051] 在一個實施方案中,脂質體的膜包含全部膜的脂質體組分的10重量%至40重量% 的量的PC。在另一實施方案中,脂質體的膜包含全部膜的脂質體組分的12重量%至40重 量%的量的PC。在其他實施方案中,膜的PS是全部膜的脂質體組分的15重量%至37重量%, 或20重量%至35重量%、或22重量%至33重量%、或25重量%至32重量%、或26重量%至31 重量%、或27重量%至30重量%,例如27%、28%、29%或30%。
[0052] CH0L的量可以是全部膜的脂質體組分的13重量%至53重量%。在一個實施方案 中,脂質體的膜包含全部膜的脂質體組分的20重量%至50重量%的量的CH0L。在其他實施 方案中,優(yōu)選地,膜的CH0L是全部膜的脂質體組分的27重量%至46重量%、或30重量%至44 重量%、或33重量%至42重量%、或36重量%至40重量%,例如36%、37%、38%、39%或 40% 〇
[0053] 包含在脂質體的膜中的不同脂質的比例必須是平衡的以便獲得就穩(wěn)定性、滲透性 和形態(tài)學方面具有合適的物理化學特性的脂質體。通常,脂質體的膜可以包含PS:PC:CH0L 的摩爾比為0.6:0.6:0.7至1.5:1.5:1.8的PS、PC和CH0L。術語"比值"以通常的含義理解為 相對于彼此的數(shù)量的量級。具體地,兩個數(shù)量的比值表示第二數(shù)量(Y)包含多少倍的第一數(shù) 量(X),且表示為X:Y。當提到的量級是摩爾濃度時,使用術語"摩爾比"??蛇x地,當提到的量 級是重量時,將比值表述為"重量比"。此處,對于三種具體的脂質(PS、PC和CH0L),給出了摩 爾比的范圍。在一個實施方案中,膜包含摩爾比為0.7 :0.7 :0.8至1.4:1.4:1.6的PS: PC: CH0L。在另一實施方案中,膜包含摩爾比為0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC:CH0L。在另 一實施方案中,膜包含摩爾比為0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的PS:PC:CH0L。在優(yōu)選實施方案 中,膜包含摩爾比為大約1:1:1.33的PS:PC:CH0L。
[0054] 如上文所提到的,本發(fā)明的脂質體封裝自身抗原。術語"自身抗原"指被患有特異 性自身免疫病的患者的免疫系統(tǒng)識別的正常蛋白或蛋白的復合體。在正常條件下,這些抗 原不應當是免疫系統(tǒng)的靶標,但是,主要由于遺傳和環(huán)境因素,在這些患者中喪失了此類抗 原的正常免疫學耐受性。在某些實施方案中,脂質體封裝與同一自身免疫病相關的其他自 身抗原。例如,脂質體可以封裝優(yōu)選與T1D相關的兩種、三種、四種或五種自身抗原。
[0055] 在一些實施方案中,形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重 量比是50:1至2:1。在另一實施方案中,形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量 之間的重量比是30:1至3:1。在另一實施方案中,形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗 原的總量之間的重量比是20:1至3:1。在另一實施方案中,形成脂質體的膜的脂質的總量相 對自身抗原的總量之間的重量比是15:1至3:1。在另一實施方案中,形成脂質體的膜的脂質 的總量相對自身抗原的總量之間的重量比是12:1至3:1。在另一實施方案中,形成脂質體的 膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重量比選自:11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5: 1 和4:1。
[0056]在一個實施方案中,脂質體具有500至10,000nm的大小,脂質體的膜包含20重量% 至35重量%的?3且包含摩爾比為0.7:0.7:0.8至1.4:1.4 :1.6的?3:?(::0101^,以及形成脂質 體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重量比是50:1至3:1。
[0057]在一個實施方案中,脂質體具有700至7,OOOnm的大小,脂質體的膜包含22重量% 至33重量%的?3以及摩爾比為0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC:CH0L,以及形成脂質體 的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重量比是20:1至3:1。
[0058]在另一實施方案中,脂質體具有800至5000nm的大小,脂質體的膜包含25重量%至 32重量%的?3以及摩爾比為0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的PS:PC:CH,以及形成脂質體的膜的 脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重量比是15:1至3:1。
[0059]在另一實施方案中,脂質體具有900至3000nm的大小,脂質體的膜包含30重量%的 PS、30重量%的?5和40重量%的01,以及形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總 量之間的重量比是12:1至3:1,優(yōu)選地,重量比選自 :11:1、10:1、9:1、8:1、7 :1、6:1、5:1和4: 1〇
[0060]在另一實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及800至5000nm的大小,脂質體的膜 包含25重量%至32重量%的?3以及摩爾比為0.9:0.9:1至1.1:1.1:1.4的?3:?(: :01,以及形 成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重量比是15:1至3:1。在另一實施 方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及900至3000nm的大小,脂質體的膜包含30重量%的?3、30 重量%的?5和40重量%的01,以及形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間 的重量比是12:1至3:1,優(yōu)選地,重量比選自 :11:1、10:1、9:1、8:1、7 :1、6:1、5:1和4:1。在優(yōu) 選實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)、lOOOnm的大小,脂質體的膜包含30重量%的?5、30重 量%的?5和40重量%的01,以及形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的 重量比是 12:1 至3:1,優(yōu)選地,重量比選自:11:1、10:1、9:1、8 :1、7:1、6:1、5:1和4:1。
[0061]封裝的自身抗原與特異性自身免疫病相關。在某些實施方案中,自身抗原與選自 以下的自身免疫病相關:T1D、紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、愛迪生氏病、乳糜瀉、 皮肌炎、橋本氏甲狀腺炎、重癥肌無力、惡性貧血、反應性關節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、 自身免疫性中性粒細胞減少癥、格雷夫斯病、銀肩病、銀肩病性關節(jié)炎以及干燥綜合征。在 具體實施方案中,脂質體封裝與T1D相關的自身抗原。已知與T1D相關的非限制性自身抗原 是胰島素、胰島素原、蛋白酪氨酸磷酸酶(IA2,也被稱作胰島細胞抗原512 )、谷氨酸脫羧酶 (GAD)、嗜鉻粒蛋白和胰島-葡萄糖-6-磷酸酶催化亞基相關蛋白(IGRP) (Roep B0,Peakman M.Cold Spring Harb Perspect Med ,2012,vo1.2(4):a007781.oi:10 . 1101 / cshperspect.a007781.)。因此,在一個實施方案中,本發(fā)明的脂質體封裝選自以下的自身 抗原:胰島素、胰島素原、IA2、GAD、嗜鉻粒蛋白和IGRP。
[0062]而且,在本發(fā)明的含義中,封裝在脂質體中的自身抗原不需要是完整的抗原蛋白。 事實上,相關蛋白的特異性區(qū)域已被分離并描述為特定抗原的。因此,在某些實施方案中, 脂質體封裝這樣的自身抗原:其為抗原肽,特別是與T1D相關的抗原肽,例如,源自胰島素、 胰島素原、IA2、GAD、嗜鉻粒蛋白和IGRP的抗原肽。例如,已將由源自胰島素 A鏈的SEQ ID N0:1(21個氨基酸,GIVDQCCTSICSLYQLENYCN)和源自胰島素 B鏈的SEQIDN0:2(30個氨基 酸,F(xiàn)VKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMS)定義的肽公開為T1D中的特定自身抗原。因此,在一 個實施方案中,脂質體封裝與T1D相關的自身抗原且所述自身抗原源自胰島素,優(yōu)選選自 SEQIDN0:1和SEQIDN0:2的肽。在具體實施方案中,脂質體封裝具有SEQIDN0 :1和SEQ ID NO :2的肽。
[0063] 與自身免疫病相關且可被封裝在本發(fā)明的脂質體中的其它自身抗原蛋白或肽是, 例如,對于多發(fā)性硬化,來自髓磷脂的肽,如源自髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(M0G)的肽;對于 重癥肌無力,來自乙酰膽堿受體的肽;對于乳糜瀉,為轉谷氨酰胺酶;對于自身免疫性甲狀 腺炎,為甲狀腺球蛋白(Lernmark A.J.Clin Invest,2001,vol · 108,p· 1091-1096)。在具體 實施方案中,本發(fā)明的脂質體封裝與MS相關的抗原肽的自身抗原,例如,源自MOG的抗原肽, 如由SEQ ID N0:3定義的肽。
[0064] 有利地,包含在本發(fā)明的脂質體中的自身抗原肽具有使所述抗原能夠被主要組織 相容性復合體表面分子直接遞呈的大小。"直接遞呈"意指在表面展示之前不需要抗原遞呈 細胞對這些肽進行主要的加工。在一些實施方案中,本發(fā)明的脂質體中的自身抗原肽的大 小是5至100個氨基酸,特別是5至70個氨基酸、或8至50個氨基酸、或8至35個氨基酸、或8至 30個氨基酸。此類自身抗原提供以下方面的優(yōu)點:生物利用度、基于脂質體療法的效力且便 于加工(當與完整的蛋白或大肽相比時,此類小肽的封裝更容易且成本更低)。
[0065]在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及700至7000nm的大小,脂質體的膜 包含22重量%至33重量%的?5以及摩爾比為0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC: CH0L,脂 質體封裝與T1D相關的至少一種自身抗原,優(yōu)選源自胰島素的肽的自身抗原,以及形成脂質 體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重量比是20:1至3:1。
[0066]在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及700至7000nm的大小,脂質體的膜 包含22重量%至33重量%的?5以及摩爾比為0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC: CH0L,至 少一種自身抗原為選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2的肽,以及形成脂質體的膜的脂質的總 量相對自身抗原的總量之間的重量比是20:1至3:1。
[0067]在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及800至5000nm的大小,脂質體的膜 包含25重量%至32重量%的?5以及摩爾比為0 · 9:0 · 9:1至1 · 1:1 · 1:1 · 4的PS: PC: CH0L,至少 一種自身抗原是選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2的肽,以及形成脂質體的膜的脂質的總量 相對自身抗原的總量之間的重量比是15:1至3:1。
[0068]在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及700至7000nm的大小,脂質體的膜 包含22重量%至33重量%的?5以及摩爾比為0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC: CH0L,脂 質體封裝與T1D相關的至少一種自身抗原,優(yōu)選源自胰島素的肽的自身抗原,以及形成脂質 體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重量比是20:1至3:1。
[0069]在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及700至7000nm的大小,脂質體的膜 包含22重量%至33重量%的?5以及摩爾比為0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC: CH0L,至 少一種自身抗原為選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2的肽,以及形成脂質體的膜的脂質的總 量相對自身抗原的總量之間的重量比是20:1至3:1。
[0070] 在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及800至5000nm的大小,脂質體的膜 包含25重量%至32重量%的?5以及摩爾比為0 · 9:0 · 9:1至1 · 1:1 · 1:1 · 4的PS: PC: CH0L,至少 一種自身抗原是選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2的肽,以及形成脂質體的膜的脂質的總量 相對自身抗原的總量之間的重量比是15:1至3:1。
[0071] 在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及800至5000nm的大小,脂質體的膜 包含25重量%至32重量%的?5以及摩爾比為0 · 9:0 · 9:1至1 · 1:1 · 1:1 · 4的PS: PC: CH0L,至少 一種自身抗原是SEQ ID N0:1的肽,以及形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總 量之間的重量比是15:1至3:1。
[0072]在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及800至5000nm的大小,脂質體的膜 包含25重量%至32重量%的?5以及摩爾比為0 · 9:0 · 9:1至1 · 1:1 · 1:1 · 4的PS: PC: CH0L,至少 一種自身抗原是SEQ ID N0:2的肽,以及形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總 量之間的重量比是15:1至3:1。
[0073]在一個實施方案中,脂質體具有MVV的形態(tài)以及700至7000nm的大小,脂質體的膜 包含22重量%至33重量%的?5以及摩爾比為0.8:0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS:PC: CH0L,脂 質體封裝與MS相關的至少一種自身抗原,優(yōu)選源自M0G的肽的自身抗原,所述肽如由SEQ ID NO: 3定義的肽,以及形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的總量之間的重量比是 20:1至3:1。
[0074] 本領域技術人員熟知的多種方法可用來制備封裝一種或多種肽的脂質體。例如, 通過脂質薄膜水化法,在脂質體形成期間將自身抗原直接截留可以形成本發(fā)明的脂質體。
[0075] 在一個實施方案中,本發(fā)明的脂質體通過以下方法制備,所述方法包括:(a)在適 當?shù)娜軇?例如氯仿)中制備脂質混合物,(b)例如,通過在真空下蒸發(fā)將溶劑移除,(c)使脂 質混合物與含有至少一種自身抗原的合適緩沖液(例如磷酸鹽緩沖鹽水)水化,(d)任選地, 例如通過離心將未封裝的肽移除,以及(e)依據大小將所得到的含自身抗原的脂質體進行 純化或均質化。優(yōu)選地,擠壓可用來使脂質體的大小變均勻,即在壓力下迫使脂質體通過確 定的選定大小的濾孔來產生具有預定平均大小的脂質體。還可使用切向流過濾來純化和調 整脂質體的大小,即以產生具有較少雜質、較少大小異質性、以及更多均質且均勻大小分布 的脂質體群。當脂質體封裝多于一種自身抗原時,在含有期望比例的所述自身抗原混合物 的緩沖液的存在下進行水化步驟(c)。此種比例考慮了各個自身抗原的具體封裝效率。
[0076] 在另一實施方案中,本發(fā)明涉及通過上述方法獲得的封裝自身抗原的脂質體。
[0077] 本領域已知的其它方法也可用于獲得本發(fā)明的封裝自身抗原的脂質體。例如,一 些實施方案涵蓋了首先獲得脂質體以及然后封裝自身抗原。本領域存在熟知的方法以將化 合物封裝在脂質體內(參見Maurer N.et al.,Expert Opin Biol Ther,2001,vol. 1(6), p.923-47;ffaterhouse D.N.et al.,Methods Enzymol.,2005;vol.391,p.40-57;Urban P.et al.,Nanosc.Res.Lett.,2011,vol.6,p.620)。
[0078] 本發(fā)明的另一方面提供了藥物組合物或獸用組合物,其包含治療有效量的前述權 利要求中任一項所限定的脂質體,以及其它合適的藥學或獸醫(yī)學可接受的賦形劑或載體。
[0079] 優(yōu)選地,本發(fā)明的組合物包含窄粒徑分布的脂質體,即,低的大小異質性 (heterogeneity)。在具體實施方案中,本發(fā)明的藥物組合物或獸用組合物包含具有700至 7000nm大小的脂質體,其中脂質體的膜包含22重量%至33重量%的?3以及摩爾比為0.8: 0.8:0.9至1.2:1.2:1.5的PS: PC: CH0L,以及形成脂質體的膜的脂質的總量相對自身抗原的 總量之間的重量比是20:1至3:1。
[0080] 優(yōu)選地,包含在本發(fā)明的組合物中的脂質體至少封裝與T1D相關的自身抗原。更優(yōu) 選地,自身抗原是源自胰島素的肽。更優(yōu)選地,自身抗原是選自SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2 的肽。
[0081] 在一個實施方案中,包含在本發(fā)明的組合物中的脂質體至少封裝與MS相關的自身 抗原。優(yōu)選地,自身抗原是源自MOG的肽。更優(yōu)選地,自身抗原是SEQ ID NO:3的肽。
[0082] 本發(fā)明還涵蓋了其中脂質體封裝多于一種自身抗原的組合物以及包含各自封裝 不同自身抗原的不同脂質體的組合物。優(yōu)選地,封裝在本發(fā)明的組合物中的脂質體中的所 有自身抗原與同一自身免疫病相關,優(yōu)選T1D或MS。在具體實施方案中,組合物包含封裝SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2的兩種肽的脂質體。在另一實施方案中,組合物包含封裝SEQ ID NO: 1的肽的脂質體和封裝SEQ ID NO: 2的肽的脂質體。在另一實施方案中,組合物以具有 SEQ ID N0:1的脂質體與具有SEQ ID N0:2的脂質體的以下重量比包含封裝SEQ ID N0:1的 肽的脂質體和封裝SEQ ID NO:2的肽的脂質體:10:1至1:10,特別是5:1至1:5,更特別是2:1 至1:2,以及優(yōu)選1:1。
[0083] 在本發(fā)明中,術語"藥學可接受的賦形劑或載體"指藥學可接受的材料、組分或媒 介物。從與藥物組合物的其它成分相容的意義上來說,各組分必須是藥學可接受的。還必須 適合用于與人和動物的組織或器官接觸,而沒有與合理的效益/風險比相比過度的毒性、刺 激性、過敏性應答、免疫原性或其它問題或并發(fā)癥。同樣地,術語"獸醫(yī)學可接受的"意指適 合用于與非人的動物接觸。
[0084] 本發(fā)明的組合物的劑型極大地取決于施用途徑。在本發(fā)明的一個實施方案中,患 者口服施用封裝自身抗原的脂質體??诜M合物包括片劑、粉劑、膠囊、藥囊以及液體糖漿 劑、混懸劑和酏劑,其所有均可通過本領域熟知的方法配制。還可通過靜脈內途徑、動脈內 途徑、腹膜內(i.P.)途徑、皮下途徑、肌內途徑或皮膚內途徑向患者施用封裝自身抗原的脂 質體。適合這些施用途徑的組分也是本領域熟知的,并且包括用于注射的溶液、用于灌注的 溶液、用于液體注射的復溶粉劑以及預裝注射器。從本發(fā)明的意義上來說,還適合于配制用 于以下的封裝自身抗原的脂質體:鼻內施用或吸入施用、直腸施用或例如,乳霜、凝膠、軟膏 或皮膚貼劑形式的局部施用。用于制備這些制劑的方法是本領域已知的。而且,可將封裝自 身抗原的脂質體配制為控釋劑型。控釋劑型是本領域已知的,并且對于治療慢性疾病或施 用在高劑量下可能有毒或當向患者施用時顯示低半衰期模式的活性劑是特別可取的。
[0085] 本文使用的表述"治療有效量",指當施用時,足以防止要處理的疾病的一個或多 個癥狀的發(fā)展或在某種程度上減輕要處理的疾病的一個或多個癥狀的化合物的量。根據本 發(fā)明施用的化合物的具體劑量當然應通過圍繞病例的具體情況確定,包括施用的化合物、 封裝效率、施用的途徑以及類似考慮因素。
[0086] 正治療的具體自身免疫性病況對待施用的化合物的具體劑量起重要作用。在一個 實施方案中,待預防或治療的自身免疫病選自:T1D、紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、 愛迪生氏病、乳糜瀉、皮肌炎、橋本氏甲狀腺炎、重癥肌無力、惡性貧血、反應性關節(jié)炎、自身 免疫性溶血性貧血、自身免疫性中性粒細胞減少癥、格雷夫斯病、銀肩病、銀肩病性關節(jié)炎 以及干燥綜合征。在優(yōu)選實施方案中,自身免疫性病況是T1D。
[0087] 而且,正治療的自身免疫性病況的臨床階段還需要將確定待施用的封裝自身抗原 的脂質體的合適劑量考慮在內。如已提到的,本發(fā)明的脂質體可用于預防和治療自身免疫 病。"預防",應被理解為預防對自身抗原的異常免疫應答,由此不會觸發(fā)異常免疫應答背后 的致病事件。"治療",應被理解為處理異常免疫應答背后的持續(xù)致病事件且隨后減輕存在 的任何一個臨床癥狀。這包括治療盡管具有自身免疫應答和一些組織損傷,但不顯示臨床 癥狀或僅顯示自身免疫病的很少臨床癥狀的患者中的自身免疫性病況。該階段通常被稱為 "臨床前"階段,并且是大多數(shù)自身免疫病的典型階段,例如在T1D中,將其稱為前驅糖尿病。 在前驅糖尿病中,胰腺B細胞在某種程度上受損,但僅滿足糖尿病的某些診斷標準。可以用 本發(fā)明的基于脂質體的免疫療法有效治療該階段的疾病,如由下文所描述的實驗中獲得的 結果所支持。此外,也可通過施用有效量的本發(fā)明的封裝自身抗原的脂質體來有效治療其 中組織損傷高且臨床癥狀明顯的晚期自身免疫病。
[0088]本發(fā)明的一個實施方案涉及自身免疫病的預防,而另一實施方案涉及疾病的治 療。另一具體實施方案涉及臨床前階段的自身免疫病的治療。
[0089]在優(yōu)選實施方案中,本發(fā)明提供了用于預防T1D的如上所限定的脂質體或者藥物 組合物或獸用組合物。在另一優(yōu)選實施方案中,將如上所限定的脂質體或者藥物組合物或 獸用組合物用于T1D的治療。在另一優(yōu)選實施方案中,將如上所限定的脂質體或者藥物組合 物或獸用組合物用于前驅糖尿病對象中的T1D的治療。
[0090] 在一個實施方案中,本發(fā)明提供了用于預防MS的如上所限定的脂質體或者藥物組 合物或獸用組合物。在另一實施方案中,將如上所限定的脂質體或者藥物組合物或獸用組 合物用于MS的治療。
[0091] 總之,鑒于數(shù)種情況確定待施用的封裝自身抗原的脂質體的劑量。僅作為示例性 實例,當使用包含脂質摩爾比為1:1:1.33(PS:PC:CH0L)的PS、PC和CH0L的本發(fā)明的MVV脂質 體時,用于治療患有前驅糖尿病階段的T1D的人對象的治療有效量可以是0.05至50mg封裝 自身抗原的脂質體/kg體重,優(yōu)選0.5至5mg封裝自身抗原的脂質體/kg體重,所述MVV脂質體 封裝脂質與抗原重量比為11,6:1 (脂質的總量相對自身抗原的總量)的SEQ ID NO: 1的TD1 相關自身抗原。當將SEQ ID N0:2以脂質與抗原重量比3.8:1封裝在如上所限定的脂質體中 封裝時,用于治療患有前驅糖尿病階段T1D的人對象的治療有效量可以是0.05至50mg封裝 自身抗原的脂質體/kg體重,優(yōu)選0.5至5mg封裝自身抗原的脂質體/kg體重。當使用包含如 上所限定的兩種類型脂質體的組合物時,優(yōu)選SEQ ID NO: 1的脂質體與SEQ ID N0:2的脂質 體重量比為1:1,用于治療患有前驅糖尿病階段的T1D的人對象的治療有效量還可以是0.05 至50mg封裝自身抗原的脂質體/kg體重,優(yōu)選0.5至5mg封裝自身抗原的脂質體/kg體重。
[0092] 而且,為了預防或治療自身免疫病,醫(yī)學專家將會確定向患者施用多少劑量的藥 物。在該方面,發(fā)明人發(fā)現(xiàn),僅一個劑量的本發(fā)明的封裝自身抗原的脂質體就可以有效治療 前驅糖尿病小鼠中的T1D。然而,醫(yī)學專家可以決定,需要更多劑量以治療晚期疾病。在一個 實施方案中,通過向患者施用一至五個劑量的所述脂質體或藥物組合物,將如上所限定的 脂質體或者藥物組合物或獸用組合物用于自身免疫病(優(yōu)選T1D)的預防或治療。在具體實 施方案中,通過施用一個、兩個,三個或四個劑量實現(xiàn)預防或治療。在另一實施方案中,通過 向患者施用一個、兩個、三個、四個或五個劑量的所述脂質體或藥物組合物,將如上所限定 的脂質體或者藥物組合物或獸用組合物用于T1D的治療。在優(yōu)選實施方案中,患者是前驅糖 尿病患者。
[0093] 因為通過封裝的自身抗原的致耐受性遞呈以及隨后自身免疫性應答的抑制,實現(xiàn) 了預防或治療效果,本發(fā)明的最后方面涉及用于恢復自身耐受性以及用于抑制自身免疫應 答的如上所限定的脂質體或藥物組合物或獸用組合物。在本發(fā)明的這些方面的具體實施方 案中,自身耐受性的恢復以及自身免疫性應答的抑制是在T1D的情況中,更具體地在前驅糖 尿病的情況中。
[0094]在整個說明書和權利要求書中,詞語"包含"及其變體不是旨在排除其它技術特 征、添加物、組分或步驟。而且,詞語"包含"涵蓋了"由……組成"的情況。當查閱說明書時, 本發(fā)明的其他目標、優(yōu)點和特征對本領域技術人員而言將是顯而易見的或者可通過本發(fā)明 的實踐獲悉。通過示例的方式提供下述實施例和附圖,并且它們不是旨在限制本發(fā)明。涉及 附圖且置于權利要求書的圓括號中的參考標記只是試圖增加權利要求書的可理解性,并且 不應當被解釋為限制權利要求書的范圍。而且,本發(fā)明涵蓋了本文所描述的具體實施方案 和優(yōu)選實施方案的所有可能組合。 實施例
[0095] 材料和方法:
[0096]脂質體的制備
[0097] 磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰膽堿(PC)購自Lipoid,Ste inhausen,Switzer land。膽 固醇(CHOL)購自Sigma Aldrich,Saint Louis,USA。綴合脂質的熒光染料俄勒岡綠488DHPE 購自Invitrogen,California,USA。Alexa Fluor 750以其琥泊酰亞胺酯的形式獲自 Invitrogen并且與由 Avanti Polar Lipids (Alabaster,USA)供應的脂質DOPE綴合。分別源 自胰島素 A鏈和胰島素 B鏈的SEQ ID N0:1(GIVDQCCTSICSLYQLENYCN)和SEQ ID N0:2 (FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPMS)的肽獲自Genosphere Biotechnologies(Paris, France),純度>95%并且移除了三氟乙酸(tfa)。源自髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(M0G)的SEQ ID N0:3(YRSPFSRWHLYRNGK)的肽獲自 Institut de Recerca Biomgdica de Barcelona, IRBB,Barcelone,Spain。
[0098] 利用薄膜水化法,從摩爾比為1:1:1.33的各PS、PC和CHOL的脂質混合物制備脂質 體(Harel-Adar 1',2011)。全部脂質的量是30禮。將脂質和綴合脂質的熒光染料溶于氯仿中 并通過在真空和氮氣下進行蒸發(fā)移除溶劑。將脂質與合適的緩沖液(PBS,SEQ ID NO: 1或 SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3的肽分別于PBS中的0.5mg/mL溶液)水化,并通過擠壓機(Lipex Biomembranes,Vancouver,Canada)使由此獲得的脂質體均質化至Ιμπι。通過離心,將未封裝 的肽從脂質體制劑移除。在未稀釋的樣品中,利用Malvern Zetasizer (Malvern Instruments,UK),通過動態(tài)光散射(DLS)測量脂質體的粒徑分布和穩(wěn)定性,被表述為ζ電勢 (ζ)。在JE0L-JEM 1400顯微鏡中,利用低溫透射電子顯微鏡(cryo-TEM)檢查脂質體的形態(tài) 和片層。
[0099] 小鼠
[0100]野生型N0D小鼠獲自Jackson Laboratory(Bar Harbor,ME,USA)并在無特定病原 的條件下飼養(yǎng)。使用僅8周齡的雌鼠。
[0101 ] 小鼠購自Harlan Laboratories(Italy)并在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。使用僅8-10周齡的 雌鼠。為了誘導EAE,在氯胺酮(50mg/kg體重)和賽拉嗪(5mg/kg體重)下,使8周齡的C57BL/6 雌性小鼠(Harlan)在兩側接受皮下注射50yg M0G肽,所述M0G肽在PBS中,在等體積的含 4mg/ml結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA(Difco,Detroit,MI,USA)的完 全弗氏佐劑(CFA)中乳化。此外,在第0天和第2天,靜脈內注射250ng百日咳毒素 (Sigma Chemical)〇
[0102]嚴格根據加泰羅尼亞政府(Generalitat de Catalunya,Catalan Government)的 實驗動物管理和使用指南的推薦,進行該研究。方案經德國Trias i Pujol研究所的動物實 驗倫理委員會批準(許可號:DAAM5157)。
[0103] 樹突狀細胞(DC)的產生和攝取實驗
[0104] 如之前所報道的(Marin-Gallen,Clinical and Experimental Immunology 2010),在含有GM-CSF( lOOOU/ml;Prospec,Rehovot,Israel)的培養(yǎng)基中,從NOD小鼠的骨髓 祖細胞產生DC。通過如所述的⑶llc_PECy7染色(BD Pharmingen) (Pujol-Autinell I,et al.PLOS ONE 2013)評估DC的純度。通過如之前所報道的膜聯(lián)蛋白和7aad染色(?幻〇1-Autonell I et al.PLOS ONE, 2013)測定活力,并且通過流式細胞術(Perfect Count Microspheres,Cytognos,Salamanca,Spain)對細胞進行計數(shù)。通過將DC與脂質體微粒(空 的或載有胰島素肽)共培養(yǎng)2小時進行脂質體的捕獲。對于這些實驗,采用被稀釋至100-1000μΜ的脂質體微粒的儲備液(30mM)。將對照DC在基礎條件下培養(yǎng)以獲得未成熟DC(iDC) 或用LPS(100ng/ml;Sigma)刺激24小時以獲得成熟DC(mDC)。用熒光標記的PS-脂質體(俄勒 岡綠488DHPE,Invitr 〇gen)測定被DC體外攝取的PS-脂質體。用roS大量洗滌以移除附著于 細胞膜的脂質體之后,通過流式細胞術(FACSCanto II,BD Biosciences)測定脂質體的捕 獲。
[0105] 在脂質體捕獲之后在DC中的致耐受性特征
[0106] 通過流式細胞術分析(FACSCanto II)來測定DC共刺激膜分子⑶40和⑶86的表達。 用針對小鼠〇)11(3^^-〇77工040/^?(:、0)86^^的單克隆抗體(80?1^這丨即611)對0(:進行染 色。將同種型對照的染色用作對照。利用CellQuest軟件(BD Biosciences)對數(shù)據進行分 析?;赑GE2在凋亡細胞的耐受性誘導中的作用的先前結果(Pujol-Autonell PL0S ONE 8: e63296,2013),在不同的培養(yǎng)物上清液中,通過ELISA評估在DC進行PS-脂質體捕獲之后 PGE2的產生(PGE2EIA Kit-Monoclonal ;Cayman Chemicals,Ann Arbor,MI)。檢測限:80% Β/Β0:15pg/ml。靈敏性:50%B/B0:50pg/ml。將結果表述為指數(shù)(pg PGE2/106個細胞)。
[0107] T細胞增殖分析
[0108]在2小時期間,使DC載有ImM脂質體(空的或載有胰島素肽(20μg/ml胰島素(Sigma, St Louis,M0,USA)),然后用于測定T細胞增殖。如所描述的(Pujol-Autonell,PL0S ONE 2013),對N0D脾臟進行機械破碎之后獲得T細胞,利用針對CD19-PE、CD16/32-PE、CDllc-PECy7(BD Pharmingen)、CDllb_PE(ImmunoTooIs GmbH,Friesoythe,Germany)和Ly_6G(Gr_ l)-eFluor660(eBioscience,CA,USA)的抗體,通過負選擇進行純化,并進行分選(FACSAria II,BD Biosciences)。將單獨或者用空PS-脂質體或封裝自身抗原的脂質體脈沖的DC(10, 000個細胞)與105個T淋巴細胞培養(yǎng)(1: 10的比例)。6天之后,將細胞用lyCi(3H)_胸苷 (Perkin Elmer,Waltham,MA,USA)脈沖另外 16小時。將細胞收集(Harvester 96,Tomtec Inc ·,Hamden,CT, USA)并利用閃爍計數(shù)儀(1450Microbeta,TriluxWal lac,Turku, Finland) 進行分析。將T細胞的增殖表述為c.p.m x 103個細胞。
[0109] 1型糖尿病免疫療法(預防和治療)
[0110]給予前驅糖尿病N0D小鼠(8周齡)含3mg PS-脂質體(空的或封裝比例1:1的SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2的肽)的200μ1鹽溶液的單一腹膜內劑量。還包括僅接受鹽溶液的假對 照組(sham-control group)。每組使用總計12-18只動物。在30周期間,利用Glucocard條 (Menarini,BarceIona,Spain)每日監(jiān)測小鼠的尿糖,以及每周監(jiān)測小鼠體重。當血糖水平〉 300mg/dl時,具有糖尿的動物被確診患有糖尿病。 在疾病發(fā)作之后1天、5天和8天,用含3.5mg PS-脂質體(空的或封裝比例1:1的SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2的肽)的200μ1鹽溶液的3個劑量腹膜內治療糖尿病N0D小鼠(>25周 齡)。在30周期間,利用Glucocard條(Menarini,Barcelona,Spain)每日監(jiān)測小鼠的尿糖。當 連續(xù)的血糖水平高于200mg/dL或當測量值高于300mg/dL時,具有糖尿的動物被確診患有糖 尿病,并且確定疾病的發(fā)作。每周監(jiān)測血糖水平(AccuCheck, Roche Diagnostics, Indianapolis,IN)。從疾病發(fā)作起施用每日皮下(s · c ·)注射胰島素(11],1]181113七31(1?16叉-Pen,Nov〇-Nordisk,Bagsvaerd,Denmark),除非如果能實現(xiàn)正常的血糖。每周監(jiān)測三次血糖 (AccuCheck,Roche Diagnostics,Indianapolis,IN),所述監(jiān)測在禁食2小時之后進行。 [0112]胰島炎得分
[0113]在研究結束時,通過白細胞-胰島炎-確定胰島浸潤的程度。簡言之,將來自各組的 所有小鼠的胰腺在異戊烷/冷丙酮浴中速凍。在5個非重疊水平面獲得5μπι的冰凍切片。將切 片用蘇木精/伊紅染色,編碼并由對實驗情況不知情的2個獨立觀察者進行分析。每個觀察 者評估每一動物的最少40個胰島。如在別處所述(Alba A,J Immunol 2004;173:6667-75), 對胰島炎進行評分:〇,無胰島炎;1,周邊胰島的;2,輕度胰島炎(浸潤的胰島〈25%) ;3,25-75 %的胰島浸潤;4,全部胰島浸潤。
[0114] EAE的免疫療法
[0115] C57BL/6免疫小鼠經常被用作EAE疾病的模型,所述疾病與MS密切相關且常常用于 檢驗針對MS的療法和治療。為了防止EAE的發(fā)展,在免疫后5天和9天,用含1.75mg載有 M0G40-55的PS-脂質體的100μ1鹽溶液的2個劑量腹膜內治療C57BL/6免疫小鼠。作為對照, 用空脂質體(PS-脂質體)或PBS(假)治療小鼠。
[0116] 對所有動物進行稱重,并且每日檢查被治療小鼠的福利和臨床狀態(tài)以及神經學體 征。如在別處所描述的[Espejo 2001,同上],根據下述標準(Espejo C,et al.,Exp Neurol 2001),進行EAE的臨床評分:0,無癥狀;0.5,下半尾巴張力喪失;1,全部尾巴張力喪失;1.5, 后肢無力;2,后肢麻痹;2.5,后肢截癱;3,前肢無力;4,四肢輕癱;4.5,嚴重的四肢輕癱;5, 四肢癱瘓;以及6,死亡。由兩個不同的觀察者,以盲的方式進行臨床隨訪分析。
[0117]腹膜內施用之后追蹤脂質體
[0118]為了生物成像實驗,將熒光標記的PS-脂質體(Alexa Fluor 750)腹膜內注射進前 驅糖尿病N0D小鼠并觀察3天。在施用的時刻以及在注射后6小時、24小時、48小時和72小時, 在麻醉的情況下(Pearl Imager,Li-Cor)使小鼠成像。對焚光信號進行定量。在實驗結束 時,獲得數(shù)個器官、稱重并成像以測定熒光分布。
[0119] 統(tǒng)計學分析
[0120] 利用Prism 5.0軟件(GraphPad軟件公司,San Diego,CA)進行統(tǒng)計。對于配對數(shù) 據,進行非參數(shù)Wilcoxon檢驗。否則,使用曼惠特尼檢驗。p值〈0.05被認為是顯著的。
[0121] 結果
[0122] 通過DC捕獲封裝胰島素肽的PS遞呈脂質體
[0123] 以摩爾比為1:1:1.33的?3:?(::〇101^制備?3-脂質體以在其表面呈現(xiàn)'死亡信號' PS??罩|體呈現(xiàn)1.014μπι的平均粒徑,所述粒徑是為了被樹突狀細胞(Ulrich AS, Bioscience Reports 22:129-150,2002)有效攝取的最佳大小,具有0.321的多分散指數(shù) (Pdl)。此外,ζ電勢的測量揭示了 PS-脂質體上-30.66mV的凈表面電荷。另一方面,當PS-月旨 質體封裝來自小鼠胰島素2的SEQ ID ΝΟ:1或SEQ ID NO:2的肽時,對于SEQ ID ΝΟ:1和SEQ ID NO: 2的肽,脂質體分別顯示1.062ym(PdI =0.324)和0.954ym(PdI =0.309)的平均直徑 (圖1)。至于ζ電勢,兩種封裝脂質體均呈現(xiàn)-29.5mV的負表面電荷。對于SEQ ID N0:1的肽, 封裝百分比是44.63±23.68%,對于SEQ ID N0:2肽,封裝百分比是88.48±3.97%(平均值 土 SD)。封裝SEQ ID NO: 3肽的PS-脂質體具有942.2nm的平均直徑和-33.66mV的ζ電勢。SEQ ID NO: 3的封裝效率是89.34±4.69 %。通過cryo-TEM分析,觀察到大多數(shù)脂質體(空的或封 裝肽)是多囊狀囊泡(MVV)。在共培養(yǎng)之后,PS-脂質體被DC吞食(圖2)。
[0124] 在捕獲封裝胰島素肽的PS-脂質體之后DC的共刺激分子的表達減少且產生PGE2
[0125] 即使在促炎刺激之后,共培養(yǎng)之后的DC的活力總是與對照DC類似(圖3A),與劑量 無關(范圍100-2000mM,數(shù)據未示出)。
[0126] 評估DC的表面上兩種共刺激分子⑶40和⑶86的表達(圖3B)。觀察到,在脂質體捕 獲之后,細胞膜上⑶40和⑶86的表達未增加,保持低的水平。LPS暴露之后,DC顯著地增加了 CD40和CD86的表達,以及載有PS-脂質體的DC顯著地增加了 CD86的表達(?〈0.001),但未增 加⑶40的表達。相比之下,PSAB-脂質體未顯著地增加⑶40或⑶86的膜表達。
[0127] 基于以前的結果(Pujol-Autonell,PLOS ONE 2013),檢查由在DC中的脂質體誘導 的PGE2的產生。當與iDC比較時,在與脂質體(空的或載有胰島素肽)共培養(yǎng)的DC的上清液中 PGE2的濃度顯著增加(p〈0.05)(圖3C)。
[0128] 在捕獲封裝胰島素肽的PS-脂質體之后DC刺激自體T細胞增殖的能力受損
[0129] 基于DC標志物⑶1 lc的染色,產生自N0D小鼠骨髓祖細胞的DC純度>80%,并且活力 總是>90% J細胞的純度和活力分別總是超過90%和95% (數(shù)據未示出)。觀察到,當與單獨 的iDC相比時,通過iDC捕獲PS-脂質體或PSAB-脂質體未能增加自體T細胞的增殖(圖4)。在 LPS刺激之后,由mDC誘導的T細胞增殖比由iDC誘導的增殖高(p〈0.05)。相比之下,即使在這 些促炎刺激物的作用之后,由載有PS-脂質體或PSAB-脂質體的DC誘導的T細胞增殖未能增 加。結果表明,由PS-脂質體-DC誘導的T細胞的增殖未能增加,即使在這些促炎刺激物的作 用之后,由PS-脂質體-DC誘導的T細胞的增殖也未能增加。
[0130] 封裝胰島素肽的PS-脂質體有效治療N0D前驅糖尿病小鼠中的T1D
[0131] 為了評估脂質體在預防T1D中的功效,在前驅糖尿病期間,我們用單一劑量的免疫 療法治療N0D小鼠(8周齡)。如所預期,來自假對照組的動物從13周齡起患上糖尿病并具有 81.3%的最終發(fā)病率(n= 16)(圖5A)。用空PS-脂質體進行治療導致83.3%的疾病發(fā)生率(η = 18),所述疾病在15周齡開始。用封裝自身抗原胰島素肽的PS-脂質體進行治療導致疾病 的緩解,具有50%的發(fā)病率(n = 12),疾病也在15周齡開始。當與假對照組或空脂質體治療 組相比時,接受免疫療法的小鼠的體重未發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖5B)。
[0132] 胰島炎在用封裝胰島素肽的PS-脂質體治療的小鼠中降低
[0133] 在隨訪期結束時(30周),對來自各組的3-6只非糖尿病動物進行胰島炎的評分以 測定治療對胰島白細胞浸潤的任何效果(圖6A)。如所預期,假對照組中的動物顯示高的胰 島炎得分(2.34±0.18)。用空PS-脂質體治療的小鼠顯示類似的胰島炎程度(2.12±0.46)。 當與假對照組比較時,封裝胰島素肽的PS-脂質體的免疫療法表現(xiàn)出胰島炎得分的生物學 減少(盡管不顯著)(1.69±0.58)。而且,被歸類在五個浸潤類別的每一個中的胰島的百分 比的分析表明,在用免疫療法治療的小鼠中,47%的胰島保持無胰島炎或具有周邊胰島的, 而在假對照組和PS-脂質體組中,分別有26%和34%的胰島未被破壞(圖6B)。
[0134] 當在疾病發(fā)作之后施用時,載有胰島素肽的PS-脂質體能逆轉N0D小鼠中的糖尿病
[0135] 當在疾病發(fā)作之后施用時,載有胰島素肽的PS-脂質體逆轉N0D小鼠中的糖尿病 (圖8A)。在無外源施用胰島素的情況下,這些小鼠存活,實現(xiàn)正常水平的血糖。相比之下,盡 管持續(xù)施用胰島素,用空PS-脂質體治療的小鼠未能達到正常血糖(圖8B)。
[0136] 封裝M0G肽的PS-脂質體減輕了 EAE
[0137] 制備含有M0G肽(MS中的特異性自身抗原)的PS-脂質體。當在C57BL/6免疫小鼠中 進行腹膜內注射時,這些脂質體防止疾病的發(fā)展(圖9)。用裝填M0G肽的脂質體進行治療誘 導免疫小鼠脾臟中的經典調節(jié)性T細胞(涉及維持外周耐受性的細胞群體)的增加(結果未 示出hPS-脂質體和肽的封裝對于治療效果均是關鍵的,因為空脂質體沒有效果。因此,封 裝M0G肽的PS-脂質體可以減輕EAE,提供不太嚴重的首次攻擊且從惡化中迅速恢復。因此, 封裝M0G肽的PS-脂質體對MS的治療是有益的。
[0138] 腹膜內施用之后追蹤脂質體
[0139] 在免疫系統(tǒng)的不同器官中檢測來自脂質體的熒光信號。如所預期,脂質體位于胰 淋巴結、脾、胰腺以及縱隔淋巴結或副胸腺淋巴結(圖7)。
[0140]本申請中引用的參考文獻
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【主權項】
1. 脂質體,其封裝自身抗原,其中 (i) 所述脂質體具有500至15000nm的大??;以及 (ii) 所述脂質體的膜包含全部膜的脂質體組分的10重量%至40重量%的量的磷脂酰 絲氨酸(PS)。2. 如權利要求1所述的脂質體,其為多囊狀囊泡(MVV)。3. 如權利要求1-2中任一項所述的脂質體,其中所述PS的重量百分比是所述全部膜的 脂質體組分的22 %至33 %。4. 如權利要求1-3中任一項所述的脂質體,其中所述脂質體的膜還包含磷脂酰膽堿 (PC)和膽固醇(CHOL)。5. 如權利要求4所述的脂質體,其中所述脂質體的膜包含PS: PC: CHOL摩爾比為0.6: 0·6:0·7至1·5:1·5:1·8的PS、PC和CHOL。6. 如權利要求1-5中任一項所述的脂質體,其中形成所述脂質體的膜的脂質的總量相 對自身抗原的總量之間的重量比是20:1至3:1。7. 如權利要求1-6中任一項所述的脂質體,其中所述自身抗原具有5至50個氨基酸的大 小。8. 如權利要求1-7中任一項所述的脂質體,其中所述自身抗原是與選自以下的自身免 疫病相關的肽:1型糖尿病(T1D)、紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化(MS)、愛迪生氏病、 乳糜瀉、皮肌炎、橋本氏甲狀腺炎、重癥肌無力、惡性貧血、反應性關節(jié)炎、自身免疫性溶血 性貧血、自身免疫性中性粒細胞減少癥、格雷夫斯病、銀肩病、銀肩病性關節(jié)炎以及干燥綜 合征。9. 如權利要求8所述的脂質體,其中所述自身抗原與T1D相關,并且選自SEQ ID NO: 1和 SEQIDN0:2的肽。10. 如權利要求8所述的脂質體,其中所述自身抗原與MS相關,并且包含SEQ ID NO:3。11. 如權利要求1-10中任一項所述的脂質體,其封裝其他自身抗原,其中所有封裝的自 身抗原與同一自身免疫病相關。12. 藥物組合物或獸用組合物,其包含治療有效量的前述權利要求中任一項所限定的 脂質體,以及其它合適的藥學或獸醫(yī)學可接受的賦形劑或載體。13. 用作藥物的權利要求1-11中任一項所述的脂質體或權利要求12所述的藥物組合物 或獸用組合物。14. 用于預防或治療自身免疫病的權利要求1-11中任一項所限定的脂質體或權利要求 12所述的藥物組合物或獸用組合物。15. 用于恢復患有自身免疫病的患者的自身耐受性的權利要求1-11中任一項所限定的 脂質體或權利要求12所述的藥物組合物或獸用組合物。16. 如權利要求14-15任一項中的用途的所述脂質體或藥物組合物或獸用組合物,其中 所述自身免疫病選自:T1D、紅斑狼瘡、類風濕關節(jié)炎、多發(fā)性硬化、愛迪生氏病、乳糜瀉、皮 肌炎、橋本氏甲狀腺炎、重癥肌無力、惡性貧血、反應性關節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、自 身免疫性中性粒細胞減少癥、格雷夫斯病、銀肩病、銀肩病性關節(jié)炎以及干燥綜合征。17. 如權利要求16中的用途的所述脂質體或藥物組合物或獸用組合物,其中所述自身 免疫病是1型糖尿病或MS。
【文檔編號】A61K39/00GK106061502SQ201580007978
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年1月16日
【發(fā)明人】丹尼爾·馬斯波奇科馬瑪拉, 安東尼婭·瑪麗亞·卡諾薩拉比爾, 瑪爾塔·維沃斯皮, 厄瑪·普約爾奧特內爾, 胡安·維達格爾奧特內爾
【申請人】日耳曼人特里亞斯艾普霍爾健康科學研究院基金會, 卡塔拉納米科學與技術研究院基金會, 加泰羅尼亞調研高等研究學院(Icrea)
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