專利名稱：同工型雜質水平較低的生長激素及其拮抗劑的制備方法
技術領域：
本發(fā)明總的涉及制備所需多肽的重組方法。這些方法生成的多肽產物含有水平較低的同工型雜質。具體而言，本發(fā)明涉及(1)制備同工型雜質降低的生長激素的重組方法，以及(2)制備同工型雜質同樣降低的生長激素拮抗劑，諸如派格索曼(pegvisomant)，及其蛋白中間體的重組方法。更具體而言，通過本發(fā)明方法降低的同工型雜質分別為生長激素和生長激素拮抗劑(或其中間體)的三硫化物和des-phe同工型雜質。
背景技術：
派格索曼(Somavert；Pharmacia Corp.)為人生長激素受體拮抗劑。其是人生長激素(“hGH”)在結構上改變的類似物。派格索曼的蛋白組分/中間體(B-2036)的氨基酸序列與hGH的氨基酸序列區(qū)別在9個位置上。特定氨基酸取代如下H18D，H21N，G120K，R167N，K168A，D171S，K172R，E174S，和I179T。正如本領域充分認識的，第一個字母(即，H18D)表示hGH的序列在編號位置處的氨基酸(即，如H18D所示的氨基酸位置18)，其被第二個字母所示的氨基酸(即，H18D)所取代。因此，H18D表示在野生型hGH氨基酸序列的第18位氨基酸位置處的氨基酸His被氨基酸Asp取代。


圖1A示意性顯示派格索曼(PEG B-2036)的蛋白成分/中間體(B-2036)的氨基酸序列結構，星號表明聚乙二醇聚合物(“PEG”單元)連接的潛在位點。另外，派格索曼的蛋白成分/中間體(B-2036-沒有PEG單元連接)的氨基酸序列表在此識別成SEQ.ID.NO.1。相比而言，人生長激素的氨基酸序列表在此識別成SEQ.ID.NO.2。這兩個序列表均隨本發(fā)明一起提供。hGH的序列也可參見，Jorgensen等，“Quantifying biosynthetic human growth hormone in Escherichia coliwith electrophoresis under hydrophobic conditions(利用電泳在疏水性條件下定量測定大腸桿菌中的生物合成人生長激素)”，J.ChromatographyA 817205-214(1998)。
在結構上，派格索曼為主要有4-6個PEG單元與之共價結合的蛋白(含有191個氨基酸殘基)。派格索曼的蛋白成分/中間體(B-2036)的分子量為21,998道爾頓。派格索曼中各個PEG單元的分子量約為5000道爾頓。由此派格索曼的主要分子量約為42,000(4PEG單元/分子)，47,000(5PEG單元/分子)和52,000(6PEG單元/分子)道爾頓。
提到激動劑，無需受理論的約束，據信當單個hGH分子與其相鄰(和相同)的兩個受體分子結合時，內源性hGH激活其受體，誘導激素介導的受體同型二聚化。參見U.S.專利Nos.5,849,535和6,057,292。hGH的活性依賴于其結合兩個相鄰(和相同)受體的能力，這兩個受體跨越在相同hGH分子上的兩個單獨結合位點(位點1和位點2)。這些hGH結合位點命名為位點1和位點2，并編號為1和2以反映它們與介導hGH-依賴性同型二聚化的兩個相鄰(和相同)hGH受體結合的次序。
此外，無需受理論的約束，據信派格索曼選擇性結合到細胞表面上的人生長激素受體(“GH受體”)，其中它阻斷內源性人生長激素的結合，由此干擾人生長激素信號轉導。對派格索曼的蛋白部分(也稱“組分”或“中間體”)(相對于hGH)進行結構修飾，使得派格索曼競爭性阻斷hGH分子與hGH受體之間的相互作用。派格索曼結合到GH受體，因此自受體被占后阻斷GH結合。結構修飾防止受體二聚化，結果，信號轉導沒有發(fā)生。通過如此阻斷hGH分子和hGH受體之間所需的密切相互作用，派格索曼阻斷hGH-介導的hGH受體的同型二聚化，使派格索曼產生其拮抗劑活性。
該拮抗劑用于治療狀況，包括但不限于對外科手術，放療和/或其他常規(guī)醫(yī)學治療反應不足或不耐受這些療法的患者的肢端肥大癥。此外，對派格索曼的蛋白部分(PEG B-2036)進行結構修飾導致其對泌乳刺激素受體展現的結合親和性低于hGH，從而使因使用派格索曼而導致的不理想的泌乳有關的副作用最小化。
派格索曼的蛋白中間體(B-2036)是通過大腸桿菌菌株合成的，所述菌株已通過導入質粒而被遺傳修飾，而所述質粒攜帶生長激素受體拮抗劑(B-2036)的基因。然后，B-2036從微生物細胞中回收，并加以純化。純化的B-2036再被PEG化以制備派格索曼(PEG B-2036)。U.S.專利5,849,535和6,057,292描述了制備B-2036的方法，以及將一個或多個PEG單元與B-2036共軛的方法，盡管沒有詳細說明如何降低，減少，消除，逆轉和/或防止形成不可接受的高水平的三硫化物和des-phe同工型雜質。
利用常規(guī)重組生產方法制備B-2036所遭遇到的問題之一是形成其同工型雜質，諸如其des-phe和三硫化物同工型。在des-phe同工型雜質中，B-2036分子的氨基端苯丙氨酸丟失。參見圖1A描述了鄰近B-2036的氨基端苯丙氨酸殘基(即，由字母“F”所示)。在三硫化物同工型雜質中，B-2036分子含有額外的硫原子，其在分子內形成“三硫化物橋”。參見圖1B中的框。同樣，參見Andersson等，“Isolation andcharacterization of a trisulfide variant of recombinant human growthhormone formed during expression in Escherichia coli(分離和表征在大腸桿菌表達過程中形成的重組人生長激素的三硫化物變體)”，Int.J.Peptide Protein Res.47311-321(1996)和A.Jesperson等，“Characterisation of a trisulphide derivative of biosynthetic humangrowth hormone produced in Escherichia coli(表征大腸桿菌中生產的生物合成的人生長激素的三硫化物衍生物)”，Eur.J.Biochem.219365-373(1994)。無需受理論的約束，據信這些同工型雜質通常在細胞生長(即，發(fā)酵)和B-2036在遺傳修飾的宿主細胞中表達(合成和分泌)的過程中，和/或B-2036蛋白的提取和純化的過程中生成。
關于雜質，國際申請WO 94/24157(公布日1994年10月27日)公開了hGH的疏水性衍生物，其與天然hGH比較包含額外的硫原子。參見WO 94/24157第3頁第3-10行。hGH的疏水衍生物的額外硫原子形成了“三硫化物橋”，從而產生hGH三硫化物變體。參見WO 94/24157第7頁第11-16行。WO 94/24157進一步敘述了通過用半胱氨酸，谷胱苷肽，2-巰基乙醇或二硫蘇糖醇等巰基化合物處理hGH三硫化物變體而使該hGH三硫化物變體轉化回到其天然hGH形式。參見WO94/24157第4頁和第5頁。
國際申請WO 96/02570(公布日1996年2月1日)描述了另一方法，利用亞硫酸鈉，亞硫酸鉀，亞硫酸銨，或亞硫酸鎂或亞硫酸鈣等堿土金屬亞硫酸鹽，將hGH三硫化物變體轉化回到其天然形式。參見WO94/24157第4頁第17-21行。
國際申請WO 00/02900(公布日2000年1月20日)的發(fā)明名稱為“Method for the production of recombinant peptides with a low amountoftrisulfides(具有少量三硫化物的重組肽的生產方法)”，其論述了“在生產重組肽，如蛋白和小肽時減少三硫化物量的方法。本發(fā)明是基于下列意想不到的新發(fā)現在發(fā)酵過程中或發(fā)酵后，通過加入金屬鹽，優(yōu)選是過量加入，可降低重組肽生產中的三硫化物的量，而非如上文所述，通過將形成的生長激素的三硫化物轉化成天然形式”。(重點加入)。參見WO 00/02900第2頁第21-27行。WO 00/02900進一步敘述了“蛋白可以是任何重組蛋白，但優(yōu)選為人和動物的重組生長激素，諸如人生長激素(hGH)，牛生長激素(bGH)和豬生長激素(pGH)”。(重點加入)。參見WO 00/02900第3頁第4-6行。
國際申請No.WO 02/057478(公布日2002年7月25日)的發(fā)明名稱為“Methods and Composition For Extracting Proteins From Cells(從細胞提取蛋白的方法和組合物)”，涉及通過將宿主細胞與還原劑和去污劑接觸而從宿主細胞中釋放蛋白的方法。該文獻陳述了還原劑的目的是“便于蛋白以其天然構型回收”。參見WO 02/057478第2頁第16-18。此外，WO 02/057478描述了“一種或多種還原劑...還原二硫鍵和/或維持巰基為其還原形式?？墒褂萌魏芜@樣的還原劑。在優(yōu)選的實施方案中，所用的一種或多種還原劑選自二硫蘇糖醇(DTT)；二硫赤蘚糖醇(DTE)；半胱氨酸(CYS)和三2-羧基乙基膦(Tris2-carboxyethyphosphine)(TCEP)”。(重點加入)。參見WO 02/057478第3頁第24行至第4頁第4行。
然而，上述參考文獻未提及防止，反轉，減少，或消除與派格索曼或其蛋白部分B-2036等生長激素拮抗劑相關的同工型雜質的形成。因此，需要對B-2036的制備方法進行改進，以降低，減弱，防止，最小化，反轉和/或消除其同工型雜質的形成(三硫化物和/或des-phe)。同樣，這些參考文獻也未提及檢測，弱化，最小化，反轉，減少或消除生長激素的des-phe同工型雜質的形成。因此，需要對制備生長激素的方法進行改進，以降低，弱化，防止，最小化，反轉和/或消除其des-phe同工型雜質的形成。
附圖簡述圖1A描述了B-2036的氨基酸序列SEQ.ID.NO.1。圖1A中的星號(*)指出PEG單元與各個B-2036分子共價連接的9個潛在的位點。注意的是，雖然有9個可能的位點被鑒定，但不是所有的9個位點都必須與PEG單元共價結合。優(yōu)選地，每個B-2036分子有4-6個PEG單元。
圖1B描述了B-2036的三硫化物同工型雜質的結構(命名為“三硫化物(+32amu)”)，與其理想形式(命名為“天然GHA”)結構的比較。
發(fā)明概述鑒于上述需要提供改進的方法，用于制備重組生長激素激動劑，重組人生長激素激動劑，重組生長激素拮抗劑，和/或重組人生長激素拮抗劑，而其不理想的同工型雜質的水平降低，本發(fā)明涉及改進的方法用于生產重組生長激素(包括但不限于人生長激素)和重組生長激素拮抗劑(包括但不限于人生長激素拮抗劑)，而其des-phe和/或三硫化物同工型雜質的水平降低。
關于重組生長激素(包括但不限于hGH)，通過分別足量加入(1)螯合劑或(2)金屬鹽，降低了其des-phe同工型雜質的形成。
關于重組生長激素拮抗劑(包括但不限于人生長激素拮抗劑)，通過三硫化物同工型雜質分別與下列物質充分接觸，降低了其三硫化物同工型雜質(1)巰基化合物，(2)螯合劑，(3)金屬鹽，(4)巰基化合物與金屬鹽一起，或(5)與螯合劑接觸后但在缺乏螯合劑下的巰基化合物。
關于重組生長激素拮抗劑(包括但不限于人生長激素拮抗劑)，通過分別加入(1)螯合劑或(2)金屬鹽，降低其des-phe同工型雜質的形成。
優(yōu)選實施方案的詳述術語“生長激素拮抗劑”和“生長激素受體拮抗劑”包括(但不限于)的多肽抑制或拮抗生長激素與其生長激素受體結合以阻斷生長激素的生物學效應。優(yōu)選地，“生長激素拮抗劑”或“生長激素受體拮抗劑”為B-2036或其變體。這種“變體”包括但不限于，(分別)具有生長激素受體拮抗劑活性的其同系物(尤其是相對于B-2036具有保守性氨基酸替換，添加或缺失的同系物)，類似物，片段，假肽，抗體等。
術語“生長激素激動劑”和“生長激素受體激動劑”包括(但不限于)與其生長激素受體結合并活化該受體的多肽。優(yōu)選地，“生長激素激動劑”或“生長激素受體激動劑”為人生長激素或其變體。這種“變體”包括但不限于(分別)具有生長激素受體激動劑活性的其同系物(尤其是相對于人生長激素具有保守性氨基酸替換，添加或缺失的同系物)，類似物，片段，假肽，抗體等。
術語“生長激素及其拮抗劑”是指生長激素激動劑(即“生長激素”)和生長激素拮抗劑(即“及其拮抗劑”)。
如果合適或必要，在敘述一種方法對相關雜質的水平(例如，三硫化物或des-phe同工型雜質)生成所需的降低時，術語“和”可表示“和”或者“或”。
如果合適或必要，在敘述一種方法對相關雜質(例如，三硫化物或des-phe同工型雜質)的水平生成所需的降低時，術語“或”可表示“和”或者“或”。
如本發(fā)明所用，除非另外說明，術語“降低”(或其顯然變化)表示消除，最小化，減少，防止和/或弱化相關同工型雜質的量，不管其是三硫化物同工型雜質還是des-phe同工型雜質。
除非另外說明，術語“宿主細胞”(或其顯然變化)是指任何其中可形成重組B-2036或重組hGH的宿主細胞。因此，宿主細胞可以是哺乳動物宿主細胞，植物宿主細胞，或大腸桿菌(E.coli)或甚至是酵母細胞的微生物宿主細胞。值得注意的是，宿主細胞足以生長所需的重組B-2036蛋白組分或重組hGH。同樣，對宿主細胞是什么沒有限制，除了其能夠重組生產B-2036蛋白組分或目的重組hGH或其“變體”之外。
此外，如本發(fā)明所用，除非另外說明，術語“成長”(或其顯然變化，例如，生長)包括但不限于發(fā)酵和培養(yǎng)，或導致宿主細胞增殖足以生產所需量的重組B-2036蛋白組分或重組hGH。
此外，盡管本發(fā)明對重組B-2036和重組PEG B-2036進行了描述，但是除非另外說明，應理解本發(fā)明可采用任何重組生長激素激動劑，重組生長激素拮抗劑，不管其是哺乳動物生長激素或其拮抗劑，人生長激素或其拮抗劑，還是牛生長激素或其拮抗劑等。
派格索曼(PEG B-2036)是重組宿主細胞(例如，重組遺傳修飾的大腸桿菌宿主細胞)中生產的重組蛋白(B-2036)的PEG化形式。B-2036蛋白在細胞生長(例如，通過發(fā)酵)和表達(合成和分泌)過程中生產。生產后，分離B-2036(例如，通過均質化)，接著純化(例如，通過抽提，離心，反相色譜和陰離子交換層析和緩沖液交換)。然而，如上所述，在重組生產B-2036蛋白過程中，形成了不需要的B-2036的同工型雜質，即B-2036的三硫化物和des-phe同工型雜質。
如上所述，圖1A用標準單字母縮寫示出B-2036的氨基酸序列，表明哪種氨基酸存在于各個字母位置。為參考起見，下表1指明字母與其有關氨基酸之間的對應關系。
表1多肽氨基酸Ala(A)Glu(E)Gln(Q)Asp(D)Asn(N)Leu(L)Gly(G)Lys(K)Ser(S)
Val(V)Arg(R)Thr(T)Pro(P)Ile(I)Met(M)Phe(F)Tyr(Y)Cys(C)Trp(W)His(H)另外，B-2036的氨基酸序列在本發(fā)明中以SEQ.ID.NO.1所示，而hGH的氨基酸序列在本發(fā)明中以SEQ.ID.NO.2所示。
1.重組生長激素拮抗劑及其三硫化物同工型雜質。
圖1B說明了B-2036的三硫化物同工型雜質的氨基酸序列結構。具體而言，三硫化物同工型雜質在B-2036蛋白組分的位置182和189的半胱氨酸之間的橋中含有額外的硫原子。
a.用巰基化合物降低三硫化物同工型雜質無需受理論的約束，據信選定的巰基化合物與重組生長激素拮抗劑B-2036的三硫化物同工型雜質之間的接觸使得半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物橋轉化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式。另外，同樣無需受理論約束，巰基化合物的存在有可能防止三硫化物橋本身的進一步形成。
通常，巰基化合物加入到宿主細胞，其在生長過程中和/或生長之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長和接觸步驟進行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEG B-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見U.S.專利No.5,849,535。
任何巰基化合物可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其三硫化物同工型雜質一起接觸時，足以降低三硫化物同工型雜質的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產物。優(yōu)選的適用于本發(fā)明的巰基化合物包括但不限于亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
其他用于本發(fā)明的合適的巰基化合物示于下列參考文獻中(1)J.Houk和G.M.Whitesides，“Structure-Reactivity Relations forThiol-Disulfide Interchange(硫醇-二硫化物交換的結構-反應性關系)”，J.M.Chem.Soc.，1096825-6836(1987)；(2)Sigmund，M.，TheChemistry&Biochemistry of the Sulfhydro Group in Amino Acids(巰基在氨基酸中的化學&生物化學)，Peptides and Proteins，第1版，Pergamon，New York(1973)。具體而言，參見如上(1)項中Houk等所示的表II，列出了適用于本發(fā)明的示例性巰基化合物。
在合適的巰基化合物中，半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸(二聚化的半胱氨酸)的組合是最優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸(二聚化的半胱氨酸，如果有的話)的組合的量應足以使三硫化物同工型雜質降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，三硫化物同工型雜質的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。半胱氨酸與任何適用于本發(fā)明的胱氨酸的初始組合濃度優(yōu)選分別為至少大約0.1mM，大約0.1mM到大約10mM，或大約1mM到大約5mM。
優(yōu)選提供巰基化合物的緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會防止B-2036蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的緩沖液為Tris。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約4到大約9，大約7.5到大約8.5，或大約7.5到大約8.0。顯然，如果使用更高濃度的巰基化合物，可以耐受更高的pH水平，例如，高至大約9.5。因此，例如，如果對B-2036使用過量的半胱氨酸，則緩沖液的pH可高達大約9.5。
如上所述，優(yōu)選提供巰基化合物的緩沖液。此外，緩沖液中巰基化合物的量應使巰基化合物的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比為大約0.5到大約1,000。當所用的巰基化合物為半胱氨酸的組合，優(yōu)選半胱氨酸與胱氨酸的組合時尤其如此。此外，巰基化合物的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比可以分別為大約1到大約1,000，大約1到大約500，或大約1到大約10。
通常，在巰基化合物和B-2036蛋白組分(宿主細胞內或來自宿主細胞)之間充分接觸(以降低三硫化物同工型雜質的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約30mg/ml，大約0.5mg/ml到大約20mg/ml，或大約1mg/ml到大約10mg/ml。
此外，在巰基化合物加到宿主細胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長培養(yǎng)基與緩沖液，巰基化合物和其他內容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍應優(yōu)選維持在大約0℃到大約25℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約8℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細胞，生長培養(yǎng)基，緩沖液，巰基化合物和B-2036等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與巰基化合物之間的接觸時間應足以降低三硫化物同工型雜質的水平。用于降低三硫化物同工型雜質水平的合適接觸時間應示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時到大約24小時，或大約1小時到大約4小時。
通常，在巰基化合物與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約10升到大約500升，或100升到大約300升。其他合適的體積示例性為160升到大約500升。
在巰基化合物與B-2036組分之間接觸的過程中其他感興趣的參數包括混合比等?；旌媳葢阋孕纬删鶆虻幕旌衔?包括宿主細胞，其裂解液，緩沖液，巰基化合物，B-2036組分以及其他在同一生長培養(yǎng)基中的任何組分)，同時使形成的泡沫量最小化。本領域技術人員可輕易地確定，怎樣的混合比應是足夠的。顯然，混合比應使溫度維持在上述范圍內，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
b.用螯合劑降低三硫化物同工型雜質無需受理論約束，據信選定的螯合劑與下列物質的接觸會使半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物橋轉化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式或降低雜質的水平(1)三硫化物同工型雜質，(2)重組生長激素拮抗劑B-2036，(3)宿主細胞組分(對重組生產拮抗劑而言)，以及(4)上述(1)-(3)的全部組合。此外，同樣無需受理論約束，螯合劑的存在有可能防止三硫化物橋本身的進一步形成。
通常，螯合劑加入到宿主細胞，其在生長過程中和/或生長之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長和接觸步驟進行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEGB-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見U.S.專利No.5,849,535。
任何螯合劑可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其三硫化物同工型雜質一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時，足以降低三硫化物同工型雜質的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產物。適用于本發(fā)明的優(yōu)選螯合劑包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合劑包括但不限于去鐵敏(Deferoxamine)，二硫卡鈉(Ditiocarb Sodium)，EDTA鈣二鈉，EDTA二鈉，EDTA鈉，EDTA三鈉，青霉胺，噴替酸鈣鈉(Pentetate Calcium Trisodium)，噴替酸(Pentetic Acid)，二巰丁二酸(Succimer)，和曲恩汀(Trientine)。注意EDTA鈉是EDTA的鹽形式。
其他用于本發(fā)明的合適螯合劑示于下列參考文獻中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在合適的螯合劑中，EDTA是最優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的螯合劑的量應足以使三硫化物同工型雜質降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，三硫化物同工型雜質的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。適用于本發(fā)明的EDTA的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.01mM，大約0.01mM到大約100mM，大約0.1mM到大約20mM，大約2mM到大約10mM，或大約2mM到大約5mM。
優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會防止B-2036蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的緩沖液為Tris。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約6到大約9，大約6.5到大約7.5，或大約7.2到大約7.5。
如上所述，優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。此外，緩沖液中螯合劑的量應使螯合劑的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比為大約1到大約1,000。此外，螯合劑的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比可以分別為大約20到大約1,000，大約50到大約250，或大約60到大約110。
通常，在螯合劑和B-2036蛋白組分(宿主細胞內或來自宿主細胞)之間充分接觸(以降低三硫化物同工型雜質的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在螯合劑加到宿主細胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長培養(yǎng)基與緩沖液，螯合劑和其他內容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍應優(yōu)選維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。優(yōu)選地，在加入螯合劑(例如，EDTA)時，其溫度為大約4℃，而含有B-2036的勻漿的溫度在均質時會升至大約30℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細胞，生長培養(yǎng)基，緩沖液，螯合劑和B-2036等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與螯合劑之間的接觸時間應足以降低三硫化物同工型雜質的水平。用于降低三硫化物同工型雜質水平的合適接觸時間應示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時到大約48小時，或大約5小時到大約15小時。
通常，在螯合劑與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約10升到大約500升，或100升到大約300升。其他合適的體積示例性為160升到大約500升。
在螯合劑與B-2036組分之間接觸的過程中其他感興趣的參數包括混合比等?；旌媳葢阋孕纬删鶆虻幕旌衔?宿主細胞，其裂解液，緩沖液，螯合劑，B-2036組分以及生長培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時使形成的泡沫量最小化。本領域技術人員可輕易地確定，怎樣的混合比應是足夠的。顯然，混合比應使溫度維持在上述范圍內，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
C.用金屬鹽降低三硫化物同工型雜質無需受理論約束，據信選定的金屬鹽與下列物質的接觸會使半胱氨酸-S-S-S-半胱氨酸三硫化物橋轉化回到其半胱氨酸-S-S-半胱氨酸天然形式或降低雜質的水平(1)三硫化物同工型雜質，(2)重組生長激素拮抗劑B-2036，(3)宿主細胞組分(對重組生產拮抗劑而言)，以及(4)上述(1)-(3)的全部組合。此外，同樣無需受理論約束，金屬鹽的存在有可能防止三硫化物橋本身的進一步形成。
通常，金屬鹽加入到宿主細胞，其在生長過程中和/或生長之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長和接觸步驟進行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEGB-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見U.S.專利No.5,849,535。
任何金屬鹽可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其三硫化物同工型雜質一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時，足以降低三硫化物同工型雜質的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產物。適用于本發(fā)明的金屬鹽包括但不限于堿金屬鹽(alkali earth metal salt)，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。適用于本發(fā)明的優(yōu)選金屬鹽包括但不限于，磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
其他合適的金屬鹽示于下列參考文獻中(1)The Merck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck&Co.，Inc.，Therapeutic Category andBiological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagentsfor Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals and Laboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在用于本發(fā)明的合適金屬鹽中，磷酸鈉，ZnCl2及其組合也是優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的金屬鹽的量應足以使三硫化物同工型雜質降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，三硫化物同工型雜質的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。適用于本發(fā)明的金屬鹽(例如，磷酸鈉)的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.1mM，大約1mM到大約500mM，大約1mM到大約200mM，大約5mM到大約175mM，大約10mM到大約150mM，或大約25mM到大約100mM。
優(yōu)選提供金屬鹽的緩沖液。然而，磷酸鈉可充當緩沖液和合適的金屬鹽。其他合適的金屬鹽可加入磷酸鈉緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會防止B-2036蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約4到大約9，大約4.5到大約7.5，或大約5.5到大約7.5。
在金屬鹽提供在緩沖液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充當金屬鹽和緩沖液)以后，金屬鹽在緩沖液(或NaP溶液也充當緩沖液)中的量應使金屬鹽的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比為大約1到大約10,000。此外，金屬鹽的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比可以分別為大約300到大約10,000，大約500到大約5,000，或大約500到大約2500。
通常，在金屬鹽和B-2036蛋白組分(宿主細胞內或來自宿主細胞)之間充分接觸(以降低三硫化物同工型雜質的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在金屬鹽加到宿主細胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長培養(yǎng)基與緩沖液，金屬鹽和其他內容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍優(yōu)選應維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，在用金屬鹽(例如，NaP)均質時，勻漿的溫度可能上升。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細胞，生長培養(yǎng)基，緩沖液，金屬鹽，B-2036以及任選巰基化合物等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與螯合劑之間的接觸時間應足以降低三硫化物同工型雜質的水平。用于降低三硫化物同工型雜質水平的合適接觸時間應示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時到大約48小時，或大約5小時到大約15小時。
通常，在金屬鹽與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約100升到大約2,000升，或200升到大約1，500升。
在金屬鹽與B-2036組分之間接觸的過程中其他感興趣的參數包括混合比等?；旌媳葢阋孕纬删鶆虻幕旌衔?宿主細胞，其裂解液，緩沖液，金屬鹽，B-2036組分以及生長培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時使形成的泡沫量最小化。本領域技術人員可輕易地確定，怎樣的混合比應是足夠的。顯然，混合比應使溫度維持在上述范圍內，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
2.重組生長激素拮抗劑及其Des-Phe同工型雜質a.用螯合劑降低Des-Phe同工型雜質無需受理論約束，據信向重組生長激素拮抗劑B-2036中加入螯合劑導致des-phe同工型雜質水平的降低，或者使其水平真正減少，和/或防止進一步形成des-phe。
通常，螯合劑加入到宿主細胞，其在生長過程中和/或生長之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長和接觸步驟進行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEGB-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見U.S.專利No.5,849,535。
任何螯合劑可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其des-phe同工型雜質一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時，足以降低des-phe同工型雜質的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產物。適用于本發(fā)明的優(yōu)選螯合劑包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合劑包括但不限于Deferoxamine，Ditiocarb Sodium，EDTA鈣二鈉，EDTA二鈉，EDTA鈉，EDTA三鈉，青霉胺，Pentetate Calcium Trisodium，Pentetic Acid，Succimer，和Trientine。注意EDTA鈉是EDTA的鹽形式。
其他用于本發(fā)明的合適螯合劑示于下列參考文獻中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck&Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在合適的螯合劑中，EDTA是最優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的螯合劑的量應足以使des-phe同工型雜質降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，des-phe同工型雜質的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。適用于本發(fā)明的EDTA的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.01mM，大約0.01mM到大約100mM，大約0.1mM到大約20mM，大約2mM到大約10mM，或大約2mM到大約5mM。
優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會防止B-2036蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的緩沖液為Tris。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約6到大約9，大約6.5到大約7.5，或大約7.2到大約7.5。
如上所述，優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。此外，緩沖液中螯合劑的量應使螯合劑的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比為大約1到大約1,000。此外，螯合劑的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比可以分別為大約20到大約1,000，大約50到大約250，或大約60到大約110。
通常，在螯合劑和B-2036蛋白組分(宿主細胞內或來自宿主細胞)之間充分接觸(以降低des-phe同工型雜質的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在螯合劑加到宿主細胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長培養(yǎng)基與緩沖液，螯合劑和其他內容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍應優(yōu)選維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，優(yōu)選地，在加入螯合劑(例如，EDTA)時，其溫度為大約4℃，而含有B-2036的勻漿的溫度在均質時會升至大約30℃。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細胞，生長培養(yǎng)基，緩沖液，螯合劑和B-2036等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與螯合劑之間的接觸時間應足以降低des-phe同工型雜質的水平。用于降低des-phe同工型雜質水平的合適接觸時間應示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時到大約48小時，或大約5小時到大約15小時。
通常，在螯合劑與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約10升到大約500升，或100升到大約300升。其他合適的體積示例性為160升到大約500升。
在螯合劑與B-2036組分之間接觸的過程中其他感興趣的參數包括混合比等?；旌媳葢阋孕纬删鶆虻幕旌衔?宿主細胞，其裂解液，緩沖液，螯合劑，B-2036組分以及生長培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時使形成的泡沫量最小化。本領域技術人員可輕易地確定，怎樣的混合比應是足夠的。顯然，混合比應使溫度維持在上述范圍內，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
b.用金屬鹽降低Des Phe同工型雜質無需受理論約束，據信向重組生長激素拮抗劑B-2036中加入金屬鹽導致des-phe同工型雜質水平的降低，或者使其水平真正減少，和/或防止進一步形成des-phe。
通常，金屬鹽加入到宿主細胞，其在生長過程中和/或生長之后，合成所需的重組B-2036蛋白組分。此外，在生長和接觸步驟進行之后，優(yōu)選純化B-2036蛋白。其后，純化的蛋白優(yōu)選被PEG化以生成PEGB-2036(派格索曼)。PEG化步驟參見U.S.專利No.5,849,535。
任何金屬鹽可用于本發(fā)明，只要其與B-2036蛋白組分及其des-phe同工型雜質一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時，足以降低des-phe同工型雜質的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)B-2036產物。適用于本發(fā)明的金屬鹽包括但不限于堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。適用于本發(fā)明的優(yōu)選金屬鹽包括但不限于，磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
其他用于本發(fā)明的合適金屬鹽示于下列參考文獻中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在用于本發(fā)明的合適金屬鹽中，磷酸鈉，ZnCl2及其組合也是優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的金屬鹽的量應足以使des-phe同工型雜質降低至少大約10％形成的最高濃度(或其最高平均濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，des-phe同工型雜質的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高濃度(或其最高平均濃度)。適用于本發(fā)明的金屬鹽(例如，磷酸鈉)的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.1mM，大約1mM到大約500mM，大約1mM到大約200mM，大約5mM到大約175mM，大約10mM到大約150mM，或大約25mM到大約100mM。
優(yōu)選提供金屬鹽的緩沖液。然而，磷酸鈉可充當緩沖液和合適的金屬鹽。其他合適的金屬鹽可加入磷酸鈉緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會降解B-2036蛋白組分的形成。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約4到大約9，大約4.5到大約7.5，或大約5.5到大約7.5。
在金屬鹽提供在緩沖液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充當金屬鹽和緩沖液)以后，金屬鹽在緩沖液(或NaP溶液也充當緩沖液)中的量應使金屬鹽的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比為大約1到大約10,000。此外，金屬鹽的摩爾數與B-2036蛋白的摩爾數之比可以分別為大約300到大約10,000，大約500到大約5,000，或大約500到大約2500。
通常，在金屬鹽和B-2036蛋白組分(宿主細胞內或來自宿主細胞)之間充分接觸(以降低des-phe同工型雜質的水平)完成后，緩沖液中B-2036蛋白組分的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在金屬鹽加到宿主細胞或其含有B-2036蛋白組分的裂解液中后，生長培養(yǎng)基與緩沖液，金屬鹽和其他內容物(包括但不限于B-2036)一起的溫度范圍優(yōu)選應維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細胞和/或從中獲得的含有B-2036組分的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，在用金屬鹽(例如，NaP)均質時，勻漿的溫度可能上升。值得注意的是，B-2036蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細胞，生長培養(yǎng)基，緩沖液，金屬鹽，B-2036以及任選巰基化合物等)的溫度低于B-2036的蛋白變性溫度。
另外，B-2036組分與金屬鹽之間的接觸時間應足以降低des-phe同工型雜質的水平。用于降低des-phe同工型雜質水平的合適接觸時間應示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時到大約48小時，或大約5小時到大約15小時。
通常，在金屬鹽與B-2036組分之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約100升到大約2,000升，或200升到大約1,500升。
在金屬鹽與B-2036組分之間接觸的過程中其他感興趣的參數包括混合比等。混合比應足以形成均勻的混合物(宿主細胞，其裂解液，緩沖液，金屬鹽，B-2036組分以及生長培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時使形成的泡沫量最小化。本領域技術人員可輕易地確定，怎樣的混合比應是足夠的。顯然，混合比應使溫度維持在上述范圍內，并且使B-2036蛋白組分的任何降解最小化。
3.重組生長激素及其Des-Phe同工型雜質a.用螯合劑降低Des-Phe同工型雜質無需受理論約束，據信向重組生長激素中加入螯合劑導致des-phe同工型雜質水平的降低，或者使其水平真正減少，和/或防止進一步形成des-phe。
通常，螯合劑加入到宿主細胞，其在生長過程中和/或生長之后，合成所需的重組生長激素蛋白。此外，在生長和接觸步驟進行之后，優(yōu)選純化生長激素蛋白。
任何螯合劑可用于本發(fā)明，只要其與生長激素蛋白及其des-phe同工型雜質一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時，足以降低des-phe同工型雜質的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)生長激素產物。適用于本發(fā)明的優(yōu)選螯合劑包括但不限于EDTA，EGTA，和DTPA。其他示例性螯合劑包括但不限于Deferoxamine，Ditiocarb Sodium，EDTA鈣二鈉，EDTA二鈉，EDTA鈉，EDTA三鈉，青霉胺，Pentetate Calcium Trisodium，Pentetic Acid，Succimer，和Trientine。注意EDTA鈉是EDTA的鹽形式。
其他用于本發(fā)明的合適螯合劑示于下列參考文獻中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck & Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在合適的螯合劑中，EDTA是最優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的螯合劑的量應足以使des-phe同工型雜質降低至少大約10％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，des-phe同工型雜質的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高平衡濃度(或其最高平均平衡濃度)。適用于本發(fā)明的EDTA的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.01mM，大約0.01mM到大約100mM，大約0.1mM到大約20mM，大約2mM到大約10mM，或大約2mM到大約5mM。
優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會防止B-2306蛋白組分的形成或一旦其形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的緩沖液為Tris。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約6到大約9，大約6.5到大約7.5，或大約7.2到大約7.5。
如上所述，優(yōu)選提供螯合劑的緩沖液。此外，緩沖液中螯合劑的量應使螯合劑的摩爾數與生長激素蛋白(例如，hGH)的摩爾數之比為大約1到大約1,000。此外，螯合劑的摩爾數與生長激素蛋白(例如，hGH)的摩爾數之比可以分別為大約20到大約1,000，大約50到大約250，或大約60到大約110。
通常，在螯合劑和生長激素蛋白(例如，hGH)(宿主細胞內或來自宿主細胞)之間充分接觸(以降低des-phe同工型雜質的水平)完成后，緩沖液中生長激素蛋白(例如，hGH)的濃度分別為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在螯合劑加到宿主細胞或其含有生長激素蛋白的裂解液中后，生長培養(yǎng)基與緩沖液，螯合劑和其他內容物(包括但不限于生長激素蛋白)一起的溫度范圍優(yōu)選應維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細胞和/或從中獲得的含有生長激素蛋白的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，優(yōu)選地，在加入螯合劑(例如，EDTA)時，其溫度為大約4℃，而含有生長激素的勻漿的溫度在均質時會升至大約30℃。值得注意的是，生長激素蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細胞，生長培養(yǎng)基，緩沖液，螯合劑和生長激素蛋白等)的溫度低于生長激素的蛋白變性溫度。
另外，生長激素蛋白與螯合劑之間的接觸時間應足以降低des-phe同工型雜質的水平。用于降低des-phe同工型雜質水平的合適接觸時間應示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時到大約48小時，或大約5小時到大約15小時。
通常，在螯合劑與生長激素蛋白之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約10升到大約500升，或100升到大約300升。其他合適的體積示例性為160升到大約500升。
在螯合劑與生長激素蛋白之間接觸的過程中其他感興趣的參數包括混合比等。混合比應足以形成均勻的混合物(宿主細胞，其裂解液，緩沖液，螯合劑，生長激素蛋白以及生長培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時使形成的泡沫量最小化。本領域技術人員可輕易地確定，怎樣的混合比應是足夠的。顯然，混合比應使溫度維持在上述范圍內，并且使生長激素蛋白組分的任何降解最小化。
b.用金屬鹽降低Des-Phe同工型雜質無需受理論約束，據信向重組生長激素中加入金屬鹽導致des-phe同工型雜質水平的降低，或者使其水平真正減少，和/或防止進一步形成des-phe。
通常，金屬鹽加入到宿主細胞，其在生長過程中和/或生長之后，合成所需的重組生長激素蛋白組分。此外，在生長和接觸步驟進行之后，優(yōu)選純化生長激素蛋白。
任何金屬鹽可用于本發(fā)明，只要其與生長激素蛋白組分及其des-phe同工型雜質一起接觸(優(yōu)選足夠混合)時，足以降低des-phe同工型雜質的水平，優(yōu)選不降解(或基本上不降解)生長激素產物。適用于本發(fā)明的金屬鹽包括但不限于堿金屬鹽(alkali earth metal salt)，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。適用于本發(fā)明的優(yōu)選金屬鹽包括但不限于，磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
其他用于本發(fā)明的合適金屬鹽示于下列參考文獻中(1)TheMerck Index，第12版，S.Budavari(主編)，Merck&Co.，Inc.，TherapeuticCategory and Biological Activity Index(治療目錄和生物活性索引)，p.THER-19(“螯合劑”下)，Whitehouse Station，NJ(1996)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(2)Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Arthur Osol(主編)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania(1980)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(3)The United States Pharmacopeia，第21次修訂(第16版)，United States Pharmacopeial Convention，Inc.，Rockville，Maryland(1985)及其迄今為止的每個后續(xù)版本；(4)SIGMA，Biochemicals and Reagents for Life Science Research Catalogue，St.Louis，Missouri(2002-2003)；以及(5)Aldrich，Handbook of Fine Chemicals andLaboratory Equipment，Milwaukee，Wisconsin(2000-2001)及其(2002-2003)版。
在用于本發(fā)明的合適金屬鹽中，磷酸鈉，ZnCl2及其組合也是優(yōu)選的。適用于本發(fā)明的金屬鹽的量應足以使des-phe同工型雜質降低至少大約10％形成的最高濃度(或其最高平均濃度，其中多批次平均)。優(yōu)選地，des-phe同工型雜質的量分別降低至少大約20％，30％，40％，或50％形成的最高濃度(或其最高平均濃度)。適用于本發(fā)明的金屬鹽(例如，磷酸鈉)的初始濃度優(yōu)選分別為至少大約0.1mM，大約1mM到大約500mM，大約1mM到大約200mM，大約5mM到大約175mM，大約10mM到大約150mM，或大約25mM到大約100mM。
優(yōu)選提供金屬鹽的緩沖液。然而，磷酸鈉可充當緩沖液和合適的金屬鹽。其他合適的金屬鹽可加入磷酸鈉緩沖液。優(yōu)選地，適用于本發(fā)明的緩沖液不會防止B-2036蛋白組分的形成或一旦形成就被降解。適用于本發(fā)明的緩沖液包括但不限于Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。優(yōu)選的起始緩沖液濃度為大約1mM到大約200mM，更優(yōu)選大約5mM到大約100mM，甚至更優(yōu)選大約8mM到大約70mM，以及最優(yōu)選大約10mM到大約50mM。其他合適的緩沖液也可使用。優(yōu)選地，這些緩沖液足以維持生長培養(yǎng)基的pH，范圍分別為大約4到大約9，大約4.5到大約7.5，或大約5.5到大約7.5。
在金屬鹽提供在緩沖液(或在NaP的情形下，其中NaP溶液充當金屬鹽和緩沖液)以后，金屬鹽在緩沖液(或NaP溶液也充當緩沖液)中的量應使金屬鹽的摩爾數與生長激素蛋白(例如，hGH)的摩爾數之比為大約1到大約10,000。此外，金屬鹽的摩爾數與生長激素蛋白(例如，hGH)的摩爾數之比可以分別為大約300到大約10,000，大約500到大約5,000，或大約500到大約2500。
通常，在金屬鹽和生長激素蛋白(例如，hGH)(宿主細胞內或來自宿主細胞)之間充分接觸(以降低des-phe同工型雜質的水平)完成后，緩沖液中生長激素蛋白的濃度分別大約0.1mg/ml到大約20mg/ml，大約0.5mg/ml到大約5mg/ml，或大約1mg/ml到大約5mg/ml。
此外，在金屬鹽加到宿主細胞或其含有生長激素蛋白的裂解液中后，生長培養(yǎng)基與緩沖液，金屬鹽和其他內容物(包括但不限于生長激素蛋白)一起的溫度范圍優(yōu)選應維持在大約0℃到大約35℃。同樣，優(yōu)選地，宿主細胞和/或從中獲得的含有生長激素蛋白的裂解液的溫度分別維持在大約1℃到大約15℃，大約2℃到大約10℃，或大約2℃到大約15℃。注意，在用金屬鹽(例如，NaP)均質時，勻漿的溫度可能上升。值得注意的是，生長激素蛋白在大約40+℃發(fā)生變性。為此，理想的是維持勻漿(即，含有宿主細胞，生長培養(yǎng)基，緩沖液，金屬鹽，生長激素蛋白以及任選巰基化合物等)的溫度低于生長激素的蛋白變性溫度。
另外，生長激素蛋白與金屬鹽之間的接觸時間應足以降低des-phe同工型雜質的水平。用于降低des-phe同工型雜質水平的合適接觸時間應示例性分別為至少大約30分鐘，大約1小時到大約48小時，或大約5小時到大約15小時。
通常，在金屬鹽與生長激素蛋白之間充分接觸后，含有上述同樣成分的緩沖液的體積分別為大約1升到大約5,000升，大約100升到大約2,000升，或200升到大約1,500升。
在金屬鹽與生長激素蛋白之間接觸的過程中其他感興趣的參數包括混合比等。混合比應足以形成均勻的混合物(宿主細胞，其裂解液，緩沖液，金屬鹽，生長激素蛋白以及生長培養(yǎng)基中的其他任何組分的混合物)，同時使形成的泡沫量最小化。本領域技術人員可輕易地確定，怎樣的混合比應是足夠的。顯然，混合比應使溫度維持在上述范圍內，并且使生長激素蛋白組分的任何降解最小化。
本發(fā)明的實施方案1.在遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述包括下列步驟(a)將巰基化合物與所述雜質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量，其中所述雜質為所述多肽的三硫化物同工型。
2.實施方案1的方法，其進一步包括下列步驟(b)使所述宿主細胞生長以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過程中，進行所述生長。
3.實施方案2的方法，其進一步包括下列步驟
(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
4.實施方案3的方法，其進一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
5.實施方案2的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
6.實施方案1的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
7.實施方案5的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。
8.實施方案6的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。
9.實施方案7的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合接觸足夠的時間段以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
10.實施方案9的方法，其中所述時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
11.實施方案8的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述半胱氨酸接觸足夠的時間段以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
12.實施方案11的方法，其中所述時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
13.實施方案1的方法，其中所述巰基化合物提供在緩沖液中。
14.實施方案2的方法，其中所述巰基化合物提供在緩沖液中。
15.實施方案7的方法，其中所述半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合提供在緩沖液中。
16.實施方案8的方法，其中所述半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合提供在緩沖液中。
17.實施方案15的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液的起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為至少大約0.1mM。
18.實施方案16的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液的起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為至少大約0.1mM。
19.實施方案17的方法，其中所述起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為大約0.1mM到大約10mM。
20.實施方案18的方法，其中所述起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為大約0.1mM到大約10mM。
21.實施方案19的方法，其中所述起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為大約1mM到大約5mM。
22.實施方案20的方法，其中所述起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為大約1mM到大約5mM。
23.實施方案13的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
24.實施方案14的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
25.實施方案15的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
26.實施方案16的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
27.實施方案23的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
28.實施方案26的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
29.實施方案25的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
30.實施方案24的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
31.實施方案29的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
32.實施方案28的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
33.實施方案31的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
34.實施方案32的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
35.實施方案1的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
36.實施方案2的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
37.實施方案25的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
38.實施方案26的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
39.實施方案38的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液的起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為至少大約0.1mM。
40.實施方案37的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液的起始合并的半胱氨酸和胱氨酸濃度為至少大約0.1mM。
41.實施方案37的方法，其中所述緩沖液中半胱氨酸和胱氨酸的所述組合與所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約0.5到大約1000。
42.實施方案38的方法，其中所述緩沖液中半胱氨酸和胱氨酸的所述組合與所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約0.5到大約1000。
43.實施方案37的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約30mg/ml。
44.實施方案38的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約30mg/ml。
45.實施方案43的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約20mg/ml。
46.實施方案44的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約20mg/ml。
47.實施方案45的方法，其中所述B-2036濃度為大約1mg/ml到大約10mg/ml。
48.實施方案46的方法，其中所述B-2036濃度為大約1mg/ml到大約10mg/ml。
49.實施方案37的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
50.實施方案38的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
51.實施方案49的方法，其中所述pH為大約7.5到大約8.5。
52.實施方案50的方法，其中所述pH為大約7.5到大約8.5。
53.實施方案37的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約25℃的溫度。
54.實施方案38的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約25℃的溫度。
55.實施方案53的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約8℃。
56.實施方案54的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約8℃。
57.實施方案37的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為至少約30分鐘。
58.實施方案38的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為至少約30分鐘。
59.實施方案57的方法，其中所述時間為大約1小時到大約24小時。
60.實施方案58的方法，其中所述時間為大約1小時到大約24小時。
61.實施方案59的方法，其中所述時間為大約1小時到大約4小時。
62.實施方案60的方法，其中所述時間為大約1小時到大約4小時。
63.實施方案37的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
64.實施方案38的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
65.實施方案63的方法，其中所述體積為大約10L到大約500L。
66.實施方案64的方法，其中所述體積為大約10L到大約500L。
67.實施方案65的方法，其中所述體積為大約100L到大約300L。
68.實施方案66的方法，其中所述體積為大約100L到大約300L。
69.在含有細胞組分的基因修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素拮抗劑多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的三硫化物同工型。
70.實施方案69的方法，其進一步包括下列步驟(b)使所述宿主細胞生長以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過程中，進行所述生長。
71.實施方案70的方法，其進一步包括下列步驟(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
72.實施方案71的方法，其進一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
73.實施方案70的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
74.實施方案69的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
75.實施方案73的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
76.實施方案74的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
77.實施方案75的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述EDTA接觸的時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
78.實施方案77的方法，其中所述時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
79.實施方案76的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述EDTA接觸的時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
80.實施方案79的方法，其中所述時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
81.實施方案69的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
82.實施方案70的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
83.實施方案75的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
84.實施方案76的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
85.實施方案83的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
86.實施方案84的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
87.實施方案85的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
88.實施方案86的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
89.實施方案87的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
90.實施方案87的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
91.實施方案89的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
92.實施方案89的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
93.實施方案81的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
94.實施方案82的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
95.實施方案83的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
96.實施方案84的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
97.實施方案93的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
98.實施方案96的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
99.實施方案95的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
100.實施方案94的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
101.實施方案99的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
102.實施方案98的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
103.實施方案101的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
104.實施方案102的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
105.實施方案69的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
106.實施方案70的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
107.實施方案95的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
108.實施方案96的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
109.實施方案107的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
110.實施方案108的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
111.實施方案107的方法，其中所述緩沖液中的所述EDTA和所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
112.實施方案108的方法，其中所述緩沖液中的所述EDTA和所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
113.實施方案111的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
114.實施方案112的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
115.實施方案113的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
116.實施方案114的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
117.實施方案107的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
118.實施方案108的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
119.實施方案117的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
120.實施方案118的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
121.實施方案107的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
122.實施方案108的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
123.實施方案121的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
124.實施方案122的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
125.實施方案107的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
126.實施方案108的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
127.實施方案125的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
128.實施方案126的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
129.實施方案107的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
130.實施方案108的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
131.實施方案129的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
132.實施方案130的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
133.實施方案107的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
134.實施方案108的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
135.實施方案133的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
136.實施方案134的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
137.在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素拮抗劑多肽，(3)所述細胞組分，以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的三硫化物同工型。
138.實施方案137的方法，其進一步包括下列步驟(b)使所述宿主細胞生長以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過程中，進行所述生長。
139.實施方案138的方法，其進一步包括下列步驟(c)任選進一步使所述雜質與巰基化合物接觸，以及(c’)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
140.實施方案139的方法，其進一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
141.實施方案138的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。
142.實施方案137的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。
143.實施方案141的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
144.實施方案142的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
145.實施方案143的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
146.實施方案144的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
147.實施方案137的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述金屬鹽接觸的時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
148.實施方案147的方法，其中所述時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
149.實施方案138的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述三硫化物同工型與所述金屬鹽接觸的時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約10％。
150.實施方案149的方法，其中所述時間段足以使所述三硫化物同工型的量降低至少大約50％。
151.實施方案137的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
152.實施方案138的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
153.實施方案151的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
154.實施方案152的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
155.實施方案153的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
156.實施方案154的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
157.實施方案145的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
158.實施方案146的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
159.實施方案151的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
160.實施方案153的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
161.實施方案137的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
162.實施方案138的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
163.實施方案160的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
164.實施方案159的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
165.實施方案163的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
166.實施方案164的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
167.實施方案165的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
168.實施方案166的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
169.實施方案163的方法，其中所述緩沖液中的所述金屬鹽和所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
170.實施方案164的方法，其中所述緩沖液中的所述金屬鹽和所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
171.實施方案169的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
172.實施方案170的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
173.實施方案171的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
174.實施方案172的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
175.實施方案153的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
176.實施方案154的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
177.實施方案175的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
178.實施方案176的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
179.實施方案177的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
180.實施方案178的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
181.實施方案163的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
182.實施方案164的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
183.實施方案181的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
184.實施方案182的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
185.實施方案163的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
186.實施方案184的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
187.實施方案185的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
188.實施方案186的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
189.實施方案163的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
190.實施方案164的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
191.實施方案189的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
192.實施方案190的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
193.實施方案163的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
194.實施方案164的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
195.實施方案193的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
196.實施方案194的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
197.實施方案163的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
198.實施方案164的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
199.實施方案197的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
200.實施方案198的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
201.在含有細胞組分的基因修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素拮抗劑多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的des-phe同工型。
202.實施方案201的方法，其進一步包括下列步驟(b)使所述宿主細胞生長以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過程中，進行所述生長。
203.實施方案202的方法，其進一步包括下列步驟(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
204.實施方案203的方法，其進一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
205.實施方案202的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
206.實施方案201的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
207.實施方案205的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
208.實施方案206的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
209.實施方案207的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述EDTA接觸的時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
210.實施方案209的方法，其中所述時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
211.實施方案208的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述EDTA接觸的時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
212.實施方案211的方法，其中所述時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
213.實施方案201的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
214.實施方案202的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
215.實施方案207的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
216.實施方案208的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
217.實施方案215的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
218.實施方案216的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
219.實施方案217的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
220.實施方案218的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
221.實施方案219的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
222.實施方案220的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
223.實施方案221的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
224.實施方案222的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
225.實施方案213的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
226.實施方案214的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
227.實施方案215的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
228.實施方案216的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
229.實施方案225的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
230.實施方案226的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
231.實施方案227的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
232.實施方案228的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
233.實施方案229的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
234.實施方案230的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
235.實施方案233的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
236.實施方案234的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
237.實施方案201的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
238.實施方案202的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
239.實施方案227的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
240.實施方案228的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
241.實施方案239的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
242.實施方案240的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
243.實施方案239的方法，其中所述緩沖液中的所述EDTA和所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
244.實施方案240的方法，其中所述緩沖液中的所述EDTA和所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
245.實施方案243的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
246.實施方案244的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
247.實施方案245的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
248.實施方案246的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
249.實施方案239的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
250.實施方案240的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
251.實施方案249的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
252.實施方案250的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/m1。
253.實施方案249的方法，其中所述B-2036濃度為大約1mg/ml到大約10mg/ml。
254.實施方案250的方法，其中所述B-2036濃度為大約1mg/ml到大約10mg/ml。
255.實施方案239的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
256.實施方案240的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
257.實施方案255的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
258.實施方案256的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
259.實施方案239的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
260.實施方案240的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
261.實施方案259的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
262.實施方案260的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
263.實施方案239的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
264.實施方案240的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
265.實施方案263的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
266.實施方案264的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
267.實施方案239的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
268.實施方案240的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
269.實施方案267的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
270.實施方案268的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
271.在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素拮抗劑多肽，(3)所述細胞組分，以及(4)上述物質的組合，
其中所述雜質為所述多肽的des-phe同工型。
272.實施方案271的方法，其進一步包括下列步驟(b)使所述宿主細胞生長以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過程中，進行所述生長。
273.實施方案272的方法，其進一步包括下列步驟(c)任選進一步使所述雜質與巰基化合物接觸，以及(c’)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
274.實施方案273的方法，其進一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
275.實施方案272的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。
276.實施方案271的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。
277.實施方案275的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
278.實施方案276的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
279.實施方案277的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
280.實施方案278的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
281.實施方案271的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述金屬鹽接觸的時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
282.實施方案281的方法，其中所述時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
283.實施方案272的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述金屬鹽接觸的時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
284.實施方案283的方法，其中所述時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
285.實施方案271的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
286.實施方案272的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
287.實施方案285的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
288.實施方案286的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
289.實施方案287的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
290.實施方案288的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
291.實施方案286的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
292.實施方案285的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
293.實施方案285的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
294.實施方案286的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
295.實施方案271的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
296.實施方案272的方法，其中所述生長激素拮抗劑多肽包括[SEQ.ID.NO.1]的B-2036。
297.實施方案295的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
298.實施方案296的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
299.實施方案297的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
300.實施方案298的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
301.實施方案295的方法，其中所述金屬鹽和所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
302.實施方案296的方法，其中所述金屬鹽和所述B-2036的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
303.實施方案301的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
304.實施方案302的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
305.實施方案303的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
306.實施方案304的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
307.實施方案287的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
308.實施方案288的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
309.實施方案307的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
310.實施方案308的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
311.實施方案309的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM磷酸鈉。
312.實施方案310的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
313.實施方案295的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
314.實施方案296的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
315.實施方案313的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
316.實施方案314的方法，其中所述B-2036濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
317.實施方案293的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
318.實施方案294的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
319.實施方案317的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
320.實施方案318的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
321.實施方案295的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
322.實施方案296的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述B-2306維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
323.實施方案321的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
324.實施方案322的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
325.實施方案295的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
326.實施方案296的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
327.實施方案325的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
328.實施方案326的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
329.實施方案295的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
330.實施方案296的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述B-2036的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
331.實施方案329的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
332.實施方案330的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
333.在含有細胞組分的基因修飾的宿主細胞中重組生產生長激素多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，
其中所述雜質為所述多肽的des-phe同工型。
334.實施方案333的方法，其進一步包括下列步驟(b)使所述宿主細胞生長以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過程中，進行所述生長。
335.實施方案334的方法，其進一步包括下列步驟(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
336.實施方案333的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
337.實施方案334的方法，其中所述螯合劑選自EDTA，EGTA和DTPA。
338.實施方案336的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
339.實施方案337的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
340.實施方案338的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述EDTA接觸的時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
341.實施方案340的方法，其中所述時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
342.實施方案339的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述EDTA接觸的時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
343.實施方案342的方法，其中所述時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
344.實施方案333的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
345.實施方案334的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中。
346.實施方案338的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
347.實施方案339的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中。
348.實施方案346的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
349.實施方案347的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
350.實施方案348的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
351.實施方案349的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.01mM到大約100mM。
352.實施方案350的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
353.實施方案351的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約0.1mM到大約20mM。
354.實施方案352的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
355.實施方案353的方法，其中所述起始EDTA濃度為大約2mM到大約10mM。
356.實施方案344的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
357.實施方案345的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
358.實施方案346的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
359.實施方案347的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
360.實施方案356的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
361.實施方案357的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
362.實施方案358的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
363.實施方案359的方法，其中所述緩沖液包括Tris。
364.實施方案360的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
365.實施方案361的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述Tris緩沖液中的Tris濃度為大約1mM到大約200mM。
366.實施方案364的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
367.實施方案365的方法，其中所述Tris濃度為大約10mM到大約50mM。
368.實施方案333的方法，其中所述生長激素包括[SEQ.ID.NO.2]的多肽hGH。
369.實施方案334的方法，其中所述生長激素包括[SEQ.ID.NO.2]的多肽hGH。
370.實施方案368的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
371.實施方案369的方法，其中所述螯合劑包括EDTA。
372.實施方案370的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.01mM。
373.實施方案371的方法，其中所述EDTA提供在緩沖液中，在所述接觸(a)之前，所述緩沖液中的起始EDTA濃度為至少大約0.1mM。
374.實施方案370的方法，其中所述EDTA和所述hGH的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
375.實施方案371的方法，其中所述EDTA和所述hGH的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約1到大約1,000。
376.實施方案374的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
377.實施方案375的方法，其中所述摩爾比為大約20到大約1,000。
378.實施方案376的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
379.實施方案377的方法，其中所述摩爾比為大約50到大約250。
380.實施方案368的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
381.實施方案369的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
382.實施方案380的方法，其中所述hGH濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
383.實施方案381的方法，其中所述hGH濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
384.實施方案368的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
385.實施方案369的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約6到大約9。
386.實施方案384的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
387.實施方案385的方法，其中所述pH為大約6.5到大約7.5。
388.實施方案368的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述hGH維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
389.實施方案369的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述hGH維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
390.實施方案388的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
391.實施方案389的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
392.實施方案368的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
393.實施方案369的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
394.實施方案392的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
395.實施方案393的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
396.實施方案368的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
397.實施方案369的方法，其中所述螯合劑提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
398.實施方案396的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
399.實施方案397的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
400.在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素多肽時降低雜質量的方法，所述包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素多肽，(3)所述細胞組分，以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的des-phe同工型。
401.實施方案430的方法，其進一步包括下列步驟(b)使所述宿主細胞生長以制備所述多肽，其中在所述接觸步驟(a)之前或過程中，進行所述生長。
402.實施方案401的方法，其進一步包括下列步驟(c)任選進一步使所述雜質與巰基化合物接觸，以及(c’)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
403.實施方案400的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。
404.實施方案401的方法，其中所述金屬鹽選自堿金屬鹽，堿土金屬鹽，過渡金屬鹽，及其組合。
405.實施方案403的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
406.實施方案404的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鉀，乙酸鉀，磷酸鈉，乙酸鈉，氯化鋅及其組合。
407.實施方案405的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
408.實施方案406的方法，其中所述金屬鹽選自磷酸鈉和氯化鋅。
409.實施方案400的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述金屬鹽接觸的時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
410.實施方案409的方法，其中所述時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
411.實施方案401的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，將所述des-phe同工型與所述金屬鹽接觸的時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約10％。
412.實施方案411的方法，其中所述時間段足以使所述des-phe同工型的量降低至少大約50％。
413.實施方案400的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
414.實施方案401的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中。
415.實施方案413的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
416.實施方案414的方法，其中在所述接觸步驟(a)之前，所述緩沖液中的起始金屬鹽濃度為大約1mM到大約500mM。
417.實施方案415的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
418.實施方案416的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
419.實施方案417的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
420.實施方案418的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
421.實施方案413的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
422.實施方案414的方法，其中所述緩沖液選自Tris，磷酸，HEPES，檸檬酸，三乙胺，和組氨酸。
423.實施方案400的方法，其中所述生長激素包括[SEQ.ID.NO.2]的多肽hGH。
424.實施方案401的方法，其中所述生長激素多肽包括[SEQ.ID.NO.2]的多肽hGH。
425.實施方案407的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
426.實施方案408的方法，其中所述金屬鹽包括磷酸鈉。
427.實施方案425的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
428.實施方案426的方法，其中在所述接觸(a)之前，所述磷酸鈉的起始濃度為至少大約0.1mM。
429.實施方案423的方法，其中所述緩沖液中的所述金屬鹽和所述hGH的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
430.實施方案424的方法，其中所述緩沖液中的所述金屬鹽和所述hGH的摩爾數之比在所述接觸步驟(a)之前為大約300到大約10,000。
431.實施方案429的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
432.實施方案430的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約5,000。
433.實施方案431的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
434.實施方案432的方法，其中所述摩爾比為大約500到大約2500。
435.實施方案415的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
436.實施方案416的方法，其中所述金屬鹽為磷酸鈉或磷酸鉀。
437.實施方案435的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
438.實施方案436的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約10mM到大約150mM。
439.實施方案437的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
440.實施方案438的方法，其中所述起始金屬鹽濃度為大約25mM到大約100mM。
441.實施方案423的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
442.實施方案424的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH在所述緩沖液中的濃度為大約0.1mg/ml到大約20mg/ml。
443.實施方案441的方法，其中所述hGH濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
444.實施方案442的方法，其中所述hGH濃度為大約0.5mg/ml到大約5mg/ml。
445.實施方案413的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
446.實施方案414的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液的pH為大約4到大約9。
447.實施方案445的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
448.實施方案446的方法，其中所述pH為大約5.5到大約7.5。
449.實施方案423的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述hGH維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
450.實施方案424的方法，其中所述金屬鹽提供在緩沖液中，以及其中在所述接觸步驟(a)之后，所述緩沖液和所述hGH維持在大約0℃到大約35℃的溫度。
451.實施方案449的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
452.實施方案450的方法，其中所述溫度為大約2℃到大約15℃。
453.實施方案423的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
454.實施方案424的方法，其中所述接觸步驟(a)進行的時間為大約1小時到大約48小時。
455.實施方案453的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
456.實施方案454的方法，其中所述時間為大約5小時到大約15小時。
457.實施方案423的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
458.實施方案424的方法，其中在所述接觸步驟(a)之后，所述hGH的所述緩沖液的體積為大約1L到大約5000L。
459.實施方案457的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
460.實施方案458的方法，其中所述體積為大約200L到大約1500L。
461.實施方案69的方法，其中所述接觸步驟(a)在缺乏巰基化合物的條件下進行。
462.實施方案69的方法，其中所述接觸步驟(a)進一步包括先與所述螯合劑接觸，再在缺乏所述螯合劑的條件下與巰基化合物接觸。
463.實施方案462的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
464.實施方案463的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。
465.實施方案137的方法，其中所述接觸步驟(a)進一步包括與組合有巰基化合物的所述金屬鹽接觸。
466.實施方案465的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
467.實施方案466的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸與胱氨酸的組合。
468.實施方案137的方法，其中所述接觸步驟(a)進一步包括先與所述金屬鹽接觸，再在存在或缺乏所述金屬鹽的條件下與巰基化合物接觸。
下文以實施例方式示出，不應解釋成對本發(fā)明保護范圍的限制。在本申請中所引用的全部書籍，雜志，期刊文章，專利或其他任何出版物等皆專門在此引作參考。
實施例實施例1用巰基化合物降低生長激素拮抗劑(GHA)的三硫化物同工型雜質利用B-2036純化工藝中的滯留物1(參見下文流程圖1)來完成B-2036-三硫化物水平的減少。如Cunningham等在US專利No.5,849,535中所述，對表達B-2036的重組大腸桿菌進行發(fā)酵。初始提取和純化步驟(所有步驟在下文流程圖1中獲得滯留物1之前進行，例如，全部重懸浮和均質，兩相萃取，反相色譜，和陰離子交換層析)如流程圖1中所述進行。在第一步超濾/透濾后，產物以蛋白濃度3.7g/L存在于25mM HEPES，pH7.0緩沖液(約150L)。將產物溶液的溫度冷卻至2-8℃，并加入1/10體積(約15L)已冷卻至2-8℃的新鮮制備的200mMTris，20mM半胱氨酸，pH8.0緩沖液處理。B-2036/半胱氨酸溶液維持在2-8℃并混合174分鐘。利用Millipore Biomax 5超濾膜將混合物濃縮至131L，并且對6×體積的25mM HEPES，pH7.0透析。如下文流程圖1所述，所得產物通過B-2036純化的剩余工藝進行。
在半胱氨酸溫育后，B-2036/三硫化物水平的測定為3.7％面積。在半胱氨酸溫育后，其水平立即降至2.0％面積(降低大約46％)。




實施例2用螯合劑降低生長激素拮抗劑的三硫化物同工型雜質參照流程圖1，將165Kg的冷凍GHA細胞漿加入約1013L的150mM Tris，5mM EDTA，pH7.2。當細胞漿已完成融化后(由穩(wěn)定的A550讀數測定)，將混合物以名義流速250L/小時在950+/-50Bar下通過Niro均質儀。勻漿收集至溫度維持在24-33℃之間的罐中。硫酸銨和PEG-4600加入裂解混合物中使兩種化合物的濃度為10％(w/w)。所得兩相混合物混合60-120分鐘，然后將溶液通過液/液，固體排出離心而分成兩相。上相含有所需的產物，收集并通過由“去脂(delipidating)”過濾器，“深層(depth)”過濾器以及0.2μm過濾器組成的系列過濾器過濾。過濾液收集在三個單獨的托盤中，對各個樣品中的B-2036-三硫化物進行分析。水平范圍為3.1-3.8％面積。接著利用如實施例1中流程圖所述的步驟，將所得物質加工成本體中間體。
通過比較，不同批次的樣品通過上述步驟處理(但是在裂解緩沖液中沒有EDTA組分(螯合劑)并且沒有用半胱氨酸處理滯留物1)，其在上述流程圖1的整個工藝結束時生成的三硫化物水平(n＝10)范圍為3.2-6.4％面積，平均為5.1。當EDTA包含在裂解緩沖液中時，對滯留物1進行半胱氨酸溫育步驟，流程圖1的整個工藝結束時的三硫化物水平為1.5％面積。
實施例3用金屬鹽降低生長激素拮抗劑的三硫化物同工型雜質參照下文流程圖2，將165Kg的冷凍細胞漿加入約1013L的100mM磷酸鈉，pH7.0。當細胞漿已完成融化后(由穩(wěn)定的A550讀數測定)，將混合物以名義流速250L/小時在950+/-50Bar下通過Niro均質儀。勻漿收集至溫度維持在24-33℃之間的罐中。硫酸銨和PEG-4600加入裂解混合物中使兩種化合物的濃度為10％(w/w)。所得兩相混合物混合60-120分鐘，然后將溶液通過液/液，固體排出離心而分成兩相。上相含有所需的產物，收集并通過由“去脂”過濾器，“深層”過濾器以及0.2μm過濾器組成的系列過濾器過濾。如下文流程圖2所述，將此物質通過B-2036的剩余工藝。加工結束時B-2036-三硫化物的水平為1.4％面積。相比而言，用普通裂解緩沖液(150mM Tris，pH7.2)處理的B-2036批次(n＝10)的B-2036-三硫化物水平為3.2-6.4％面積。



實施例4用螯合劑降低生長激素拮抗劑的Des-Phe同工型雜質參照流程圖1，將165Kg的冷凍細胞漿加入約1013L的150mMTris，5mM EDTA，pH7.2。當細胞漿已完成融化后(由穩(wěn)定的A550讀數測定)，將混合物以名義流速250L/小時在950+/-50Bar下通過Niro均質儀。勻漿收集至溫度維持在24-33℃之間的罐中。硫酸銨和PEG-4600加入裂解混合物中使兩種化合物的濃度為10％(w/w)。所得兩相混合物混合60-120分鐘，然后將溶液通過液/液，固體排出離心而分成兩相。上相含有所需的產物，收集并通過由“去脂”過濾器，“深層”過濾器以及0.2μm過濾器組成的系列過濾器過濾。過濾液(上相過濾后得到；參見流程圖1)收集在三個單獨的托盤中，并對各個樣品中的B-2036/des-phe進行分析。水平范圍為3.2-6.3％面積。相比而言，流程圖1中的其他加工進一步使B-2036 des-phe水平降低至滯留物3的0.3％面積。通過第二步陰離子交換色譜的產物收集參數而實現B-2036des-phe水平的進一步降低。當裂解緩沖液包括EDTA，并且進行陰離子交換色譜步驟的收集程序時，得到的B-2036/des-phe水平為0.3％，與之比較，沒有EDTA(例如，150mM Tris，pH7.2)和上述收集程序對B-2036批次(n＝10)進行加工的最終工藝水平為4.6-16.2％面積(平均＝10.2％面積)。
實施例5用金屬鹽降低生長激素拮抗劑的Des-Phe同工型雜質參照流程圖2，將165Kg的冷凍細胞漿加入約1013L的100mM磷酸鈉，pH6.0。當細胞漿已完成融化后(由穩(wěn)定的A550讀數測定)，將混合物以名義流速250L/小時在950+/-50Bar下通過Niro均質儀。勻漿收集至溫度維持在24-33℃之間的罐中。硫酸銨和PEG-4600加入裂解混合物中使兩種化合物的濃度為10％(w/w)。所得兩相混合物混合60-120分鐘，然后將溶液通過液/液，固體排出離心而分成兩相。上相含有所需的產物，收集并通過由“去脂”過濾器，“深層”過濾器以及0.2μm過濾器組成的系列過濾器過濾。過濾液收集在三個單獨的托盤中，對各個樣品中的B-2036/des-phe進行分析。水平范圍為6.0-9.4％面積。相比而言，流程圖2中的其他加工進一步使B-2036 des-phe水平降低至滯留物2的0.8％面積。通過第二步陰離子交換色譜的產物收集參數而實現B-2036/des-phe水平的進一步降低。當裂解緩沖液包括磷酸鈉，并且進行第二步陰離子交換色譜的收集程序時，得到的B-2036/des-phe水平為0.8％面積，與之比較，沒有磷酸鈉(例如，150mMTris，pH7.2)和上述收集程序對B-2036批次(n＝10)進行加工的最終工藝水平為4.6-16.2％面積(平均＝10.2％面積)。
實施例6用螯合劑降低生長激素激動劑的Des-Phe同工型雜質將新鮮或冷凍的表達生長激素激動劑的重組細胞懸浮在含有EDTA的緩沖液中。然后，通過諸如均質的過程完全破壞細胞，或諸如滲壓休克或冷凍/融化的過程部分破壞細胞以釋放生長激素激動劑。接著通過兩相萃取，固/液離心或過濾分離破碎的溶液。通過一系列液相色譜步驟對激動劑進行純化。
實施例7用金屬鹽降低生長激素激動劑的Des-Phe同工型雜質將新鮮或冷凍的表達生長激素激動劑的重組細胞懸浮在含有磷酸鈉的緩沖液中。然后，通過諸如均質的過程完全破壞細胞，或諸如滲壓休克或冷凍/融化的過程部分破壞細胞以釋放生長激素激動劑。接著通過兩相萃取，固/液離心或過濾分離破碎的溶液。通過一系列液相色譜步驟對激動劑進行純化。
序列表<110>法瑪西亞公司(PHARMACIA CORPORATION)同工型雜質水平降低的生長激素及其拮抗劑的制備方法<120>(Method For The Preparation Of Growth Hormone And Antagonist ThereofHaving Lower Levels Of Isoform Impunties Thereof)<130>SCT05077147<150>US 60/406,553<151>2002-08-28<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>191<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala Asp Arg Leu Asn Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Lys Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Asn Ala Asp Met Ser Arg Val Ser Thr Phe165 170 175Leu Arg Thr Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190<210>2<211>191<212>PRT<213>Homo sapiens
<400>2Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu phe Glu20 25 30Glu Ala Tyr Ile Pro Iys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155160Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190
權利要求
1.一種在遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)使巰基化合物與所述雜質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量，其中所述雜質為所述多肽的三硫化物同工型。
2.權利要求1的方法，其進一步包括下列步驟(b)使所述宿主細胞生長以制備所述多肽，其中所述生長在所述接觸步驟(a)之前或過程中進行。
3.權利要求2的方法，其進一步包括下列步驟(c)使所述多肽純化以生成純化的多肽。
4.權利要求3的方法，其進一步包括下列步驟(d)使所述純化的多肽PEG化。
5.權利要求2的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
6.權利要求1的方法，其中所述巰基化合物選自亞硫酸鹽，谷胱苷肽，β-巰基乙醇，二硫蘇糖醇，巰基乙胺，二硫赤蘚糖醇，三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽，半胱氨酸，和半胱氨酸與胱氨酸的組合。
7.權利要求5的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合。
8.權利要求6的方法，其中所述巰基化合物包括半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合。
9.權利要求7的方法，其中在所述接觸步驟(a)中，所述三硫化物同工型與所述半胱氨酸或半胱氨酸和胱氨酸的組合接觸的時間段足以使所述三硫化物的量降低至少大約10％。
10.一種在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素拮抗劑多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的三硫化物同工型。
11.一種在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素拮抗劑多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的三硫化物同工型。
12.一種在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素拮抗劑多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的des-phe同工型。
13.一種在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素拮抗劑多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素拮抗劑多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的des-phe同工型。
14.一種在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將螯合劑與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的des-phe同工型。
15.一種在含有細胞組分的遺傳修飾的宿主細胞中重組生產生長激素多肽時降低雜質量的方法，所述方法包括下列步驟(a)將金屬鹽與下列物質在充分條件下接觸以降低所述雜質的量(1)所述雜質，(2)所述生長激素多肽，(3)所述細胞組分以及(4)上述物質的組合，其中所述雜質為所述多肽的des-phe同工型。
全文摘要
本發(fā)明總的涉及制備所需多肽的重組方法。這些方法生成的多肽產物含有水平降低的同工型雜質。具體而言，本發(fā)明涉及(1)用于制備同工型雜質降低的生長激素的重組方法，以及(2)用于制備同工型雜質同樣降低的生長激素拮抗劑，諸如派格索曼，及其蛋白中間體的重組方法。更具體而言，由本發(fā)明方法降低的同工型雜質分別為生長激素和生長激素拮抗劑(或其中間體)的三硫化物和des－phe同工型雜質。
文檔編號C07K1/00GK1697839SQ03824791
公開日2005年11月16日 申請日期2003年8月26日 優(yōu)先權日2002年8月28日
發(fā)明者阿努拉格·S·拉托, 史蒂芬·B·萊爾, 戴維·E·斯坦邁耶, 斯科特·I·艾倫, 約翰·邁爾, 丹尼斯·M·布瓦萊, 約翰·J·巴克利, 加里·V·約翰遜 申請人:法瑪西亞公司