專利名稱：：Fⅷ的位點定向修飾的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及因子VIII(FVIII)突變蛋白，其允許在確定的位點偶聯(lián)一個或多個生物相容的聚合物如聚乙二醇。另外，提供了用于治療目的的相關(guān)的制劑、其劑量及施用方法。這些修飾的FVIII變體和相關(guān)的組合物和方法用于給遭受血友病A的個體提供具有減少的注射頻率和減少的免疫原性應(yīng)答的治療選擇。
背景技術(shù)：
：血友病A是最常見的遺傳性凝結(jié)障礙，估計的發(fā)病率為1/5000男性。它的原因是FVIII的缺乏或結(jié)構(gòu)缺陷，所述FVIH是血液凝結(jié)的固有途徑中的關(guān)鍵組分。目前血友病A的治療包含靜脈內(nèi)注射人FVIII。已經(jīng)重組地生產(chǎn)了人FVIH,作為約300kD的單鏈分子。它由結(jié)構(gòu)域A1-A2-B-A3-C1-C2組成(Thompson,2003，Semin.Hematol.29，pp.11-22)。前體產(chǎn)物在高爾基體中被加工成200kD(重鏈)和80kD(輕鏈)的2條多肽鏈，這2條鏈通過金屬離子結(jié)合到一起(Kaufman等，1988,J.Biol.Chem.263，p.6352;Andersson等，1986，Proc.Natl,Acad.Sci.83，p.2979)。FVHI的B-結(jié)構(gòu)域似乎是可有可無的，因為還已經(jīng)顯示B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII(BDD，卯kDAl-A2重鏈+80kD輕鏈)可以有效地用作血友病A的替補(bǔ)療法。B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII序列含有B-結(jié)構(gòu)域的14個氨基酸以外的所有缺失。目前，通過根據(jù)需要靜脈內(nèi)施用FVIII來治療血友病A患者，或者作為預(yù)防療法每周施用幾次。關(guān)于預(yù)防治療，每周施用15-25IU/kg體重的因子VIII3次?；颊呖偸切枰?。因為它在人中的半衰期短，所以必須頻繁地施用FVIII。盡管全長蛋白具有大于300kD的大尺寸，但FVHI具有僅約11小時的人中的半衰期(Ewenstein等，2004，Semin.Hematol.41，pp.l-16)。對頻繁的靜脈內(nèi)注射的需要造成患者順應(yīng)性的巨大障礙。如果可以開發(fā)具有更長的半衰期且因而需要更低頻率的施用的FVIII產(chǎn)物，則會更方便患者。另外，如果提高了半衰期，那么由于需要更低的劑量，可以降低治療費用?，F(xiàn)有療法的另一個缺點是，約25-30%患者發(fā)展抑制FVIII活性的抗體(Saenko等，2002,Haemophilia8,pp.1-11)。抑制性抗體的主要表位定位于A2結(jié)構(gòu)域中的殘基484-508、A3結(jié)構(gòu)域中的殘基1811-1818和C2結(jié)構(gòu)域?？贵w發(fā)展阻止FVIII作為替補(bǔ)療法的應(yīng)用，迫使該組患者尋求使用高劑量重組因子Vila的甚至更昂貴的治療和免疫耐受療法。下面的研究鑒別出了抑制性抗體的FVHI表位。在25份抑制性血漿樣品的研究中，發(fā)現(xiàn)11份結(jié)合凝血酶產(chǎn)生的73kD輕鏈片段A3C1C2，4份結(jié)合A2結(jié)構(gòu)域，且10份結(jié)合二者(Fulcher，C.等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.2(22)，pp.7728-32)。在另一項研究中，重組A2多肽中和了8種來自患者的A2結(jié)構(gòu)域抑制劑中的6種(Scandella，D.等，1993,Blood82(6)，pp.l767-75)。將9種來自患者的抑制劑中的6種的表位作圖到A2殘基379巧38(Scandella，D.等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.85(16),pp.6152-6)。18種重鏈抑制劑的表位定位于相同的A2結(jié)構(gòu)域N-末端18.3kD區(qū)域(Scandella，D.等，1989,Blood74(5)，pp.l618-26)。通過用同源豬序列替代人A2結(jié)構(gòu)域殘基387-604產(chǎn)生的有活性的重組雜種人/豬FVIII分子，對患者A2抑制劑是抗性的(Lubin，I.等，1994,J.Biol.Chem.269(12),pp.8639-41)，且對與患者A2抑制劑竟?fàn)幗Y(jié)合A2的鼠單克隆抗體mAB413IgG是抗性的(Scandella，D.等，1992，ThrombHaemost.67(6)，pp.665-71)。當(dāng)實驗表明mAB413IgG和4種患者抑制劑不抑制其中用豬序列替代A2結(jié)構(gòu)域殘基484-508的雜種人/豬FVIII時，該A2結(jié)構(gòu)域表位進(jìn)一步定位于A2結(jié)構(gòu)域殘基484-508(Healey，J.等，1995，J.Biol.Chem.270(24)，pp.l4505-9)。該雜種FVIII還對篩選的23份患者血漿的至少一半是更高抗性的(Barrow,R.等，2000，Blood95(2),pp.564-8)。丙氨酸掃描誘變鑒別的殘基487對結(jié)合測試的所有5種患者抑制劑都是關(guān)鍵的，而殘基484、487、489和492對于與mAB413IgG的相互作用都是重要的(Lubin,I.,J.BioLChem.272(48)，pp.30191-5)。在接受R484A/R489A/P492A突變體(而不是R484A/R489A突變體)的小鼠中的抑制性抗體效價，顯著低于接受對照人BDDFVIII的小鼠(Parker,E.等，2004，Blood104(3),pp.704-10)?？傊?，A2結(jié)構(gòu)域的484-508區(qū)域似乎是FVIII活性的抑制劑的結(jié)合位點。除了發(fā)展對FVIII的免疫應(yīng)答以外，常規(guī)療法的另一個問題是，其需要頻繁的給藥，因為FVIH的體內(nèi)半衰期短。已經(jīng)研究了從循環(huán)清除FVIII的機(jī)理。從循環(huán)清除FVIII，已部分地歸因于向低密度脂蛋白受體-相關(guān)蛋白(LRP)的特異性結(jié)合，所述LRP是具有廣泛配體特異性的肝清除受體(Oldenburg等，2004，Haemophilia10Suppl4，pp.133-139)。最近，還表明低密度脂蛋白(LDL)受體在FVIII清除中起作用，如通過與LRP協(xié)同調(diào)節(jié)FVIII的血漿水平(Bovenschen等，2005，Blood106，pp.906-910)。兩種相互作用都被結(jié)合細(xì)胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)所促進(jìn)。當(dāng)LRP被封閉時，可以使在小鼠中的血漿半衰期延長3.3倍，或者當(dāng)LRP和細(xì)胞表面HSPG都被封閉時，可以延長5.5倍(Sarafa譜等，2001，J.Biol.Chem.276，pp.11970-11979)。推測HSPG將FVIH集中在細(xì)胞表面上，并將其呈遞給LRP。FVIII上的LRP結(jié)合位點已經(jīng)被定位在A2殘基484-509(Saenko等，1999，J.Biol.Chem.274,pp.37685-37692)、A3殘基1811-1818(Bovenschen等，2003,J.Biol.Chem.278，pp.9370-9377)和C2結(jié)構(gòu)域中的表位(Leiiting等，1999，J.Biol.Chem.274，pp.23734-23739)。通過蛋白酶的作用，也可以將FVIII從循環(huán)中清除。為了理解該作用，人們必須理解FVIII參與血液凝結(jié)的機(jī)理。FVIII作為結(jié)合vWF的重鏈和輕鏈的異源二聚體而循環(huán)。VWF結(jié)合包含F(xiàn)VIII殘基1649-1689(Foster等，1988，J.Biol.Chem.263,pp.5230-5234)和CI(Jacquemin等，2000,Blood96，pp.958-965)和C2結(jié)構(gòu)域(Spiegel,P.等，2004，J.Biol.Chem.279(51)，pp.53691-8)的部分。FVIII被凝血酶激活，該凝血酶切割殘基372、740和1689之后的肽鍵，以產(chǎn)生Al、A2和A3-C1-C2結(jié)構(gòu)域的異源三聚體(Pittman等，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.276,pp.12434-12439)。激活后,FVIII從vWF解離，并通過結(jié)合磷脂，集中在血小板細(xì)胞表面。磷脂結(jié)合包含F(xiàn)VIH殘基2199、2200、2251和2252(Gilbert等，2002，J.Biol.Chem.277，pp.6374-6381)。在這里，它通過與FVIII殘基558-565(Fay等，1994，J.Biol.Chem.269，pp.20522-20527)和1811-1818(Lenting等，1996，J.Biol.Chem.271，pp.1935-1940)的相互作用，結(jié)合FIX,并通過與FVIII殘基349-372(Nogami等，2004，J.Biol.Chem.279,pp.15763-15771)的相互作用，結(jié)合FX，并作為FX的FIX激活的輔因子，所述FX是內(nèi)源性凝結(jié)途徑的基本組分。激活的FVIII(FVIIIa)受到蛋白酶激活的蛋白C(APC)的部分滅活，這通過在FVIII殘基336和562后面的切割來實現(xiàn)(Regan等，1996，J.Biol.Chem.271,pp.3982-3987)。但是，滅活的主要決定因素是A2結(jié)構(gòu)域從Al和A3-C1-C2解離(Fay等，1991，J.Biol.Chem.266，pp.8957-8962)。已經(jīng)證實增加蛋白的體內(nèi)半衰期的一種方法是PEG化(PEGyladon)。PEG化是長鏈聚乙二醇(PEG)分子向蛋白或其它分子的共價附著。PEG可以是線性形式或分支形式，以產(chǎn)生具有不同特征的不同分子。除了增加肽或蛋白的半衰期以外，PEG化已經(jīng)用于減少抗體發(fā)展，保護(hù)蛋白免受蛋白酶消化，和保持材料在腎濾液的外面(Harris等，2001,ClinicalPharmacokinetics40，pp.539-51)。另夕卜，PEG化也可以增加蛋白的總穩(wěn)定性和溶解度。最后，PEG化蛋白的持續(xù)的血漿濃度，可以通過減少藥物的低谷至頂點水平降低不利的副作用的程度，從而消除對在早期時間點引入超生理水平的蛋白的需要。通過用大聚合物(如PEG和葡聚糖)靶向伯胺(N-末端和賴氨酸)來隨機(jī)修飾FVIII的嘗試，已經(jīng)取得不同程度的成功(W094/15625、美國專利4970300、美國專利6048720)。在1994年專利申請(W094/15625)中公開的最顯著的提高，顯示了4倍半衰期提高，但是代價是，在全長FVIII與50倍摩爾過量的PEG反應(yīng)后，喪失2倍活性。WO2004/075923公開了通過隨機(jī)修飾生成的FVIII和聚乙二醇的綴合物。在過去，已經(jīng)批準(zhǔn)隨機(jī)地PEG化的蛋白如干擾素a(Kozlowski等，2001，BioDrugs15,pp.419-429)用作治療劑。但是，對于異源二聚體的FVIII,該隨機(jī)方案更容易出問題。FVIII具有數(shù)百個潛在的PEG化位點，包括158個賴氨酸，2個N-末端和多個組氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸，它們都可能被主要靶向伯胺的試劑PEG化。例如，顯示PEG化的干擾素a-2b的主要位置異構(gòu)體是組氨酸(Wang等，2000，Biochemistry39，pp.10634-10640)。此外，全長FVIII的不均勻加工，可以導(dǎo)致原材料的混合物，這導(dǎo)致PEG化的產(chǎn)物的進(jìn)一步復(fù)雜性。不控制FVIII上的PEG化位點的另一個缺點是，如果PEG附著在關(guān)鍵的活性位點處或附近，尤其是如果超過一個PEG或單個大PEG綴合到FVIII上，那么潛在的活性降低。因為隨機(jī)的PEG化總是產(chǎn)生大量多重PEG化的產(chǎn)物，所以僅僅得到單-PEG化的產(chǎn)物的純化會急劇降低總得率。最后，產(chǎn)物概況的巨大異質(zhì)性使每批的一致合成和表征幾乎不可能。因為良好生產(chǎn)需要一致的、充分表征的產(chǎn)品，所以產(chǎn)物異質(zhì)性是商業(yè)化的屏障。鑒于所有這些原因，需要更特異性的PEG化FVIII的方法。在近期的綜述中(Kochendoerfer，G.，Curr.Opin.Chem.Biol.2005，可在線以O(shè)ct.15，2005，directobjectidentifierdoi:10.1(n6/j.chpa.2005.10.007得到)，已經(jīng)總結(jié)了各種位點定向蛋白PEG化策略。一種方法包含，通過化學(xué)合成或重組表達(dá)，將非天然氨基酸摻入蛋白，隨后添加將與非天然氨基酸特異性地反應(yīng)的PEG衍生物。例如，非天然氨基酸可以是含有不存在于天然蛋白中的酮基的氨基酸。但是，蛋白的化學(xué)合成對于如FVIII這樣大的蛋白不可行。目前肽合成的界限是約50個殘基。可以連接幾個肽，以形成更大的多肽片，但是生產(chǎn)甚至B-結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII,會需要超過20次連接，這會導(dǎo)致小于1%回收，甚至在理想的反應(yīng)條件下。迄今為止，含有非天然氨基酸的蛋白的重組表達(dá)主要限于非哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。對于需要在哺乳動物系統(tǒng)中表達(dá)的大且復(fù)雜的蛋白如FVIII，預(yù)期該方法有問題。蛋白的位點特異性的PEG化的另一種方法是，用PEG-醛乾向N-末端主鏈胺。在該方法中需要低pH來實現(xiàn)超過其它胺基團(tuán)的特異性。但是，這與FVIII的穩(wěn)定性所需的狹窄的接近中性的pH范圍不相容(Wang等，2003,InternationalJ.Pharmaceutics259，pp.1-15)。此外，F(xiàn)VIII的N-末端PEG化不會導(dǎo)致提高的血漿半衰期，如果該區(qū)域不參與血漿清除的話。實際上，F(xiàn)VIII輕鏈的N-末端區(qū)域已經(jīng)參與結(jié)合vonWillebrand因子(vWF),后者是對FVIII在循環(huán)中的存活至關(guān)重要的栽體蛋白。通過因子VIII的N-末端修飾，可以破壞或減弱與vWF的至關(guān)重要的結(jié)合。因而，F(xiàn)VIII的N-末端PEG化可能具有降低FVIII的血漿半衰期的相反作用。WO90/12874公開了人IL-3、粒細(xì)胞集落刺激因子和促紅細(xì)胞生成素多肽的位點特異性的修飾，這如下實現(xiàn)插入半胱氨酸，或用半胱氨酸替代另一種氨基酸，然后加入具有巰基反應(yīng)基團(tuán)的配體。該配體選擇性地偶聯(lián)半胱氨酸殘基。沒有公開FVIII或其任何變體的修飾。鑒于上述原因，仍然需要具有更大的體內(nèi)作用持續(xù)時間和降低的免疫原性、同時保持功能活性的改良的FVIII變體。此外，希望以一致的方式將這樣的蛋白生產(chǎn)為均質(zhì)產(chǎn)物。發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是，提供生物相容的聚合物-綴合的功能性FVIII多肽，其具有提高的藥物代謝動力學(xué)特性和治療特性。本發(fā)明的另一個目的是，提供生物相容的聚合物-綴合的B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII蛋白，其具有提高的藥物代謝動力學(xué)特性。本發(fā)明的另一個目的是，提供生物相容的聚合物-綴合的功能性FVIII多肽，其具有降低的與低密度脂蛋白受體-相關(guān)蛋白(LRP)、低密度脂蛋白(LDL)受體、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)和/或針對FVIII的抑制性抗體的結(jié)合。本發(fā)明的另一個目的是，提供改良的FVIII變體，其具有更大的體內(nèi)作用持續(xù)時間和降低的免疫原性，其能以一致的方式生產(chǎn)為均質(zhì)產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個方面，提供了具有因子VIII前凝血劑活性的綴合物，其包含在多肽上的一個或多個預(yù)定位點共價附著到一個或多個生物相容的聚合物的功能因子VIII多肽，其中所述預(yù)定位點不是N-末端胺。本發(fā)明也包括制備該綴合物的方法，該方法包含突變編碼功能因子VIII多肽的核苷酸序列，以在預(yù)定位點用半胱氨酸殘基的編碼序列替代；表達(dá)突變的核苷酸序列，以產(chǎn)生半胱氨酸增強(qiáng)的突變蛋白；純化該突變蛋白；使突變蛋白與生物相容的聚合物反應(yīng)，所述聚合物已經(jīng)被激活，以基本上僅在導(dǎo)入的半胱氨酸殘基處與多肽反應(yīng)，從而形成綴合物；和純化該綴合物。本發(fā)明也涉及包含所述綴合物和可藥用佐劑的藥物組合物和治療血友病的方法，所述方法通過施用治療有效量的這些藥物組合物給需要的哺乳動物來實現(xiàn)。本發(fā)明也涉及因子VIII突變蛋白的位點定向PEG化的方法，該方法包含(a)表達(dá)位點定向因子VIII突變蛋白，其中所述突變蛋白具有在因子VIII突變蛋白的暴露表面上的氨基酸殘基的半胱氨酸替代，且該半胱氨酸被加帽；(b)在溫和地還原半胱氨酸突變蛋白和釋放帽的條件下，使半胱氨酸突變蛋白接觸還原劑；(c)從半胱氨酸突變蛋白去除帽和還原劑；和(d)去除還原劑后至少約5分鐘，在產(chǎn)生PEG化的因子VIII突變蛋白的條件下，用包含巰基偶聯(lián)部分的PEG處理半胱氨酸突變蛋白。附圖簡述圖1.PEG突變蛋白的載體圖鐠和誘變策略。圖2.經(jīng)單克隆FVIII抗體層析柱純化的PEG2蛋白關(guān)于時間的280nmUV吸光度諳。使用來自AmershamBioscience的AKTAExplorer100層析系統(tǒng)，進(jìn)行層析。圖3三步位點定向PEG化方法。PEG代表著半胱氨酸-反應(yīng)性PEG,如PEG-馬來酰亞胺。封閉條代表著二硫鍵形成，而開口條代表著還原的半胱氨酸。圖4.PEG2的位點定向PEG化。圖5.PEG6的位點定向PEG化。圖6a.BDD、PEG2、4、5和6的位點定向PEG化。上圖用重(H)鏈抗體染色，而下圖用輕(L)鏈抗體染色。"U"是未經(jīng)加工的含有H和L兩者的材料。圖6b.PEG15和PEG7的PEG化，用PEG2和PEG6作為對照。用TCEP還原起始純化的PEG突變蛋白("S")，并在去除還原劑后，用12kD("12")或22kD("22")PEG進(jìn)行PEG化("R")。在6%Tris-甘氨酸SDSPAGE上電泳樣品，并用重鏈("HC")抗體(左圖)或輕鏈("LC")抗體(右圖)染色。"U"是未經(jīng)加工的含有HC和LC兩者的材料。用點突出顯示PEG化的帶。圖6c.PEG2+6的PEG化，用PEG2和PEG6作為對照。用TCEP還原PEG2、PEG6或PEG2+6，并在去除還原劑后，用5kD("5")或43kD("43")PEG進(jìn)行PEG化("R")。還用12、22和33kDPEG將PEG2+6PEG化。在6%Tris-甘氨酸SDSPAGE上電泳才羊品，并在左圖用針對蛋白的考馬斯或用重鏈(H)或輕鏈(L)抗體進(jìn)行染色。"U"是未經(jīng)加工的含有H和L兩者的材料。用點突出顯示PEG化的帶。圖6d.野生型全長FVIII(KG-2)的PEG化，用PEG2作為對照。左凝膠用考馬斯染料對蛋白進(jìn)行染色，而右凝膠用碘對PEG進(jìn)行染色。"BDDU"是未經(jīng)加工的含有H和L兩者的BDD材料。用點突出顯示PEG化的帶。圖7.PEG化的PEG2的凝血酶切割。A2結(jié)構(gòu)域的N-末端一半顏色為藍(lán)色，而C-末端一半為綠色，R8B12抗體表位突出顯示為深綠色(正確的FVIII模型)。用凝血酶處理PEG2(泳道l)和22kDPEG化的PEG2(泳道2)(分別是泳道3和4)，然后在7%Tris-乙酸鹽凝膠(Invitrogen)上電泳，并用R8B12抗體染色。每個泳道含有約50ngFVIII。圖8.PEG化的野生型全長FVIII(KG-2)的凝血酶切割。"S"=起始KG-2材料。"R":還原的KG-2，且去除了還原劑。"P"=用43kDPEG進(jìn)行PEG化的"R"。"Pure"=從過量PEG純化出來的"P"。"L"=輕鏈。用點突出顯示PEG化的帶。圖9.PEG化的PEG2的碘染色。在6。/。Tris甘氨酸凝膠上電泳22或43kDPEG化的PEG2,并用R8B12FVIII抗體(泳道1和2)或硤(泳道3和4)染色。根據(jù)它們的分子量標(biāo)記泳道，排列2種染色。泳道1和2各自含有約30ngFVIII，而泳道3和4含有約2ng。圖10.PEG化的和未PEG化的PEG2的MALDI質(zhì)諳法分析。在PEG2(圖10a)或22kDPEG化的PEG2(圖10b)上進(jìn)行MALDI質(zhì)譜法。PEG化后，PEG2的重(H)鏈峰顯著減少，且出現(xiàn)新峰(H+PEG)，其集中在111kD(22kDPEG+89kD重鏈)。沒有檢測到PEG化的輕(L)鏈峰，預(yù)期它集中在100kD(22kDPEG+83kD輕鏈)。圖11.凝血酶切割后PEG化的和未PEG化的PEG2的MALDI質(zhì)譜法。圖12.凝血酶切割之前和之后PEG化的PEG6的MALDI質(zhì)i普法。圖13.在尺寸排阻柱上純化的PEG化的PEG2的280nmUV吸收譜。圖14.在陽離子交換柱上純化的PEG化的和未PEG化的PEG6的280nmUV吸收i普。圖15.在尺寸排阻柱上純化的PEG化的和未PEG化的PEG6的280nmUV吸收譜。圖16.通過生色測定和凝結(jié)測定測得的與未PEG化的蛋白活性相比PEG化的蛋白活性。純化的全長FVIII表示為KG-2。通過用還原和去除還原劑之后PEG處理的樣品的值除以緩沖對照處理的樣品的值，其中考慮PEG化得率，確定報告的百分比活性。圖17.與PEG2相比，PEG化的PEG2的兔PK研究。圖18.與BDD和PEG2相比，PEG化的PEG2的兔PK研究。在PEG化的PEG2和BDD之間對比P-值。圖19.與BDD和PEG6相比，PEG化的PEG6的兔PK研究。圖20.與未修飾的flFVHI相比，PEG化的野生型全長("fl")FVIII的兔PK研究。圖21.與PEG6和BDD相比，PEG化的PEG6的血友病小鼠PK研究。圖22.與BDD相比，22和43kDPEG化的PEG2的正常小鼠P研究。圖23.與BDD相比，22kDPEG化的PEG2的全時程正常小鼠PK研究。圖24.血友病小鼠(BDD)因子VIII回收柱狀圖，它描繪了在血友病小鼠測定中兩種BDD因子VIII的半衰期的藥物代謝動力學(xué)(PK)評價。圖25.與BDD相比，22kDPEG化的PEG2的血友病小鼠腎撕裂傷研究。載體處理的小鼠具有25uL/g體重的失血。圖26.在有遞增量的FVIII抗體存在下，PEG化的PEG2和BDD的生色活性?？贵w表位在括號中指明。圖27.在有遞增量的FVIIImAB413抗體存在下，PEG化的PEG2的生色活性。圖28.在有源自已經(jīng)發(fā)展對FVIII的抑制劑的患者的人血漿存在下，BDD、43kDPEG化的PEG2、33kDPEG化的PEG6和33kD雙PEG化(diPEGylation)的PEG2+6的生色活性。在上面記錄了抑制劑效價和血液收集日期。上面的2個圖包括從5-405倍患者血漿稀度收集的數(shù)據(jù)。左下圖集中在患者HRF-828血漿的1:15倍稀度。右下圖證實，為上面的2個圖中的每個FVIII樣品使用的0.064IU/mL不是飽和劑量。圖29.PEG化篩選方法和驗證。上圖顯示了瞬時表達(dá)的PEG突變蛋白的PEG化篩選示意圖。下圖顯示了使用重鏈("H")-特異性的抗體(左)或輕鏈("L")特異性的抗體(右)對PEG化的產(chǎn)物的蛋白印跡分析。用點突出顯示PEG化的帶。"U"是未經(jīng)加工的含有H和L兩者的材料。圖30.PEG15-17的PEG化篩選。使用重鏈("H")-特異性的抗體(R8B12和58.12)或輕鏈("L，，)特異性的抗體(C7F7和GM)，對PEG化的產(chǎn)物進(jìn)行蛋白印跡分析。所有3種突變蛋白都是對重鏈選擇性的，相對PEG化效率是PEG15~PEG16>PEG17。用點突出顯示PEG化的帶。"U"是未經(jīng)加工的含有H和L兩者的材料。圖31.該凝膠顯示了作為還原劑濃度函數(shù)的PEG2+14的PEG化。在4。C，用67-670uM的TCEP處理PEG2+1430分鐘。通過旋轉(zhuǎn)柱去除還原劑，隨后用12kDPEG進(jìn)行PEG化。FVIII的重鏈和輕鏈分別突出顯示為"H"和"L"。2個印跡指出了PEG化的重鏈和輕鏈。圖32.用67-670uMTCEP處理、隨后去除還原劑的PEG2+14的解巻積質(zhì)譜。發(fā)明詳述本發(fā)明是基于下述發(fā)現(xiàn)，即具有FVIII活性的多肽可以在非N-末端胺的預(yù)定位點共價附著到生物相容的聚合物上，且這樣的多肽基本上保留它們的凝血劑活性。此外，這些多肽綴合物具有提高的循環(huán)時間和降低的抗原性。本發(fā)明的綴合物勝過現(xiàn)有技術(shù)的具有隨機(jī)附著到FVIII或附著在N-末端的聚合物的綴合物。位點定向附著允許人們設(shè)計避過生物學(xué)活性所需區(qū)域并從而維持相當(dāng)大的FVIII活性的修飾。它也允許設(shè)計成附著聚合物，來阻斷在參與FVIII清除的位點的結(jié)合。位點定向結(jié)合也允許通過隨機(jī)的聚合物偶聯(lián)，生成均勻的產(chǎn)物，而不是現(xiàn)有技術(shù)生成的異質(zhì)綴合物。通過避免在輕鏈N-末端胺處的附著，本發(fā)明的綴合物避免了因為將配體附著在FVIII多肽的活性位點可能產(chǎn)生的活性損失。認(rèn)為輕鏈N-末端區(qū)域參與vWF因子與FVIII的結(jié)合，這是循環(huán)中的穩(wěn)定結(jié)合。定義生物相容的聚合物。生物相容的聚合物包括聚環(huán)氧烷，例如但不限于聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、多聚乙酰神經(jīng)氨酸或其它基于碳水化合物的聚合物、氨基酸聚合物、生物素衍生物、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-馬來酸酐共聚物、苯乙烯-蘋果酸肝共聚物、聚惡唑啉、聚丙烯酰嗎啉、肝素、清蛋白、纖維素、殼聚糖水解產(chǎn)物、淀粉如羥乙基-淀粉和羥丙基-淀粉、糖原、瓊脂糖和其衍生物、瓜耳膠、支鏈淀粉、菊粉、黃原膠、角叉藻聚糖、果膠、藻酸水解產(chǎn)物、其它生物聚合物和其任意等同物。優(yōu)選的是聚乙二醇，且更優(yōu)選的是曱氧基聚乙二醇(mPEG)。其它有用的聚(亞烷基)二醇化合物是聚丙二醇(PPG)、聚丁二醇(PBG)、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧羰基咪唑(CDI-PEG)、分支的聚乙二醇、線性的聚乙二醇、分叉的聚乙二醇和多臂的或"超分支的，，聚乙二醇(星形-PEG)。聚乙二醇(PEG)。"PEG"和"聚乙二醇，，在本文中可互換地使用，且包括任意的水溶性的聚環(huán)氧乙烷。一般地，根據(jù)本發(fā)明使用的PEG包含下面的結(jié)構(gòu)"—(OCH2CH2)n—"，其中(n)是2訓(xùn)4000。如本文所使用的，根據(jù)末端氧是否已經(jīng)被置換，PEG也包括"—CH2CH2—0(CH2CH20)n—CH2CH2—"和"—(OCH2CH2)nO畫"。在說明書和權(quán)利要求全文中，應(yīng)當(dāng)牢記，術(shù)語"PEG"包括具有各種末端或"封端"基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，例如但不限于羥基或C,^烷氧基。術(shù)語"PEG"也指含有大多數(shù)(即大于50%)的-OCH2CH2-重復(fù)亞基的聚合物。關(guān)于具體形式，PEG可以具有任意數(shù)目的許多分子量，以及結(jié)構(gòu)或幾何形狀，如分支的、線性的、分叉的、和多功能的。PEG化。PEG化是聚乙二醇(PEG)共價附著到諸如蛋白的分子上的過程。激活的或有活性的官能團(tuán)。當(dāng)將諸如生物相容的聚合物的官能團(tuán)描述為激活的時，該官能團(tuán)可以容易地與其它分子上的親電子試劑或親核試劑反應(yīng)。B結(jié)構(gòu)域缺失的FVIII(BDD)。如本文所使用的，BDD的特征在于，具有含有FVIII的B-結(jié)構(gòu)域的14個氨基酸以外的所有缺失的氨基酸序列。B-結(jié)構(gòu)域的前4個氨基酸(SFSQ，SEQIDNO:1)連接到B-結(jié)構(gòu)域的最后10個殘基上(NPPVLKRHQR，SEQIDNO:2)(Lind,P.等，1995,Eur.J.Biochem.232，pp.19-27)。本文使用的BDD具有SEQIDNO:3的氨基酸序列。FVIII.凝血因子VIII(FVIII)是在由肝合成并釋放進(jìn)血流中的糖蛋白。在循環(huán)血液中，它結(jié)合vonWillebrand因子(vWF，也稱作因子Vlll-相關(guān)抗原)，以形成穩(wěn)定的復(fù)合物。被凝血酶激活后，它從復(fù)合物解離，以與凝結(jié)級聯(lián)中的其它凝血因子相互作用，這最終導(dǎo)致血栓的形成。人全長FVIII具有SEQIDNO:4的氨基酸序列，盡管等位基因變體是可能的。功能因子VIII多肽。如本文所使用的，功能因子VIII多肽表示功能多肽或多肽的組合，其能體內(nèi)或體外地改正人因子VIII缺陷，所述缺陷的特征在于例如血友病A。因子VIII具有許多種自然狀態(tài)的降解或加工形式。它們蛋白水解地源自前體，即一種鏈蛋白，如本文所證實的。功能因子VIII多肽包括這樣的單鏈蛋白，且還提供了這些具有改正人因子VIII缺陷的生物學(xué)活性的各種降解產(chǎn)物?？赡艽嬖诘任换蜃凅w。功能因子VIII多肽包括所有這樣的等位基因變體、糖基化的形式、導(dǎo)致因子VIII的衍生物的修飾和片段，只要它們含有人因子VIII的功能片段，且同樣基本的特征性人因子VIII功能活性保持未受影響。通過本文所述的簡單的體外測試，可以容易地鑒別出具有必需的功能活性的那些因子VIII衍生物。此外，功能因子VIII多肽能在因子IXa、鈣和磷脂存在下，催化因子X向Xa的轉(zhuǎn)化，以及改正源自患血友病A個體的血漿中的凝結(jié)缺陷。從本文的人因子VIII氨基酸序列和功能區(qū)域的序列公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白可以通過DNA的限制酶切割或人因子VIII蛋白的蛋白水解或其它降解衍生的片段。FIX。如本文所使用的，F(xiàn)IX指凝結(jié)因子IX，它也稱作人凝血因子IX,或血漿促凝血酶原激酶組分。FX。如本文所使用的，F(xiàn)X指凝結(jié)因子X，它也稱作人凝血因子X和Stuart-Prower因子。藥物代謝動力學(xué)。"藥物代謝動力學(xué)，，("PK")是用于描述藥物在身體中的吸收、分布、代謝和消除的性質(zhì)的術(shù)語。藥物的藥物代謝動力學(xué)的提高，指使藥物在體內(nèi)更有效地作為治療劑的這些特征(尤其是它在身體中的有效持續(xù)時間)的提高。突變蛋白。突變蛋白是一種基因工程改造的蛋白，其源自實驗室誘導(dǎo)的蛋白或多肽的突變。蛋白。如本文所使用的，蛋白和多肽是同義詞。FVIII清除受體。本文所使用的FVHI清除受體指功能性FVIII多肽上的受體區(qū)域，其結(jié)合或聯(lián)合一個或多個其它分子，以導(dǎo)致從循環(huán)清除FVIII。因子VIII清除受體包括但不限于FVIII分子的結(jié)合LRP、LDL受體和/或HSPG的區(qū)域。討論根據(jù)本發(fā)明的方法預(yù)見到，可以在預(yù)定位點突變?nèi)魏喂δ芤蜃覸III多肽，然后在該位點共價附著生物相容的聚合物。有用的多肽包括但不限于，具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的全長因子VIII，和具有seqidno:3所示的氨基酸序列的bddfviii。優(yōu)選的是bddfviii。在本發(fā)明的綴合物中使用的生物相容的聚合物可以是上面討論的任意聚合物。選擇生物相容的聚合物，以提供所需的藥物代謝動力學(xué)的提高。例如，選擇聚合物的特性、大小和結(jié)構(gòu)，從而提高具有fviii活性的多肽的循環(huán)半衰期，或降低多肽的抗原性，而沒有不可接受的活性降低。優(yōu)選地，聚合物包含PEG,且更優(yōu)選地其至少50%的分子量是peg。在一個實施方案中，聚合物是在末端用封端部分(如羥基、烷氧基、取代的烷氧基、鏈烯氧基、取代的鏈烯氧基、炔氧基(alkynoxy)、取代的炔氧基、芳基氧和取代的芳基氧)封端的聚乙二醇。更優(yōu)選的是包含甲氧基聚乙二醇的聚合物。更優(yōu)選的是包含曱氧基聚乙二醇的聚合物，其大小范圍為3kD-100kD,且更優(yōu)選地5kD-64kD或5kD-43kD。優(yōu)選地，聚合物具有活性部分。例如，在一個實施方案中，聚合物具有巰基活性部分，其可以與功能因子VIII多肽上的游離半胱氨酸反應(yīng)，以形成共價鍵。這樣的巰基活性部分包括硫羥、三氟曱磺酸(triflate)、2，2，2-三氟乙磺酸(tresylate)、氮丙咬、環(huán)氧乙烷、S畫吡啶基或馬來酰亞胺部分。優(yōu)選的是馬來酰亞胺部分。在一個實施方案中，聚合物是線性的，且在與巰基不強(qiáng)烈反應(yīng)的一個末端具有"帽"(如曱氧基)，而在另一個末端具有巰基活性部分。在一個優(yōu)選的實施方案中，綴合物包含PEG-馬來酰亞胺，且大小范圍為5kD-64kD。在下面的實施例中，提供了選擇有用的生物相容的聚合物的其它指導(dǎo)。通過本領(lǐng)域已知的任意方法，可以發(fā)生編碼具有FVIII活性的多肽的核苦酸序列的位點定向突變。優(yōu)選的方法包括在選擇的用于共價附著聚合物的位點處導(dǎo)入半胱氨酸密碼子的誘變。這可以如下實現(xiàn)使用可商業(yè)得到的位點定向i秀變試劑盒，如StratagenecQuickChangeTMII位點定向i秀變試劑盒、ClontechTransformer位點定向誘變試劑盒號K1600-l、InvitrogenGenTaylor位點定向誘變系統(tǒng)號12397014、PromegaAlteredSitesII體外誘變系統(tǒng)試劑盒號Q6210或TakaraMirusBioLAPCRi秀變試劑盒號TAKRR016。本發(fā)明的綴合物可以如下制備首先用半胱氨酸密碼子替代功能性FVIII多肽表面上的一個或多個氨基酸的密碼子，在重組表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)半胱氨酸突變蛋白，使突變蛋白與半胱氨酸-特異性的聚合物試劑反應(yīng)，和純化突變蛋白。在該系統(tǒng)中，在半胱氨酸位點添加聚合物，可以通過聚合物上的馬來酰亞胺活性的官能度來實現(xiàn)。在下文提供了該技術(shù)的實例。使用的巰基活性聚合物的量應(yīng)當(dāng)至少與要衍生的半胱氨酸的摩爾量等摩爾，且優(yōu)選地過量存在。優(yōu)選地，使用至少5倍摩爾過量的巰基反應(yīng)性聚合物，且更優(yōu)選地，使用至少10倍過量的這種聚合物。用于共價附著的其它條件屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)。在下面的實施例中，以本領(lǐng)域常規(guī)方式命名突變蛋白。命名突變體的慣例是基于SEQIDNO:4提供的成熟的全長因子VIII的氨基酸序列的。作為一種分泌蛋白，F(xiàn)VIII含有在翻譯過程中被蛋白水解地切割的信號序列。去除19氨基酸信號序列后，分泌的FVIII產(chǎn)物的第一個氨基酸是丙氨酸。正如常規(guī)的和本文使用的，當(dāng)提及BDDFVIII中的突變氨基酸時，通過其在全長FVIII序列中的位置命名突變氨基酸。例如，下面討論的PEG6突變蛋白命名為K1808C，因為它將在類似于全長序列的1808位置處的賴氨酸(K)改變成半胱氨酸(C)。用于共價結(jié)合聚合物的預(yù)定位點最好地選自暴露于多肽表面、不參與FVIH活性或不參與體內(nèi)穩(wěn)定化FVIII的其它機(jī)理(如結(jié)合vWF)的位點。這樣的位點還最好地選自已知參與滅活FVIII或從循環(huán)中清除FVIII的機(jī)理的那些位點。下面詳細(xì)討論了這些位點的選擇。優(yōu)選位點包括在下述對象的結(jié)合位點處或附近的氨基酸殘基(a)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白，(b)硫酸肝素蛋白聚糖，(c)低密度脂蛋白受體和/或(d)因子VIII抑制性抗體。"在結(jié)合位點處或附近"指殘基與結(jié)合位點足夠接近，從而使得生物相容的聚合物與該位點的共價附著導(dǎo)致結(jié)合位點的位阻。例如，預(yù)期這樣的位點是在結(jié)合位點的20A內(nèi)。在本發(fā)明的一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的下述位置處或附近的氨基酸殘基上(a)上面定義的因子VIII清除受體，(b)能降解因子VIII的蛋白酶的結(jié)合位點，和/或(c)因子VIII抑制性抗體的結(jié)合位點。蛋白酶可以為激活的C蛋白(APC)。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白與多肽的結(jié)合小于與未綴合時的多肽的結(jié)合，且優(yōu)選地，不到1/2。在一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得疏酸肝素蛋白聚糖與多肽的結(jié)合小于與未綴合時的多肽的結(jié)合，且優(yōu)選地，不到1/2。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得因子VIII抑制性抗體與多肽的結(jié)合小于與未綴合時的多肽的結(jié)合，優(yōu)選地，不到與未綴合時的多肽的結(jié)合的1/2。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得低密度脂蛋白受體與多肽的結(jié)合小于與未綴合時的多肽的結(jié)合，優(yōu)選地，不到1/2。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得血漿蛋白酶對多肽的降解小于對未綴合時的多肽的降低。在另一個實施方案中，血漿蛋白酶對多肽的降解不到當(dāng)多肽未綴合時在相同條件下經(jīng)相同時間段測得的對多肽的降解的1/2。使用表面等離子體共振技術(shù)(Biacore),可以確定LRP、LDL受體或HSPG對FVIII的結(jié)合親和力。例如，可以將FVIII直接地或通過FVIII抗體間接地涂布在BiacoreTM芯片上，并可以將各種濃度的LRP傳遞到芯片上，來測量相互作用的啟動速率和關(guān)閉速率(BovenschenN.等，2003,J.Biol.Chem.278(11)，pp.9370-7)。兩個速率的比給出親和力的度量。需要PEG化后親和力的2倍，優(yōu)選地5倍，更優(yōu)選地10倍，和更優(yōu)選地30倍的降低。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法，可以測量蛋白酶APC對FVIII的降解。在一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置377、378、468、491、504、556、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911和2284，且(l)綴合物與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白的結(jié)合小于未綴合的多肽與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白的結(jié)合；(2)綴合物與低密度脂蛋白受體的結(jié)合小于未綴合的多肽與低密度脂蛋白受體的結(jié)合；或(3)綴合物與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白和低密度脂蛋白受體的結(jié)合小于未綴合的多肽與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白和低密度脂蛋白受體的結(jié)合。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置377、378、468、491、504、556和711,且該綴合物與硫酸肝素蛋白聚糖的結(jié)合小于未綴合的多肽與硫酸肝素蛋白聚糖的結(jié)合。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284,且該綴合物具有比未綴合的多肽更小的與因子VIII抑制性抗體的結(jié)合。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284,且優(yōu)選地在一個或多個位置377、378、468、491、504、556和711,且該綴合物具有比未綴合的多肽更少的來自能降解因子VIII的血漿蛋白酶的降解。更優(yōu)選的，血漿蛋白酶是激活的C蛋白。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物共價附著在B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的氨基酸位置129、491、1804和/或1808，更優(yōu)選地，491或1808。在另一個實施方案中，生物相容的聚合物附著在多肽的因子VIII氨基酸位置1804，且包含聚乙二醇。優(yōu)選地，生物相容的聚合物附著的一個或多個預(yù)定位點由位點特異性的半胱氨酸突變控制。功能因子VIII多肽上的一個或多個(優(yōu)選地，一個或兩個)位點，可以是聚合物附著的預(yù)定位點。在具體的實施方案中，多肽是單-PEG化的或雙PEG化的。本發(fā)明也涉及制備綴合物的方法，其包含突變編碼功能因子VIII多肽的核普酸序列，以在預(yù)定位點用半胱氨酸殘基的編碼序列替代；表達(dá)突變的核苷酸序列，以產(chǎn)生半胱氨酸增強(qiáng)的突變蛋白；純化該突變蛋白；使突變蛋白與生物相容的聚合物反應(yīng)，所述聚合物已經(jīng)被激活，以與多肽在基本上僅還原的半胱氨酸殘基處反應(yīng)，從而形成綴合物；和純化該綴合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了位點定向PEG化因子VIII突變蛋白的方法，其包含(a)表達(dá)位點定向因子VIII突變蛋白，其中所述突變蛋白在因子VIII突變蛋白的暴露表面上用半胱氨酸替代氨基酸殘基，且該半胱氨酸被加帽；(b)在溫和地還原半胱氨酸突變蛋白和釋放帽的條件下，使半胱氨酸突變蛋白接觸還原劑；(c)從半胱氨酸突變蛋白去除帽和還原劑；和(d)去除還原劑后至少約5分鐘，且優(yōu)選地，至少15分鐘，更優(yōu)選地，至少30分鐘，在產(chǎn)生PEG化的因子VIII突變蛋白的條件下，用包含巰基偶聯(lián)部分的PEG處理半胱氨酸突變蛋白。PEG的巰基偶聯(lián)部分選自硫羥、三氟曱磺酸、2，2，2-三氟乙磺酸、氮丙啶、環(huán)氧乙烷、S-吡啶基和馬來酰亞胺部分，優(yōu)選地，馬來酰亞胺。本發(fā)明還涉及腸胃外施用的藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的綴合物和可藥用佐劑?？伤幱米魟┦强梢约尤牖钚猿煞种衼磔o助配制或穩(wěn)定化制劑且不會對患者造成顯著的有害毒理學(xué)作用的物質(zhì)。這樣的佐劑的實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，且包括水、糖如麥芽糖或蔗糖、清蛋白、鹽等。其它佐劑記載在例如E.W.Martin的Remington'sPharmaceuticalSciences中。這樣的組合物將含有有效量的綴合物以及適宜量的載體，以制備適合有效地施用給宿主的可藥用組合物。例如，綴合物可以腸胃外地施用給遭受血友病A的受試者，其劑量可以隨出血發(fā)作的嚴(yán)重性而變化。靜脈內(nèi)施用的平均劑量范圍是，對于手術(shù)前適應(yīng)癥是40單位/kg，對于微量出血是15-20單位/kg，且對于維持劑量是在8小時時間段內(nèi)施用的20-40單位/kg。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法包含，用半胱氨酸替代一個或多個表面BDD氨基酸，在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)半胱氨酸突變蛋白，還原在表達(dá)過程中已經(jīng)被生長培養(yǎng)基中的半胱氨酸加帽的半胱氨酸，去除還原劑，以允許BDD二硫鍵重新形成，和與半胱氨酸-特異性的生物相容的聚合物試劑(如PEG-馬來酰亞胺)反應(yīng)。這樣的試劑的實例是PEG-馬來酰亞胺，其中PEG大小為如5、22或43kD，可以從NektarTherapeuticsofSanCarlos,CA得到，Nektar目錄號分別是2D2M0H01mPEG-MALMW5,000Da、2D2M0P01mPEG-MALMW20kD、2D3X0P01mPEG2-MALMW40kD,或PEG大小為12或33kD，可以從NOFCorporation,Tokyo,日本得到，NOF目錄號分別是SimbrightME-120MA和SunbrightME-300MA。使用離子交換層析，純化PEG化的產(chǎn)物，以去除未反應(yīng)的PEG,并使用尺寸排阻層析來去除未反應(yīng)的BDD。該方法可以用于鑒別和選擇性地屏蔽任何與FVIII的不利反應(yīng)，如受體-介導(dǎo)的清除、抑制性抗體結(jié)合和蛋白水解酶的降解。我們注意到，Nektar或NOF提供的5kDPEG試劑在我們實驗室測得為6kD,且類似地，作為線性20kD提供的PEG試劑在我們實驗室測得為22kD,作為40kD提供的測得為43kD，且作為60kD提供的測得為64kD。為了避免混亂，在本文的討論中，我們使用在我們實驗室測得的分子量，例外是5kDPEG,我們將它記錄為與生產(chǎn)商的鑒別相同的5kD。除了在BDD的位置491和1808處的半胱氨酸突變(上面公開的)外，將位置487、496、504、468、1810、1812、1813、1815、1795、1796、1803和1804突變成半胱氨酸，以潛在地允許在PEG化之后阻斷LRP結(jié)合。同樣，將位置377、378和556突變成半胱氨酸，以允許在PEG化之后阻斷LRP和HSPG結(jié)合。選擇位置81、129、422、523、570、1864、1911、2091和2284以使其在BDD上相等地間隔開，從而使得在這些位置用大PEG(>40kD)進(jìn)行的位點定向PEG化以及在天然糖基化位點(41、239和2U8)和LRP結(jié)合位點的PEG化完全覆蓋BDD的表面，并鑒別BDD的新清除機(jī)理。在一個實施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基含有半胱氨酸，其通過形成二硫鍵，"加帽"突變蛋白上的半胱氨酸殘基。在綴合物的制備中，在重組系統(tǒng)中生產(chǎn)的半胱氨酸突變蛋白被培養(yǎng)基中的半胱氨酸加帽，且該帽被釋放帽的溫和還原去除，然后添加半胱氨酸-特異性的聚合物試劑。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會明白的，也可以使用本領(lǐng)域已知的FVIII位點特異性突變的其它方法。實施例FVIII的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系分析。FVIII和BDDFVIII是非常大的復(fù)雜分子，具有許多不同的參與生物學(xué)反應(yīng)的位點。以前共價修飾它們以提高藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)的嘗試具有混合的結(jié)果。令人驚奇的是，該分子可以被特異性地突變，然后以位點特異性的方式添加聚合物。此外，已知過去的聚合綴合物造成非特異性添加和降低的活性的問題，提高的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)和保留的活性的結(jié)果也令人驚奇。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及使用半胱氨酸-特異性的配體(如PEG-馬來酰亞胺)的位點定向誘變。未突變的BDD不具有任何可利用的與PEG-馬來酰亞胺反應(yīng)的半胱氨酸，所以僅僅突變的半胱氨酸位置將是PEG化位點。更具體地，BDDFVIII具有19個半胱氨酸，其中16個形成二硫鍵，且另外3個是游離的半胱氨酸(McMullen等，1995，ProteinSci.4，pp.740-746)。BDD的結(jié)構(gòu)模型表明，所有3個游離半胱氨酸都是隱蔽的(Stoliova-McPhie等，2002，Blood99，pp.1215-1223)。因為氧化的半胱氨酸不能被PEG-馬來酰亞胺PEG化，所以如果不首先還原，BDD中形成二硫鍵的16個半胱氨酸就不能被PEG化。基于BDD的結(jié)構(gòu)模型，如果不首先使蛋白變性，以將BDD中的3個游離的半胱氨酸暴露于PEG試劑，這些半胱氨酸就不能被PEG化。因而，似乎不可能通過在天然半胱氨酸殘基處PEG化來實現(xiàn)BDD的特異性的PEG化，而不顯著改變BDD結(jié)構(gòu)，這最可能破壞它的功能。不清楚全長FVIII的B結(jié)構(gòu)域中的4個半胱氨酸的氧化還原狀態(tài)。B結(jié)構(gòu)域中的4個半胱氨酸如果不形成二硫鍵且暴露于表面，它們就可能被PEG化。但是，因為全長FVIII和BDD具有類似的藥物代謝動力學(xué)(PK)特征和類似的體內(nèi)半衰期(Gruppo等，2003,Haemophilia9,pp.251-260),B結(jié)構(gòu)域PEG化不太可能導(dǎo)致提高的血漿半衰期，除非PEG的發(fā)生也保護(hù)非-B結(jié)構(gòu)域區(qū)域。為了確定具有FVIII活性的多肽上用于聚合物附著的預(yù)定位點，所述附著將保留因子VIII活性和提高藥物代謝動力學(xué)，基于BDDFVIII提出了下面的指導(dǎo)。修飾應(yīng)當(dāng)靶向清除、滅活和免疫原性機(jī)理，如LRP、HSPG、APC和抑制性抗體結(jié)合位點。Stoilova-McPhie.S.等，2002，Blood99(4)，pp.1215-23顯示了BDD的結(jié)構(gòu)。例如，為了延長半衰期，可以將單個PEG導(dǎo)入在A2殘基484-509和A3殘基1811-1818中的LRP結(jié)合位點處或附近的特異性位點。在這些位點導(dǎo)入大體積的PEG,會破壞FVIII結(jié)合LRP的能力，并減少FVIII從循環(huán)中的清除。還認(rèn)為，為了延長半衰期而不顯著影響活性，可以將PEG導(dǎo)入殘基1648，它位于全長分子中的B結(jié)構(gòu)域和A3結(jié)構(gòu)域的接點和A2和A3結(jié)構(gòu)域之間的BDD的14-氨基酸接頭中。通過使用重組DNA誘變技術(shù)，將單個半胱氨酸殘基工程改造進(jìn)A2或A3結(jié)構(gòu)域，隨后用半胱氨酸-特異性的PEG試劑(如PEG-馬來酰亞胺)位點特異性地PEG化導(dǎo)入的半胱氨酸，可以實現(xiàn)PEG化^的特異性。在484-509和1811-1818處PEG化的另一個優(yōu)點是，這兩個表位代表著患者的2"大類抑制性抗原位點。為了達(dá)到提高的循環(huán)半衰期和免疫原性反應(yīng)的減少的最大效果，可以將A2和A3LRP結(jié)合位點兩者PEG化，以產(chǎn)生雙PEG化的產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)指出，在1811-1818區(qū)域內(nèi)PEG化，可導(dǎo)致活性的顯著損失，因為該區(qū)域也參與FIX結(jié)合。558-565內(nèi)的位點定向PEG化應(yīng)當(dāng)廢除HSPG結(jié)合，但是也可減少活性，因為該區(qū)域也結(jié)合FIX?？梢訮EG化其它表面位點，以鑒別新的FVIII清除機(jī)理。A2結(jié)構(gòu)域的PEG化可以提供另外的優(yōu)點，因為A2結(jié)構(gòu)域在激活后會從FVIII解離，且推測由于它更小的大小，它可以比FVin分子剩余部分更快地從循環(huán)中去除。另一方面，PEG化的A2可以大得足以逃避腎清除，且具有與FVIII剩余部分相當(dāng)?shù)难獫{半衰期，從而可以體內(nèi)重建激活的FVIII。A2和A3區(qū)域中的PEG化位點的鑒別。基于高表面暴露和它們的Ca向CP軌跡的向外方向，選擇在推定的A2LRP結(jié)合區(qū)域處或附近的5個位置(與PEGl-5位置相對應(yīng)的Y487、L491、K496、L504和Q468),作為位點定向PEG化的實例。此外，這些殘基在分子的三維結(jié)構(gòu)中彼此大致等距，從而它們一起可以代表該整個區(qū)域。選擇在推定的A3LRP結(jié)合區(qū)域處或附近的8個位置(與PEG6-14相對應(yīng)的1808、1810、1812、1813、1815、1795、1796、1803、1804)，作為位點定向PEG化的實例。PEG6(K1808)鄰近1811-1818和在1810處的天然N-連接的糖基化位點。在位置1810處的PEG化(PEG7)將用PEG替代糖。在PEG8位置T1812處的突變，也將廢除糖基化位點。盡管預(yù)測PEG9位置(K1813)指向內(nèi)側(cè)，但在結(jié)構(gòu)模型不正確的情況下選擇它。PEG10(Y1815)是在LRP結(jié)合環(huán)內(nèi)的大體積的疏水氨基酸，且可以是關(guān)鍵的相互作用殘基，因為疏水氨基酸通常存在于蛋白-蛋白相互作用的中心。因為已經(jīng)凈艮道1811-1818區(qū)域會參與LRP和FIX結(jié)合兩者，所以認(rèn)為該環(huán)內(nèi)的PEG化可能導(dǎo)致降低的活性。因而，PEG11-PEG14(1795、1796、1803、1804)^皮設(shè)計成在1811-1818環(huán)附近，但是不在環(huán)內(nèi)，從而人們可以用不同的PEG大小解離LRP和FIX結(jié)合。為了同時阻斷兩個LRP結(jié)合位點，可以生成雙PEG化，例如，在PEG2和PEG6位置。因為已經(jīng)顯示558-565區(qū)域結(jié)合HSPG和FIX兩者，在該區(qū)域內(nèi)沒有設(shè)計位點。相反地，將PEG15-PEG17(377、378和556)設(shè)計在A2LRP和HSPG結(jié)合區(qū)域之間，從而使得附著的PEG可以干擾它們之間的相互作用并^皮壞可能的相互作用。也可以選擇在LRP和HPSG結(jié)合區(qū)域內(nèi)或附近的表面暴露的且指向外側(cè)的其它位點。為了鑒別新的清除機(jī)理，可以將FVIII系統(tǒng)地PEG化。除了PEG1-17以外，3個其它的天然糖基化位點，即與PEG18-20相對應(yīng)的N41、N239和N2118,可以用作PEG化的限定點(tetheringpoint),因為它們應(yīng)當(dāng)是表面暴露的。除了vWF、FIX、FX、磷脂和凝血酶的功能性相互作用位點以外，將在離PEG2、PEG6的CP原子20埃半徑內(nèi)的表面積和4個糖基化位點作圖到BDD模型上。然后，基于它們覆蓋離它們每個CP原子20埃半徑的幾乎整個剩余BDD表面的能力，選擇與Y81、F129、K422、K523、K570、N1864、T1911、Q2091和Q2284相對應(yīng)的PEG21-29。還選擇這些位置，因為它們是完全暴露的，指向外側(cè)的，且遠(yuǎn)離天然半胱氨酸，以使可能的不正確的二疏鍵形成最小化。選擇20埃半徑，因為預(yù)期大PEG(如64kD分支的PEG)具有覆蓋約20埃半徑的球的潛力。一起PEG化PEG21-29以及PEG2和PEG6和糖基化位點PEG18、19和20，可能保護(hù)幾乎整個無功能的FVHI表面。可以組合導(dǎo)致增強(qiáng)的性質(zhì)(如提高的PK特征、更大的穩(wěn)定性或減少的免疫原性)的PEG化位置，以生成具有最大增強(qiáng)性質(zhì)的多-PEG化產(chǎn)物。通過分別去除A2和A3結(jié)構(gòu)域中暴露的二硫鍵，設(shè)計PEG30和PEG31。PEG30或C630A應(yīng)釋放它的二石危鍵配偶體C711用于PEG化。同樣地，PEG31，C1899A應(yīng)允許C1903被PEG化。誘變。通過在選擇用于PEG化的位點導(dǎo)入半胱氨酸密碼子，可以生成FVIII的位點定向PEG化的底物。StratagenecQuickChangeTMII位點定向誘變試劑盒用于制備所有的PEG突變體(Stratagene試劑盒200523，購自StratageneCorporation,LaJoIIalCA)。寸吏用PfuTurboDNA聚合酶和溫度循環(huán)儀，進(jìn)行cQuikChangeTM位點定向誘變方法。使用不置換引物的PfuTurbo延伸兩種互補(bǔ)的寡核苷酸引物(其中含有所需的突變)。使用含有野生型FVIII基因的dsDNA作為模板。在多個延伸循環(huán)后，用對甲基化的DNA特異性的Dpnl內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)物。新合成的含有突變的DNA是未曱基化的，而親本野生型DNA是甲基化的。然后，將消化的DNA用于轉(zhuǎn)化XL-lBlue超感受態(tài)細(xì)胞。誘變效率是幾乎80%。在pSK207+BDDC2.6或pSK207+BDD中進(jìn)行誘變反應(yīng)(圖1)。通過DNA測序證實成功的誘變，并將含有突變的適當(dāng)片段轉(zhuǎn)入哺乳動物表達(dá)載體pSS207+BDD的FVIII主鏈中。轉(zhuǎn)移后，將所有突變再次確認(rèn)序列。對于A3突變蛋白PEG6、7、8、9和10，在載體pSK207+BDDC2.6中進(jìn)行誘變。通過測序證實后，將突變體片段Kpnl/Pme亞克隆進(jìn)pSK207+BDD中。然后，將BDD突變蛋白亞克隆進(jìn)pSS207+BDD表達(dá)載體中。對于A3突變蛋白PEGll、12、13、14,直接在栽體pSK207+BDD中進(jìn)行i秀變，且然后將確認(rèn)序列的突變體BDD亞克隆進(jìn)pSS207+BDD中。對于A2突變蛋白PEG1、2、3、4、5，在pSK207+BDDC2.6栽體中進(jìn)行誘變。將確認(rèn)序列的突變體亞克隆進(jìn)pSK207+BDD中，且然后亞克隆進(jìn)pSS207+BDD中。列出了每個反應(yīng)的誘變所使用的引物(僅有義鏈)0110PEG1,Y4B7C:GATGTCCGTCCTTTGTGCTCAAGGAGATTACCA(SEOIDNO:5)0111]PEG2,W91C:TTGTATTCAAGGAGATGCCCAMAGGT(3TAAAAC(SEQIDNO:6)0112PEG3,K496C:TTACCAAAAGGTGTATGCCATTTGAAGGATTTTC(SEQID'NO:7)0113PEG4,L504G:MGGATTTTCCMTTTGCCCAGOAGAAATATTC(8EQIDNO:8)0114PEG5,Q408C:GATTATATTTAAGAATTGCGCAAGCAGACCATAT(SEQIDNO:9)0115PEG6,K1808C:TAGAAAAAACTTTGTCTGCCCTMTGAAACCAAAAC(SEQIDNO:10)0116PEG7,NW10C:MCTTTGTCAAGCCTTGCGAAACCAAMCTTAC(SEQIDNO:1"'0117PEG8，T1812C:GTCAAGCCTAATGAATGCAAAACTTACTTTTGGA(SEQIDNO:12)0118]PEG9，K1813C:CMGCCTAATGAAACCTGCACTTACTTTTGC5AAAG(SEQIDNO:13)0119PEG10,Y1815C:CTMTGAAACCAAAAGTTGCTTTTGGAAAGTGCAAC(SEQIDPEG",D1795C:A7TTCTTATC3AGGMTGCCAC3A(3GCMC3GAGCA(SEQIDNO:1!;)0121PEG12,Q1798C:TCTTATGAGGMGATTGCAGGCMGGAGCAGAA(SEQIDNO:16)0122〗PEG13,R1803G:CAAGGAGGAGAACCTTGCAAMACTTTGTGAAGCCT(SEQIDNO:1'7)0123PEG14,K1804C:GGAGCAGAACCTAGATGCAACTTTGTCAAGCCT(SEQIDNO:18)0124PEG15，K377C:CGCTCAGTTGCCAAGTGTCATCCTAAAACTTGG(SEQIDNO:19>0125〗PEG16,TCAGTTGCCAAOAAGTGTCCTMMCTTGGGTA(SEQ,DNO:20)0126PEG17,K5鄰C:CTCCTCATCTGCTACTGCGAATCTGTAGATCAA(SEQIDNO:21)PEG18,N41C:CAAMTCTTTTCCATTCTGGACCTGAGTCGTGTAC(SEQIDNO:22>0128PEG19,N239C:GTCAATGGTTATGTATGCAGGTCTCTGCCAGGT(SEQ舊NO:23)0129PEG20,N2118C:CAGACTTATC(3A(5GATGTTCCAGT(3(3AACCTTA(8EQIDN0:24)0130PEG21,Y81C:ATCCAGGCTGAGGTTTGTGATACAGTGGTCATT(SEOIDNO:25>0131]PEG22,M29C:GAAGATGATAAAGTCTGTCCTGGTGGAAGCCAT(SEQIDNO:26)0132PEG23,K422C:CAGGGGATTGGTAOGTGTTACAMAAAGTCCGA(SEQIDNO:27>0133PEG24,K523C:GMGATGGGCCMCTTGCTCAGATCCTCGGTGC(SEQIDNO:28>0134PEG25,K570C:CAGATAATGTCAGACTGGAGGMTGTCATCCTG(SEQIDNO測0135PEG26,N1864C:CACACTAACACACTGTGTCCTGCTCATGGGAGA(SEQIDNO:30)0136PEG27,T1911C,CAGATGGMGATCCCT6CTTTAAAGAGAATTAT(SEQIDNO:31)0137]PEG28,Q2091C:ACCCAGGGTGCCCGTT(3CAAGTTCTCCAGCCTC(SEQID0138PEG29,Q2284C:MAGTAAAGGTTnTreCGGAAATCAAOACTCC(SEQID!0139〗PEG30,C630A:TTGCAGTTGTCAGTTGCTTTGCATGAGGTGGCA(SEQID0140PEG31,C1899A:AATATGGAAAGAAACGCTAGGGCTCCCTGCAAT(SEQIDNO:35)突變蛋白表達(dá)。在插入賦予對潮霉素B抗性的載體后，按照生產(chǎn)商的說明書，將PEG突變蛋白轉(zhuǎn)染進(jìn)與293Fectin轉(zhuǎn)染試劑(InvitrogenCorp.目錄號12347-019)復(fù)合的HKBll細(xì)胞(美國專利6,136,599)中。通過Coatest生色測定(ChromogenixCorp.目錄號821033，見實施例12生色測定)，評價轉(zhuǎn)染后3天的FVIII表達(dá)(表1)。然后，在補(bǔ)加了5。/oFBS的生長培養(yǎng)基中，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞置于50g/ml的潮霉素B選擇壓力下。當(dāng)出現(xiàn)潮霉素B抗性的菌落時，手工挑取它們，并通過Coatest生色測定篩選FVIII表達(dá)。然后，將FVIII表達(dá)穩(wěn)定的細(xì)胞適應(yīng)到含有HPPS補(bǔ)料的培養(yǎng)基中。擴(kuò)增細(xì)胞，并以1X106細(xì)胞/ml接種進(jìn)含有新鮮培養(yǎng)基的搖瓶中。3天后收獲的組織培養(yǎng)液(TCF)用于純化FVIIIBDD突變蛋白。通過Coatest測定TCF的FVIII活性(表1)。PEG突變蛋白效價的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表l.來自瞬時的和穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染的PEG突變蛋白的表達(dá)水平突變蛋白純化。收集含有分泌的突變蛋白FVIII蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清液后，通過0.2微米薄膜濾器過濾上清液，去除任何殘存細(xì)胞。32然后，通過超濾或陰離子交換，濃縮上清液。然后，將其應(yīng)用于免疫親和柱，在這里去除細(xì)胞培養(yǎng)基組分和大部分宿主細(xì)胞蛋白雜質(zhì)。然后通過滲濾，將免疫親和柱洗脫物緩沖液更換進(jìn)含有蔗糖的配制緩沖液中，并冷凍。通過生色測定，評定經(jīng)過單克隆Fvin抗體柱的蛋白得率和回收。測定層析運行的裝載、流通(flowthrough)、各種洗脫物級分、帶和滲濾的洗脫物樣品的FVIII活性(表2)。表2顯示了PEG2突變蛋白從單克隆抗體柱的回收?？贵w是C7F7抗體。通過生色測定確定表2的百分比回收。終得率是73%。在圖2中顯示了經(jīng)單克隆FVin抗體層析柱純化的PEG2蛋白的280nmUV吸光度關(guān)于時間的圖。使用來自AmershamBioscience的AKTAExplorer100層才斤系統(tǒng)，進(jìn)行層析。該裝置采用多波長UV-可見光監(jiān)控器和2mm流動池。在有高鹽存在下，從柱洗脫PEG2突變蛋白，且通過280nm吸光度和FVIII活性測定，指示洗脫峰。步驟%回收C7F7裝載100C7F7流通1.1C7F7洗滌0.2C7F7洗脫物86C7F7帶0.0UF/DF后73表2.來自單克隆FVIII抗體柱的PEG2突變蛋白的回收PEG化。不經(jīng)還原和在超過100倍過量的PEG:蛋白比(未顯示數(shù)據(jù))變性，半胱氨酸-特異性的PEG不能PEG化天然全長FVIII或BDD,從而證實了下述基于BDD結(jié)構(gòu)模型的假說，即所有天然半胱氨酸都形成二硫鍵，或隱蔽在FVIII內(nèi)。使用上述標(biāo)準(zhǔn)方案表達(dá)和純化的FVIII半胱氨酸突變蛋白不能被半胱氨酸-特異性的PEG馬來酰亞胺試劑PEG化，推測是因為導(dǎo)入的FVIII半胱氨酸通過與存在于細(xì)胞生長培養(yǎng)基中的巰基(如半胱氨酸和p-巰基乙醇)反應(yīng)而被"加帽"。通過從培養(yǎng)基清除半胱氨酸和P-巰基乙醇，可以潛在地解決該問題，但是這可能導(dǎo)致更低的FVIII生成，且不能預(yù)防細(xì)胞釋放的巰基封閉導(dǎo)入的FVIII半胱氨酸。在本發(fā)明的另一個方面，開發(fā)了三步方法，以允許FVIII的位點-特異性的PEG化(圖3)。在步驟1中，用還原劑如約0.7mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)或0.07mM二硫蘇糖醇(DTT)，在4n溫和地還原約1nM的純化的FVIII半胱氨酸突變蛋白30分鐘，以釋放"帽"。在步驟2中，通過尺寸排阻層析(SEC)方法，如使樣品運行經(jīng)過旋轉(zhuǎn)柱(BioRad⑧)，以允許FVIII二石克鍵重新形成，同時保持導(dǎo)入的半胱氨酸游離并還原，與"帽"一起去除還原劑。在步驟3中，去除還原劑后至少30分鐘，用至少10倍摩爾過量的大小范圍為5-64kD的PEG國馬來酰亞胺(NektarTherapeutics和N.O.F.Corporation)在4匸處理游離的FVIII半胱氨酸突變蛋白至少1小時。該方法產(chǎn)生高度一致的產(chǎn)物鐠，其對于由不同個體重復(fù)的許多反應(yīng)，具有可再現(xiàn)的數(shù)據(jù)。因為去除TCEP的旋轉(zhuǎn)柱方法不能改變比例，所以選擇凝膠過濾脫鹽層析。但是，在使用TCEP摻加樣品(spikesample)測試該方法后，顯示在柱空隙且不僅僅在鹽級分中TCEP以可測量的水平洗脫，正如從具有小分子量的分子所預(yù)見到的。蛋白印跡測定顯示顯著的背景PEG化可能是由于TCEP的不完全去除。同時，分開的實驗顯示，使用與鹽梯度相結(jié)合的陰離子交換層析介質(zhì)，可以從其它蛋白雜質(zhì)顯著地進(jìn)一步純化C7F7純化的材料。然后，決定用如上所述的TCEP還原C7F7材料，然后經(jīng)陰離子交換柱加工該材料。因為電荷差異，F(xiàn)VIII蛋白會被保留，而TCEP會流過柱，且不會被保留。同時，在梯度鹽洗脫的過程中，可以從大部分剩余蛋白雜質(zhì)中純化出FVIII蛋白。這意味著，以后發(fā)生的PEG化在理論上由于更純的原材料而更均勻。但是，用TCEP的摻加樣品測試后，發(fā)現(xiàn)可測量水平的TCEP洗脫在含有FVIII的梯度中。因此，決定在陰離子交換層析后執(zhí)行凝膠過濾脫鹽層析，從而當(dāng)依次使用這兩個步驟時，導(dǎo)致完全去除TCEP，并消除非特異性的PEG化。通過SDSPAGE和蛋白印跡進(jìn)行PEG化分析。通過還原6%Tris甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠(Invitrogen)上的電泳，可以分析PEG化產(chǎn)物。電泳后，可以用考馬斯藍(lán)染色凝膠以鑒別所有蛋白，或進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的蛋白印跡規(guī)程，以鑒別FVIII的不同區(qū)域上的PEG化模式。用分別針對FVIII重鏈C-末端區(qū)域或VIII輕鏈N-末端區(qū)域產(chǎn)生的小鼠單克隆R8B12或C7F7抗體對印跡染色，應(yīng)鑒別各鏈的PEG化。用針對FVIII的484-509區(qū)域的413抗體染色，將確定PEG化對于突變蛋白如PEGl-4是否確實是位點-特異性的。同樣地，用識別FVIII的1801-1823區(qū)域的CLB-CAgA抗體染色，將確定PEG化對于突變蛋白如PEG6-10是否確實是位點-特異性的。顯示PEG2(L491C)PEG化對重鏈的選擇性高于輕鏈，且更具體地，對484-509區(qū)域是選擇性的(圖4)，同時顯示PEG6(K1808C)對輕鏈的選擇性高于重鏈(圖5)。對于圖4所述的研究，用TCEP還原PEG2突變蛋白(泳道l和8)，隨后去除TCEP(泳道2和9)，并用5、12、22、33或43kDPEG國馬來酰亞胺處理(泳道3-7和10-14)。未PEG化的FVHI作為未經(jīng)加工的(H+L)和經(jīng)加工的重(H)和輕(L)鏈帶運行。所有3條帶都在考馬斯藍(lán)染色的凝膠上可檢測到(右下圖)，而用鏈-特異性的抗體進(jìn)行的蛋白印跡染色僅僅揭示了未經(jīng)加工的和對應(yīng)的鏈。使用R8B12染色(左上圖)，當(dāng)用PEG-馬來酰亞胺處理PEG2時，重鏈(H)帶的強(qiáng)度急劇降低，并產(chǎn)生一條新帶，它跑得比與PEG的大小成比例的母H帶更高。使用C7F7染色(左下圖)，輕鏈(L)帶(由于異質(zhì)糖基化產(chǎn)生的多條帶)不改變強(qiáng)度。兩條鏈的未經(jīng)加工的H+L帶發(fā)生移動，因為H鏈?zhǔn)俏唇?jīng)加工的FVIII的部分?？捡R斯染色也證實了比輕鏈多得多的重鏈PEG化，即H帶強(qiáng)度的降低。最后，PEG化的帶以PEG大小-依賴性的方式在413抗體染色上比R8B12染色損失相對更多的強(qiáng)度(右上圖)，推測是由于491的位點特異性的PEG化，這會阻斷413抗體與484-509的結(jié)合。對于左邊的2個凝膠，每個泳道裝栽的FVni的量是約30ng,對于右上凝膠，是約1000ng,且對于右下凝膠，是約2000ng。還原后去除還原劑，不改變FVIII的遷移(泳道1vs.2和8vs.9)。將22kDPEG加入PEG2阻斷413抗體的結(jié)合，這與491位置處的特異性的PEG化相一致(圖4右上凝膠)。這也暗示著，PEG化的PEG2在人體內(nèi)具有更低的免疫原性，因為已經(jīng)顯示413抗體具有與人A2抑制性抗體相同的表位(ScandelIa等，1992,Thromb.Haemos"7，pp.665-71)。對于圖5所述的研究，用TCEP還原PEG6突變蛋白，隨后去除TCEP(泳道1和6),并用5、12、22或33kDPEG-馬來酰亞胺處理(泳道2-5和7-10)。未PEG化的FVIII作為未經(jīng)加工的(H+L)和經(jīng)加工的重(H)和輕(L)鏈帶運行。因為PEG6(K1808)突變存在于輕鏈上，所以僅僅在輕鏈上檢測到PEG化，而在重鏈上未檢測到。對于左邊的凝膠，每個泳道裝載的FVIII的量是約100ng,而對于右邊凝膠，是約30ng。在用超過100倍摩爾過量的PEG-馬來酰亞胺處理后，甚至在上述的還原和還原劑去除操作后，作為對照運行的BDD沒有表現(xiàn)出任何顯著的PEG化(圖6a)。相同的方法也應(yīng)用于PEG4和PEG5(圖6a)。與PEG2相比，這些突變蛋白未同樣有效地PEG化，但是它們對重鏈的選擇性類似于PEG2(L491C)。PEG6(K1808C)PEG化效率相對較低，可能是因為它非常接近N1810處的N-連接的糖基化位點，它會阻斷位置1808處的PEG化。因而，我們設(shè)計了PEG7(N1810C)來去除1810處的天然糖基化位點。與PEG6相比，在頭對頭的對比中，PEG7表現(xiàn)出提高的PEG化效率(圖6b)。類似地，PEG15表現(xiàn)出比PEG2略微更好的PEG化效率。PEG2+6(BDD的雙重突變體)可以在重鏈和輕鏈兩者上PEG化，因為PEG2是重鏈半胱氨酸突變，而PEG6是輕鏈突變(圖6c)。該方法也應(yīng)用于野生型全長FVIII(圖6d)。檢測PEG化的最大重鏈片段，其包括Al、A2和大部分B結(jié)構(gòu)域。PEG化模式暗示著單PEG化，且僅存在單個PEG化的半胱氨酸。通過凝血酶切割和蛋白印跡進(jìn)行PEG化分析。在37X:用凝血酶(40IU/ugFVIII)處理PEG化的產(chǎn)物30分鐘。使用的凝血酶也含有APC作為污染物。凝血酶切割將從重鏈產(chǎn)生50kDAl和43kDA2結(jié)構(gòu)域，而APC切割將A2結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步分離成21和22kD片段(圖7)。用識別重鏈C-末端的R8B12抗體染色，只能鑒別完整的A2結(jié)構(gòu)域和21kDC-末端片段(FVIII562-740)。因而，如果PEG2PEG化是對位置491特異性的，那么43kDA2結(jié)構(gòu)域會被PEG化，但是21kDC國末端片段不會。這確實得到了圖7所示的22kDPEG化的PEG2的蛋白印跡的證實。因而，通過消除，PEG2PEG化已經(jīng)定位在A2結(jié)構(gòu)域的N-末端22kD片段(FVIII373-561)。因為在pH6.8時PEG-馬來酰亞胺對半胱氨酸是完全選擇性的，且僅僅在373-561內(nèi)的天然FVIII半胱氨酸來自528和554之間的隱蔽二硫鍵，所以PEG2非?？赡茉谖恢?91導(dǎo)入的半胱氨酸上PEG化。用FVIII重鏈N-末端抗體對凝血酶-處理的PEG化的PEG2的蛋白印跡染色顯示，Al結(jié)構(gòu)域沒有PEG化(未顯示數(shù)據(jù))。對于5、12、33和43kD的PEG，還已經(jīng)證實了使用凝血酶切割方法對PEG2的選擇性PEG化(未顯示數(shù)據(jù))。PEG化的野生型全長FVIII的凝血酶切割顯示，僅僅B結(jié)構(gòu)域被PEG化(圖8)。通過碘染色進(jìn)行PEG化分析。為了證實在考馬斯藍(lán)和蛋白印跡染色上新生成的帶確實是PEG化的帶，使用了鋇-碘染色，它對PEG是特異性的(圖9)。將PEG化的PEG2在6%Tris甘氨酸凝膠(Invitrogen)上電泳，并用R8B12重鏈抗體或鋇-碘溶液染色(Lee等，PharmDevTechnol.19994:269-275)。通過使用分子量標(biāo)記將它們排隊，在兩種染色之間匹配PEG化的帶，從而證實FVIII重鏈PEG化。通過MALDI-質(zhì)鐠法進(jìn)行PEG化分析。為了證實重鏈A2結(jié)構(gòu)域的PEG化，通過基質(zhì)輔助的激光解吸/離子化(MALDI)質(zhì)譜法，分析PEG化之前和之后的rFVIII樣品?；旌蠘悠?，并在MALDI靶平板上結(jié)晶，其中使用溶于30%乙腈、0.1%TFA中的芥子酸基質(zhì)。然后在陽性線性模式的VoyagerDE-PRO分光計中分析它們。圖10顯示的結(jié)果表明，PEG2的輕鏈集中在83kD，且重鏈(HC)集中在89kD。為PEG化的樣品獲得的光譜顯示了HC峰的下降和集中在111kD的新峰的形成。這證實了重鏈的PEG化。在檢出限以上沒有觀察到PEG化的輕鏈(在105kD)。然后將兩種樣品進(jìn)行凝血酶消化，以20單位凝血酶/mgFVIII,在37'C消化30分鐘，隨后通過氨基酸分析測定FVIII濃度(CommonwealthBiotechnologies,Inc)。將重鏈切割成46kD(Al)N-末端級分和43kD(A2)級分。從PEG化的樣品(圖11)得到的MALDI光譜顯示了43kD峰的損失和新的65kD峰的發(fā)展，這是由于PEG化的A2結(jié)構(gòu)域。在檢出限以上仍然沒有觀察到LC的PEG化。這些結(jié)果再次證實了FVIII的A2結(jié)構(gòu)域的PEG化。將相同的分析應(yīng)用于PEG化的PEG6，從而證實了輕鏈A3C1C2片段的PEG化(圖12)?；钚詼y量凝結(jié)測定。凝固FVIII:C測試方法是基于活化部分凝血激酶時間(aPTT)的一階段測定。在有因子IXa、鈞和磷脂存在下，F(xiàn)VIII起因子X向Xa的酶促轉(zhuǎn)化的輔因子作用。在該測定中，將稀釋的測試樣品與FVIII缺乏的血漿底物和aPTT試劑的混合物一起在371C溫育。將氯化鈣加入溫育混合物，并開始凝固。形成凝塊所需的時間(秒)和FVIII:C的濃度的對數(shù)之間存在反相關(guān)。通過對比測試材料的各種稀度的凝固時間和從已知活性的標(biāo)準(zhǔn)材料的系列稀釋構(gòu)建的曲線，內(nèi)推未知樣品的活性水平，并以國際單位/mL(IU/mL)為單位進(jìn)行報告。生色測定。生色測定方法由兩個連續(xù)步驟組成，其中顏色的強(qiáng)度與FVIII活性成比例。在第一步中，在有最佳量的鉤離子和磷脂存在下，F(xiàn)IXa和它的輔因子FVIIIa將因子X活化為FXa。存在過量的因子X，從而使得因子X的活化速率僅僅依賴于FVIII的量。在第二步中，因子Xa水解生色底物，以產(chǎn)生生色團(tuán)，并在405nm光度測定地讀出顏色強(qiáng)度。計算未知物的效能，并用斜率比統(tǒng)計學(xué)方法檢查該測定的有效性。以國際單位/mL(IU/mL)為單位報告活性。1811-1818環(huán)參與與FIX的結(jié)合，但是尚未確定該環(huán)內(nèi)單個位置的重要性。相對于天然FVIII，PEG7-10突變蛋白表現(xiàn)出幾乎一致的比生色活性(表3)。表3顯示了PEG突變蛋白和PEG化的PEG2或PEG6相對于BDD的百分比比活性(S.A.)。通過將生色、凝結(jié)或vWF結(jié)合活性除以總抗原ELISA(TAE)值，確定S.A.。然后，將PEG化的突變蛋白的S.A.除以BDD的S.A.(8IU/ug生色，5IU/ug凝結(jié)，和1vWF/TAE),并乘以100,以得到表3中列出的百分比S.A.，標(biāo)題為生色、凝結(jié)和vWF/TAE。<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表3.PEG突變蛋白和PEG化的PEG2和PEG6相對于BDD的百分比比活性(S.A.)如表3中所使用的，"PEG2red"是已經(jīng)用還原劑處理、然后去除還原劑的PEG2突變蛋白。該還原方法不顯著改變FVIII的3種功能活性。綴合到5kD(PEG2-5kD)至43kD(PEG2-43kD)的PEG上的PEG2突變蛋白，不損失顯著量的生色活性，但是隨著PEG大小增加至超過5kD,具有明顯更低的凝結(jié)活性。對于更大尺寸的PEG化的PEG2,也存在vWF結(jié)合的適度降低。總抗原ELISA(TAE)。將FVIII捕獲到已經(jīng)用多克隆FVIII抗體包被的微量滴定板上。用生物素化的多克隆rFVIII抗體和鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧化物酶(HRP)綴合物，檢測結(jié)合的FVIII。過氧化物酶-鏈霉抗生物素蛋白復(fù)合物在加入四曱基聯(lián)苯胺(TMB)底物后，產(chǎn)生顏色反應(yīng)。使用4參數(shù)擬合模型，從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推樣品濃度。以ng/mL報告FVIII結(jié)果。vWF結(jié)合ELISA。允許FVIII結(jié)合嚴(yán)重血友病血漿溶液中的vWf。然后，將FVIII-vWf復(fù)合物捕獲到已經(jīng)用vWf-特異性的單克隆抗體包被的微量滴定板上。使用FVIII多克隆抗體和辣根過氧化物酶-抗-兔綴合物，檢測結(jié)合到vWf上的FVIII。過氧化物酶-綴合的抗體復(fù)合物在加入底物后產(chǎn)生顏色反應(yīng)。使用4參數(shù)擬合模型，從標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)推樣品濃度。以Hg/mL報告FVIII結(jié)合結(jié)果。PEG化后對任何活性沒有顯著影響，這與在B結(jié)構(gòu)域的PEG化相一致。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>表4.用不同大小的PEG進(jìn)行PEG化之前和之后的野生型全長FVIII(KG-2)的比活性(S.A.)通過離子交換層析純化PEG化的FVIII。將PEG化的FVIII應(yīng)用于陰離子交換柱或陽離子交換柱，其中蛋白結(jié)合到柱上，同時任何過量的游離PEG試劑不結(jié)合，并在流通中去除。然后用氯化鈉梯度，從柱洗脫PEG突變蛋白。使用鋇-碘染色的裝載、流通和梯度級分的4-12"/。Bis-Tris凝膠，證實柱洗脫級分具有PEG化的突變蛋白。通過尺寸排阻層析純化PEG化的FVIII。合并含有大部分PEG2突變蛋白的陰離子交換級分，并通過超濾濃縮，然后應(yīng)用于尺寸排阻柱。然后，使用配制緩沖液洗脫柱。因為蛋白大小和形狀的差異取決于PEG是否結(jié)合在蛋白上，所以該柱可以分離PEG化的PEG2突變蛋白和任何剩余的未PEG化的PEG2?；诰哂写蟛糠諪VIII活性，合并PEG化的突變蛋白FVIII級分，然后冷凍用于后續(xù)動物研究和分子表征。圖13對比了未-PEG化的PEG2突變蛋白的洗脫和"kDPEG化的PEG2突變蛋白的洗脫。PEG化的PEG2洗脫明顯更早，這指示著由于共價附著的PEG導(dǎo)致的大小和形狀的增加。利用表現(xiàn)出更低PEG化效率(即小于50%)的突變蛋白(如PEG6)，產(chǎn)生高純度單-PEG化產(chǎn)物的最有效純化方案是，使用陽離子交換層析和隨后的尺寸排阻層析的組合。例如，利用PEG6,陽離子交換層析可以從大多數(shù)未-PEG化的PEG6(晚期洗脫級分，圖15)中純化出PEG化的PEG6(早期洗脫級分，圖14)。然后，尺寸排阻層析從殘存的未-PEG化的蛋白(晚期洗脫級分，圖15)中純化出PEG化的蛋白(早期洗脫級分，圖15)。PEG大小對活性的作用。為了測試PEG大小是否對PEG化后的FVIII的凝結(jié)和生色活性有作用，用TCEP還原純化的全長FVIII、PEG2、PEG6和PEG14，然后去除還原劑，并與緩沖液對照或6kD-64kD的PEG反應(yīng)。不經(jīng)去除過量的PEG或未PEG化的FVIH，直接測定得到的PEG化的FVIII。對照實驗表明，過量的PEG對FVIII活性無作用。圖16顯示了該研究的結(jié)果。在圖16中，將純化的全長FVIII表達(dá)為KG-2。通過將還原并去除還原劑后用PEG處理的樣品的值除以用緩沖液對照處理的樣品的值，同時考慮PEG化得率，確定圖16中報告的百分比活性。對于任何給定的FVIII構(gòu)建體，所有PEG的PEG化得率是相當(dāng)?shù)?。對于KG-2、PEG2和PEG14，它們是約80%,對于PEG6，是約40%。例如，PEG14緩沖液對照處理的具有6.8IU/mL的凝結(jié)活性，相比而言，12kDPEG化的PEG14樣品具有3.2IU/mL。但是，PEG化效率是約80%,這意味著3.2IU/mL代表著約80%PEG化和約20。/o未PEG化的合計活性。假定未PEG化的樣品具有與緩沖液對照處理的PEG14相同的活性，PEG化的PEG14的未PEG化的百分比活性計算為34%=(3.2-6.8乘以20%)/(6.8乘以80%)。當(dāng)PEG大小增加到超過6kD時，在BDD的PEG2、PEG6或PEG14位置處A2或A3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的PEG化，導(dǎo)致凝結(jié)活性的急劇損失。但是，在全長FVIII的天然B-結(jié)構(gòu)域半胱氨酸處B結(jié)構(gòu)域內(nèi)的PEG化，對凝結(jié)活性無作用。令人感興趣地，所有PEG化的構(gòu)建體的生色活性不受影響。這可能是由于測定差異。小生色肽底物可能比在凝結(jié)測定中使用的更大蛋白底物更容易接近PEG化的FVIII/FIX/FX復(fù)合物?；蛘?，PEG可能影響突變蛋白的激活。一階段凝結(jié)測定可以比二階段生色測定更容易地檢測到這一點。為了證實PEG對PEG2、6和14的凝結(jié)活性的作用的觀察，從過量PEG和未PEG化中純化出幾種PEG化的構(gòu)建體。由于PEG對生色活性沒有任何作用，生色對凝結(jié)活性比可以較好地評價PEG對凝結(jié)活性的相對作用(表5)。在給定位置(如PEG2)處更大的PEG和更高數(shù)目的PEG(如在PEG2+6構(gòu)建體的情況下)，誘導(dǎo)更大的凝結(jié)活性損失。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>表5.純化的PEG化的BDD的生色對凝結(jié)比。*分支的PEG兔PK研究。為了理解PEG化對FVIII的藥物代謝動力學(xué)(PK)的作用，在許多物種中進(jìn)行了PK研究。將NZWSPF兔用于研究10只雌性，每組5只兔，分成2組(PEG2FVIII和22kDPEG化的PEG2)。在無菌PBS中稀釋樣品，終濃度為100IU/mL(生色單位)。每只兔子通過邊緣耳靜脈接受1ml/kg(100IU/kg)劑量的稀釋的測試或?qū)φ盏孜?。在注射后的各個時間，在給藥后確定的時間點，從中央耳動脈抽取血液樣品(lmL)到lmL注射器中(裝有100fiL3.8%檸檬酸鈉)。將血漿樣品與包被在96-孔平板上的R8B12重鏈抗體一起溫育，以特異性地捕獲給藥的人FVIII。通過生色測定，確定捕獲的FVIII的活性(圖17)。還將PEG化的PEG2和PEG化的PEG6與BDD相對比(圖18和19)，其中PEG化的突變蛋白表現(xiàn)出與BDD相比血漿回收的提高。PEG化的野生型全長FVIII沒有表現(xiàn)出很大提高(圖20)。小鼠PK研究。作為第二個物種，在PK研究中使用ICR正常的或血友病的、FVIH缺陷的小鼠(Taconic,Hudson,NY)。在該研究中使用正常小鼠，每個時間點每組5只小鼠。將測試材料稀釋進(jìn)配制緩沖液中，至標(biāo)稱終濃度25IU/mL。通過尾靜脈，給每只小鼠施用4mL/kg(約0.1mL總體積)的稀釋的測試材料。在指定的時間點，從下腔靜脈抽取血液樣品(對于正?；蜓巡⌒∈笱芯?，分別是0.45或0.3mL)到1mL注射器中(對于正?；蜓巡⌒∈笱芯?，分別裝有50或303.8%檸檬酸鈉)(每份樣品一只動物)。使用上述的生色測定方法，測定血漿樣品的FVIII濃度。與BDD或PEG6相比，PEG化的PEG6表現(xiàn)出更大的血漿回收(圖21)。與BDD相比，PEG化的PEG2表現(xiàn)出更大的血漿回收(圖22和23)。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表6.PEG化的FVIII的PK研究總結(jié)，顯示了以小時計的血漿半衰期。*在兔中具有9.6小時半衰期的"kDPEG化的PEG6的初始制品(prep)的純度不如產(chǎn)生17.4小時的晚期制品。<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表7.PEG化的PEG突變蛋白在血友病小鼠中的血漿回收。報告了在注射后16小時的血漿回收與在相同時間進(jìn)行的BDD對照相比的提高倍數(shù)。血友病小鼠(BDD)因子VIII回收。圖24所示的血友病小鼠(BDD)因子VIII回收柱狀圖描繪了在血友病小鼠測定中兩種BDD因子VIII半衰期的藥物代謝動力學(xué)(PK)評價。該測定設(shè)計用于在小鼠模型的靜脈內(nèi)施用后的3個時間點，測量BDD因子VIII(在圖24中稱作"wt"或野生型BDD因子VIII)和BDD因子VIII的PEG2+6雙PEG化變體(在本文其它地方稱作BDD因子VIII的L491C，K1808C雙變體)的血漿濃度。盡管在0.8和4小時時間點的PK評價是相當(dāng)?shù)?，?6小時評價是特別值得注意的。在16小時，與未-PEG化的分子相比，殘存在施用后16小時的小鼠血漿中的雙PEG化的BDD因子VIII變體(PEG2+6)的量是約4倍(400%)。腎撕裂傷模型。為了測定PEG化的FVIII突變蛋白是否能有效地終止血友病小鼠的出血，使用了腎撕裂傷模型。用異氟烷麻醉血友病小鼠(具有破壞的FVHI基因的C57/BL6)，并稱重。暴露下腔靜樂jc，并使用31號針注射100ul鹽水或FVIII。小心地取下針，壓迫注射點30-45秒，以防止出血。2分鐘后，暴露右腎，并沿著垂直軸將其保持在鑷子間。使用15號解剖刀，水平地切入腎3mm深度。為了確保損傷的均勻深度，輕輕將腎保持在中央，以在鑷子的每一側(cè)暴露相等的組織。將暴露的腎表面切至鑷子的深度。如上所述定量失血。對小鼠測試不同劑量的FVIII,以表征FVHI對腎出血的劑量反應(yīng)關(guān)系。在小鼠腎損傷后，PEG化的PEG2表現(xiàn)出與BDD相當(dāng)?shù)臏p少失血的效能(圖25)。因而，盡管PEG化的PEG2的凝結(jié)活性低于BDD，但該腎撕裂傷模型表明，與BDD相比，PEG化的PEG2的體內(nèi)效力沒有可測量的降低，這與生色測定數(shù)據(jù)相一致?？贵w抑制測定。在位置491特異性地添加高分子量聚合物如聚乙二醇(PEG)(即PEG2)，應(yīng)降低對mAB413的結(jié)合和敏感性，并擴(kuò)展至大部分患者抑制性抗體，因為許多患者發(fā)展針對相同mAB413表位的抑制性抗體。為了測試這一點，將遞增量的mAB413與非飽和量(0.0(BIU/mL)的BDD或43kDPEG化的PEG2—起溫育，并在生色測定中測試功能活性(圖26)。R8B12(—種非抑制性抗體)和ESH4(一種靶向C2結(jié)構(gòu)域的抑制性抗體)用作對照。PEG化的PEG2對mAB413抑制的抗性確實超過對BDD，并在有不結(jié)合491位置附近的對照抗體存在下，表現(xiàn)出類似的抑制模式。此外，PEG抗mAB413抑制的保護(hù)作用依賴于PEG大小，其中更大的PEG具有更大的作用(圖27)。為了測試PEG化的FVIII是否更抗來自患者的抑制劑抗體，在有一組源自血友病A患者(它們已經(jīng)發(fā)展了對FVIII的抑制劑)的血漿存在下，測量生色活性。在測試的8份患者血漿中，43kDPEG化的PEG2對患者血漿抑制的抗性比4份患者血漿樣品中的BDD的更高。例如，PEG化的PEG2、PEG6或PEG2+6在一份患者血漿中表現(xiàn)出比BDD更大的殘余活性，但是在另一份血漿中并非如此(圖28)。雙PEG化的PEG2+6似乎比單PEG化的PEG2或PEG6的抗性更高。這些結(jié)果表明，PEG化的PEG突變蛋白可以更有效地治療已經(jīng)發(fā)展對FVIII的抑制劑的患者。高通量PEG化篩選。特定PEG突變蛋白的PEG化效率是不可預(yù)測的，特別是由于沒有BDD的直接結(jié)構(gòu)信息。例如，基于BDD的結(jié)構(gòu)模型，人們可以預(yù)測PEG4和PEG5的PEG化效率非常高，類似于PEG2和PEG15的PEG化效率，因為根據(jù)結(jié)構(gòu)，所有3個位置都是表面暴露的，且朝向外側(cè)。因而，為了使用PEG通過系統(tǒng)的PEG化來搜索新的清除機(jī)理，需要篩選大量的突變蛋白。為了快速地篩選大量的PEG突變蛋白，已經(jīng)開發(fā)了新的高通量方法，其可以測試來自瞬時轉(zhuǎn)染的突變蛋白的PEG化產(chǎn)物的PEG化效率和功能活性。使用Amicon-centraUltra裝置MWCO30K,將少至5-10mL的具有低至0.1-0.2IU/mL的FVIII生色值的瞬時表達(dá)的PEG突變蛋白濃縮約50倍，從而使得FVIII的濃度達(dá)到1nM以上，接近抗體與FVIII相互作用的親和范圍。將濃縮的PEG突變蛋白(約300uL)與約30uL的C7F7FVIII抗體樹脂一起在4。C溫育過夜，洗滌，洗脫，滲析，并還原。去除還原劑，PEG化還原的PEG突變蛋白，在蛋白印跡上運行，如上所述(圖29和30)。瞬時表達(dá)的PEG突變蛋白的相對PEG化效率準(zhǔn)確地匹配純化的PEG突變蛋白。通過該方法，在1-2個月內(nèi)，可以篩選許多PEG突變蛋白。例如，PEG14(K1804CBDD)具有至少約80%用12kDPEG對輕鏈的PEG化，而沒有PEG化的重鏈(未顯示數(shù)據(jù))，這與位于輕鏈上的K1804C突變相一致?；贐DD結(jié)構(gòu)，K1804和K1808之間的C至CJ巨離(PEG6位置)僅是8.4埃，從而表明在該位置導(dǎo)入43kDPEG具有與33kDPEG化的PEG6相似的PK提高，優(yōu)點是高得多的PEG化得率。在表8中總結(jié)了測試的所有PEG突變蛋白的相對PEG化得率。PEG化對其中導(dǎo)入了半胱氨酸突變的特定FVIII鏈?zhǔn)歉叨冗x擇性的，因為每個在重鏈中具有半胱氨酸的突變蛋白僅在重鏈上被PEG化，而每個在輕鏈中具有半胱氨酸的突變蛋白僅在輕鏈上被PEG化。突變蛋白號2-31代表著BDD的半胱氨酸突變，其用半胱氨酸替代在列出的位置處的天然氨基酸。PEG2+6是BDD的雙突變蛋白，其中位置491和1808被半胱氨酸替代。Al和A2(和KG-:2(即全長FVHI)的B結(jié)構(gòu)域)屬于重鏈，而A3、C1和C2屬于輕鏈。通過在SDSPAGE上電泳PEG化的產(chǎn)物，對比PEG化的帶和未PEG化的帶的強(qiáng)度，估計PEG化效率+++約〉80。/oPEG化得率，++約30^70%得率，+約10-30%得率，-約<10%得率。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>表8各種PEG化的FVIII的PEG化效率還原的PEG突變蛋白的質(zhì)語法分析。為了確定預(yù)防PEG突變蛋白或全長FVIII的直接PEG化的"帽"的特性，用濃度范圍為67uM-670uM的TCEP還原PEG2+14。PEG化得率與遞增量的TCEP成比例地增加(圖31)。在PEG化之前，還通過質(zhì)譜法分析相同的樣品(圖32)。為了得到可以直接研究的蛋白結(jié)構(gòu)域，在371C，用比率為20單位/mgFVIII的凝血酶消化樣品30分鐘。凝血酶切割產(chǎn)生A2片段，其包括殘基372-740，且沒有占據(jù)的糖基化位點。將消化的樣品注射到C4反相液相層析系統(tǒng)上，且通過電噴射界面，將來自柱的洗脫液直接導(dǎo)入四極飛行時間質(zhì)語儀中。解巻積與A2結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)的層析峰以下的質(zhì)i普，以提供蛋白的完整質(zhì)量值。在還原之前，PEG^"的A2結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生比理論預(yù)測大118道爾頓的質(zhì)量。隨著TCEP濃度的增加，出現(xiàn)一個新峰，它具有A2結(jié)構(gòu)域的準(zhǔn)確預(yù)測質(zhì)量。該新峰的比例隨著TCEP濃度的增加而增加。118道爾頓差異可以歸因于在殘基Cys491處與半胱氨酸(119Da)形成二硫鍵的半胱氨酰化和儀器準(zhǔn)確度。因而，這表明，PEG突變蛋白可以被半胱氨酸加帽，這會阻止直接的PEG化。本文公開的所有文獻(xiàn)都在本文中整體引作參考。權(quán)利要求1.具有因子VIII前凝血劑活性的綴合物，其包含在多肽上的一個或多個預(yù)定位點共價附著到一個或多個生物相容的聚合物的功能因子vni多肽，其中所述預(yù)定位點不是N-末端胺。2.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物包含聚乙二醇。3.權(quán)利要求2的綴合物，其中所述聚乙二醇包含甲氧基聚乙二醇。4.權(quán)利要求3的綴合物，其中所述甲氧基聚乙二醇的大小范圍為5kD-64kD。5.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的下述位置處或附近的氨基酸殘基上(a)因子VIII清除受體的結(jié)合位點，(b)能降解因子VIII的蛋白酶的結(jié)合位點，和/或(c)因子VIII抑制性抗體的結(jié)合位點。6.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白與多肽的結(jié)合小于與未綴合時的多肽的結(jié)合。7.權(quán)利要求6的綴合物，其中所述低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白與綴合物的結(jié)合不到與未綴合時的多肽的結(jié)合的1/2。8.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得硫酸乙酰肝素蛋白聚糖與多肽的結(jié)合小于與未綴合時的多肽的結(jié)合。9.權(quán)利要求8的綴合物，其中所述硫酸肝素蛋白聚糖與綴合物的結(jié)合不到與未綴合時的多肽的結(jié)合的1/2。10.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得因子VIII抑制性抗體與多肽的結(jié)合小于與未綴合時的多肽的結(jié)合。11.權(quán)利要求10的綴合物，其中所述因子VIII抑制性抗體與綴合物的結(jié)合不到與未綴合時的多肽的結(jié)合的1/2。12.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得低密度脂蛋白受體與多肽的結(jié)合小于與未綴合時的多肽的結(jié)合。13.權(quán)利要求12的綴合物，其中所述低密度脂蛋白受體與綴合物的結(jié)合不到與未綴合時的多肽的結(jié)合的1/2。14.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在功能因子VIII多肽的預(yù)定位點，從而使得血漿蛋白酶對多肽的降解小于對未綴合時的多肽的降解。15.權(quán)利要求14的綴合物，其中所述血漿蛋白酶對多肽的降解不到當(dāng)多肽未綴合時在相同條件下經(jīng)相同時間段測得的對多肽的降解的1/2。16.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在多肽的因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、l卯3、1911、2091、2118和2284之一處。17.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置377、378、468、491、504、556、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911和2284，且其中(1)綴合物與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白的結(jié)合小于未綴合的多肽與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白的結(jié)合；(2)綴合物與低密度脂蛋白受體的結(jié)合小于未綴合的多肽與低密度脂蛋白受體的結(jié)合；或(3)綴合物與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白和低密度脂蛋白受體的結(jié)合小于未綴合的多肽與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白和低密度脂蛋白受體的結(jié)合。18.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置377、378、468、491、504、556和711，且另外其中所述綴合物與硫酸肝素蛋白聚糖的結(jié)合小于未綴合的多肽與硫酸肝素蛋白聚糖的結(jié)合。19.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284,且所述綴合物具有比未綴合的多肽更小的與因子VIII抑制性抗體的結(jié)合。20.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在多肽的一個或多個因子VIII氨基酸位置81、129、377、378、468、487、491、504、556、570、711、1648、1795、1796、1803、1804、1808、1810、1864、1903、1911、2091、2118和2284，且該綴合物具有比未綴合的多肽更少的來自能降解因子VIII的血漿蛋白酶的降解。21.權(quán)利要求20的綴合物，其中所述血漿蛋白酶是激活的C蛋白。22.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述功能因子VHI多肽是B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII。23.權(quán)利要求22的綴合物，其中所述生物相容的聚合物共價附著在B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的氨基酸位置129、491、1804和/或1808。24.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物附著在多肽的因子VIII氨基酸位置1804，且包含聚乙二醇。25.權(quán)利要求1的綴合物，其中所述生物相容的聚合物附著的一個或多個預(yù)定位點由位點特異性的半胱氨酸突變控制。26.制備權(quán)利要求l的綴合物的方法，其包含突變編碼功能因子VIII多肽的核苷酸序列，以在預(yù)定位點用半胱氨酸殘基的編碼序列替代；表達(dá)所述突變的核苷酸序列，以產(chǎn)生半胱氨酸增強(qiáng)的突變蛋白；純化所述突變蛋白；使所述突變蛋白與生物相容的聚合物反應(yīng)，所述聚合物已經(jīng)被激活，以與多肽在基本上僅還原的半胱氨酸殘基處反應(yīng)，從而形成綴合物j和純4匕該綴合物。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述生物相容的聚合物包含聚乙二醇。28權(quán)利要求"的方法，其中通過加入可以與蛋白中的半胱氨酸特異性地反應(yīng)的馬來酰亞胺基因，激活聚乙二醇。29.用于腸胃外施用的藥物組合物，其包含治療有效量的權(quán)利要求1的綴合物和可藥用佐劑。30.治療血友病的方法，其包含，給需要的患者施用有效量的權(quán)利要求29的組合物。31.位點定向PEG化因子VIII突變蛋白的方法，其包含(a)表達(dá)位點定向因子VIII突變蛋白，其中所述突變蛋白在因子VIII突變蛋白的暴露表面上用半胱氨酸替代氨基酸殘基，且該半胱氨酸被加帽；(b)在溫和地還原半胱氨酸突變蛋白和釋放帽的條件下，使半胱氨酸突變蛋白接觸還原劑；(c)從半胱氨酸突變蛋白去除帽和還原劑；和(d)去除還原劑后至少約5分鐘，在產(chǎn)生PEG化的因子VIII突變蛋白的條件下，用包含巰基偶聯(lián)部分的PEG處理半胱氨酸突變蛋白。32.權(quán)利要求31的方法，其中在步驟(c)中，通過尺寸排阻或離子交換層析，從半胱氨酸突變蛋白去除帽和還原劑。33.權(quán)利要求31的方法，其中所述因子VIII突變蛋白是B-結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII的突變蛋白。34.權(quán)利要求31的方法，其中所述PEG-馬來酰亞胺的大小范圍為5kD-64kD。35.權(quán)利要求31的方法，其中PEG的巰基部分選自石危羥、三氟甲磺酸、2，2，2-三氟乙磺酸、氮丙啶、環(huán)氧乙烷、S-吡啶基和馬來酰亞胺部分。全文摘要本發(fā)明涉及因子Ⅷ突變蛋白，其在非N-末端胺的預(yù)定位點共價結(jié)合到一個或多個生物相容的聚合物，如聚乙二醇上。突變蛋白綴合物保留了FⅧ前凝血劑活性，且具有提高的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)。文檔編號C07K1/00GK101124331SQ200580046469公開日2008年2月13日申請日期2005年11月14日優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日發(fā)明者H·坦德拉,J·E·墨菲,J·S·斯特勞斯,T·巴內(nèi)特,亮唐,梅柏松,汪德潛,潘小群,陳建敏申請人:拜爾健康護(hù)理有限責(zé)任公司