本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-LVK及其基因。

背景技術(shù)：

木聚糖酶在許多工業(yè)中被廣泛應(yīng)用，如飼料行業(yè)、造紙行業(yè)和食品行業(yè)。然而，在這些應(yīng)用中，往往需要酶具有良好的耐熱性，寬廣的pH和較高的比活。所以，人們不斷去尋找新的具有優(yōu)良性能的可用木聚糖酶，并通過隨機(jī)突變或者理性設(shè)計(jì)方法來提高它的性能。其中，來源于瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）的木聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域xyn-CD，通過易錯PCR將其隨機(jī)突變得到的重組木聚糖酶xyn-CDBFV（其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，基因序列如SEQ ID NO.6所示）擁有較高的酶活、較寬的pH和良好的耐熱性。因此，重組木聚糖酶xyn-CDBFV在工業(yè)產(chǎn)品中具有廣泛的應(yīng)用前景。目前，Cheng, Y.S等詳細(xì)解析了該蛋白的結(jié)構(gòu)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)提出了該蛋白的耐熱因素（Cheng，Y.S. et al.（2014）Structural Analysis of a Glycoside Hydrolase Family 11 Xylanase from Neocallimastix patriciarum: Insights into the Molecular Basis of a Thermophilic Enzyme. J. Biol. Chem. ）。xyn-CDBFV具有11家族木聚糖酶典型的β-jelly-roll折疊結(jié)構(gòu)，但是xyn-CDBFV具有延伸出來的N端結(jié)構(gòu)域（N-terminal region，NTR），這在11家族木聚糖酶結(jié)構(gòu)中是罕見的。NTR是依靠堆積相互作用、氫鍵和一個二硫鍵穩(wěn)定的附著在xyn-CDBFV的催化中心，而不是做為一個靈活的片段自由地懸掛在外面。Cheng，Y.S等的研究表明：僅刪除由11個氨基酸組成的NTR后，xyn-CDBFV突變株的酶活在55℃和75℃分別降為原來的61.5%和19.5%；僅刪除由NTR和催化中心形成的二硫鍵后，xyn-CDBFV突變株的酶活在55℃和75℃分別降為原來的86.8%和23.3%。由此可見，NTR在該酶熱穩(wěn)定性中有著重要作用，尤其是NTR和催化中心形成的二硫鍵更是起著關(guān)鍵作用，在二硫鍵的作用下，NTR像個夾子一樣夾住催化中心，使它在高溫下能穩(wěn)定。

中國專利CN102757947公開了一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-CDBFV-m及其基因，其中，對木聚糖酶xyn-CDBFV的改良之一是將33位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸分別替換為半胱氨酸，并稱其是在木聚糖酶xyn-CDBFV的N端引入二硫鍵。但隨著Cheng，Y.S等解析了木聚糖酶xyn-CDBFV蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其NTR僅由11個氨基酸組成，因此，對于中國專利CN102757947中公開的的N端引入二硫鍵提高木聚糖酶xyn-CDBFV的熱穩(wěn)定性的結(jié)果值得懷疑，因?yàn)?3位的丙氨酸和58位的苯丙氨酸并非位于木聚糖酶xyn-CDBFV的N端結(jié)構(gòu)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在了解了NTR和催化中心形成的二硫鍵的重要性后，本發(fā)明的目的是通過改造木聚糖酶xyn-CDBFV，使改造得到的木聚糖酶xyn-LVK在高溫時(shí)的穩(wěn)定性大大提高。

具體地，本發(fā)明通過Disulfide by Design軟件對xyn-CDBFV上的二硫鍵進(jìn)行了在線分析預(yù)測。經(jīng)分析，存在26個可以形成二硫鍵的潛在位點(diǎn)。它們分別是：4位/172位；7位/217位；7位/218位；11位/45位；28位/65位；29位/42位；50位/60位；55位/58位；57位/204位；61位/198位；70位/74位；83位/172位；83位/218位；91位/208位；95位/117位；95位/118位；97位/115位；100位/200位；102位/195位；129位/145位；131位/143位；141位/164位；176位/179位；184位/189位；199位/219位；205位/208位。其中，NTR和催化中心之間除了已形成的4位/172位二硫鍵外，還有7位/217位和11位/45位可以設(shè)計(jì)形成二硫鍵。結(jié)合預(yù)測結(jié)果，理性的在NTR和催化中心之間設(shè)計(jì)引入7位/217位和11位/45位二硫鍵，這樣在木聚糖酶xyn-LVK中，NTR和催化中心之間將有三個二硫鍵，它們使NTR這個“夾子”更穩(wěn)固的夾住催化中心，使木聚糖酶xyn-LVK在高溫下更加穩(wěn)定。

本發(fā)明的一方面是提供一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-LVK，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述SEQ ID NO.1的序列如下：

QSFCSSCSHSCQSVKVTGNKVGTIGGVGYELWADSGNNSATFYScGSFSCTFQNAGDYLCRSGLSFDSTKTPSQIGRMKADFKLVKQNSSNVGYSYVGVYGWTRSPLVEYYIVDNWLSPFPPGDWVGNKKHGSFTIDGAQYTVYENTRTGPSIDGDTTFNQYFSIRQQARDCGTIDISAHFDQWEKLGMTMGKLHEAKVLGEAGNVNGGASGTADFcYAKVYIGD。

本發(fā)明中，將SEQ ID NO.1所示的木聚糖酶的氨基酸序列命名為木聚糖酶xyn-LVK。

本發(fā)明的木聚糖酶xyn-LVK和原有木聚糖酶xyn-CDBFV相比，有4個氨基酸發(fā)生了突變，突變位點(diǎn)分別是A7C，G11C，D45C，P217C。

本發(fā)明的另一方面還涉及一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶基因xyn-LVK，其編碼上述木聚糖酶xyn-LVK，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述SEQ ID NO.2的序列如下：

CAAAGTTTCTGTAGTTCATGTTCTCACTCTTGTCAAAGTGTAAAGGTAACCGGCAACAAGGTTGGAACTATTGGTGGTGTTGGTTACGAATTATGGGCTGATAGTGGTAATAACAGTGCTACTTTCTATTCTTGTGGTTCCTTCTCATGTACTTTCCAAAATGCTGGGGATTACTTATGTCGTAGTGGTCTTTCTTTCGATAGTACTAAGACCCCATCTCAAATTGGTCGTATGAAGGCTGATTTCAAACTTGTCAAACAAAATAGTTCCAATGTTGGTTATTCCTATGTTGGTGTTTACGGTTGGACTAGAAGTCCACTTGTCGAATACTACATTGTCGATAATTGGCTTAGTCCATTCCCACCAGGTGATTGGGTTGGTAACAAGAAGCATGGTTCTTTCACTATTGATGGTGCTCAATACACTGTTTATGAAAACACTCGTACTGGTCCATCTATTGATGGTGATACCACCTTCAATCAATACTTTAGTATTCGTCAACAAGCTCGTGATTGTGGTACCATTGATATTTCTGCTCACTTTGATCAATGGGAAAAGCTTGGTATGACTATGGGTAAATTACATGAAGCCAAGGTTTTAGGTGAAGCCGGTAACGTTAACGGTGGTGCCAGTGGTACTGCTGATTTCTGTTACGCAAAGGTTTACATTGGTGATTAA。

本發(fā)明的另一方面還涉及包含木聚糖酶基因xyn-LVK的表達(dá)載體，將本發(fā)明的木聚糖酶基因xyn-LVK插入到質(zhì)粒pPIC9K的信號肽序列的下游并受其調(diào)控，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-xyn-LVK。

本發(fā)明的另一方面還涉及一種重組菌株，所述重組菌株含有所述的木聚糖酶基因xyn-LVK或所述的表達(dá)載體或所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，所述重組菌株為重組大腸桿菌菌株或重組畢赤酵母菌株。

本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述重組菌株為重組大腸桿菌DH5α-xyn-LVK。

本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，所述重組菌株為重組畢赤酵母菌株GS115-xyn-LVK。

本發(fā)明的另一方面還涉及一組引物對，所述引物對用于對木聚糖酶基因xyn-LVK的成熟蛋白的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，所述引物對的兩條引物分別為序列CCgGAATTCCAAAGTTTCTGTAGTTCA（SEQ ID NO：3）和ATAAGAATGCGGCCGCTTAATCACCAATGTAAACCTTTGCGTA（SEQ ID NO：4）。

本發(fā)明的另一方面還涉及一種產(chǎn)熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-LVK的畢赤酵母基因工程菌的制備方法，包括以下步驟：

（1）合成木聚糖酶xyn-LVK基因序列；

（2）將所述木聚糖酶xyn-LVK基因序列克隆至pPIC9K中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒；

（3）將所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備所述重組表達(dá)質(zhì)粒；

（4）抽提所述重組表達(dá)質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BglII進(jìn)行線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布于組氨酸缺陷型的 RDB 平板，培養(yǎng)2～3天；

（5）用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的 RDB 平板上挑取單菌落， 按照編號先點(diǎn)到 MM 平板上，再點(diǎn)到相應(yīng)編號的MD平板上，將點(diǎn)有轉(zhuǎn)化子的MM、MD 平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，至菌落長出；

（6）按編號從 MD 平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種于裝有BMGY培養(yǎng)基的搖瓶中，培養(yǎng)48h后將菌液離心，去上清，改用含有體積分?jǐn)?shù)為0.5％的甲醇的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后取菌液離心， 取上清液用于酶活性檢測，從中篩選出高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子，即得到產(chǎn)熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-LVK的畢赤酵母基因工程菌；

其中，所述木聚糖酶xyn-LVK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述木聚糖酶基因xyn-LVK的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

具體地，所述產(chǎn)熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-LVK的畢赤酵母基因工程菌的制備方法，包括以下步驟：

（1）合成木聚糖酶xyn-LVK基因序列；

（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增木聚糖酶xyn-LVK基因序列，然后利用限制性內(nèi)切酶EcoRI，NotI將所述木聚糖酶xyn-LVK基因序列克隆至pPIC9K中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒；

（3）將所述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備所述重組表達(dá)質(zhì)粒；

（4）抽提所述重組表達(dá)質(zhì)粒，將5微克的用限制性內(nèi)切酶BglII進(jìn)行線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布于組氨酸缺陷型的 RDB 平板，30℃培養(yǎng)2～3天；

（5）用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的 RDB 平板上挑取單菌落， 按照編號先點(diǎn)到 MM 平板上，再點(diǎn)到相應(yīng)編號的MD平板上，將點(diǎn)有轉(zhuǎn)化子的MM、MD 平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，至菌落長出；

（6）按編號從 MD 平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種于裝有BMGY培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃、250rpm搖床培養(yǎng)48h后將菌液3,000×g離心15min，去上清，改用含有體積分?jǐn)?shù)為0.5％的甲醇的BMMY培養(yǎng)基在30℃、260rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后取菌液3,000×g 離心 5min，取上清液用于酶活性檢測，從中篩選出高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子，即得到產(chǎn)熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-LVK的畢赤酵母基因工程菌。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過理性設(shè)計(jì)，在木聚糖酶xyn-CDBFV的NTR和催化中心之間設(shè)計(jì)引入7位/217位和11位/45位二硫鍵，得到重組木聚糖酶xyn-LVK，這樣在木聚糖酶xyn-LVK中，NTR和催化中心之間將有三個二硫鍵，它們使NTR這個“夾子”更穩(wěn)固的夾住催化中心，使突變酶在高溫下更加穩(wěn)定，將木聚糖酶基因xyn-LVK在畢赤酵母中表達(dá)后，與木聚糖酶xyn-CDBFV相比，突變后的酶在高溫時(shí)的穩(wěn)定性得到了顯著提高，在90℃處理4min 還能保留65％的酶活，處理8min 后還有42％的剩余酶活性。

附圖說明

圖1為木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-LVK的最適pH；

圖2為木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-LVK的pH穩(wěn)定性；

圖3為木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-LVK的最適溫度；

圖4為木聚糖酶xyn-CDBFV和xyn-LVK的熱穩(wěn)定性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述：

本發(fā)明中，木聚糖酶的酶活檢測方法參照《GB/T23874-2009飼料添加劑木聚糖酶活力的測定分光光度法》。

實(shí)驗(yàn)條件

1、 菌株與載體

畢赤酵母 GS115、載體 pPIC9K 購自 Invitrogen 公司；大腸桿菌DH5α 菌株已在《劉靜華，包英華，陳燕飛；大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的改進(jìn)，韶關(guān)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，29(03) ：87-90》文獻(xiàn)中公開，大腸桿菌DH5α 菌株的感受態(tài)細(xì)胞可通過供應(yīng)商天根生化科技( 北京) 有限公司購買，貨號CB101-03。

2、酶類及其他生化試劑

內(nèi)切酶、連接酶購自TaKaRa公司，其它都為國產(chǎn)試劑。

3、培養(yǎng)基

大腸桿菌培養(yǎng)基為LB（1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0）。

酵母培養(yǎng)基為YPD（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖）。酵母篩選培養(yǎng)基為MD（2％葡萄糖，1.5%瓊脂粉，0.00004％生物素，1.34％YNB）、MM（0.5%甲醇（體積分?jǐn)?shù)），1.5%瓊脂粉，0.00004％生物素，1.34％YNB）、RDB（1M山梨醇，2％葡萄糖，0.00004％生物素，1.34％YNB ，0.005%氨基酸）。酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基 BMGY（1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％生物素、1％甘油（體積分?jǐn)?shù)））和BMMY（除以0.5％甲醇（體積分?jǐn)?shù)）代替甘油，其余成份相與 BMGY 相同）。

實(shí)施例1：木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV 在畢赤酵母中的高效表達(dá)

（1）表達(dá)載體的構(gòu)建及其在酵母的表達(dá)

以合成的木聚糖酶xyn-LVK基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)合成了帶有EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)的引物xyn-LVK-F 和 xyn-LVK-R，對xyn-LVK的成熟蛋白的編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，并利用EcoRI和NotI酶切PCR產(chǎn)物，連接進(jìn)入表達(dá)載體 pPIC9K，使木聚糖酶xyn-LVK基因插入到上述表達(dá)載體的信號肽序列的下游，與信號肽形成正確的閱讀框架，構(gòu)建成酵母表達(dá)載體 pPIC9K-Xyn-LVK，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA測序，測序表明序列正確的轉(zhuǎn)化子用于大量制備重組質(zhì)粒。約5微克的用限制性內(nèi)切酶BglII進(jìn)行線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒，電擊轉(zhuǎn)化酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布于組氨酸缺陷型的 RDB 平板，30℃培養(yǎng)2-3天，挑取在RDB平板上生長的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步的表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

酵母表達(dá)引物序列如下 ：

xyn-LVK-F：CCGGAATTCCAAAGTTTCTGTAGTTCA（下劃線為EcoRI酶切位點(diǎn)）

xyn-LVK-R：ATAAGAATGCGGCCGCTTAATCACCAATGTAAACCTTTGCGTA（下劃線為NotI酶切位點(diǎn)）

（2）高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子的篩選

用滅過菌的牙簽從長有轉(zhuǎn)化子的 RDB 平板上挑取單菌落， 按照編號先點(diǎn)到 MM 平板上，再點(diǎn)到相應(yīng)編號的MD平板上。將點(diǎn)有轉(zhuǎn)化子的MM、MD 平板置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2天，至菌落長出。按編號從 MD 平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種于裝有BMGY培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃、250rpm搖床培養(yǎng)約48h；將搖瓶中培養(yǎng)48h的菌液3,000×g離心15min，去上清，改用含有體積分?jǐn)?shù)為0.5％的甲醇的BMMY培養(yǎng)基，在30℃、260rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)48h后，取菌液，3,000×g 離心 5min，取上清液用于酶活性檢測，從中篩選出高木聚糖酶活性的轉(zhuǎn)化子。

（3）高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子在發(fā)酵罐水平的小試表達(dá)

高細(xì)胞密度發(fā)酵用5L發(fā)酵罐進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照Invirogen公司的畢赤酵母發(fā)酵過程指導(dǎo)（Pichia Fermentation Process Guidelines）操作。將上述獲得的高木聚糖酶活性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵水平高密度發(fā)酵試驗(yàn)。隨著甲醇誘導(dǎo)時(shí)間的延長，發(fā)酵上清液中木聚糖酶酶活力顯著增加，誘導(dǎo)180h后木聚糖酶活性可達(dá)72325 U/mL，菌體濕重達(dá)413g/L。

木聚糖酶 xyn-CDBFV在畢赤酵母中的表達(dá)方法同木聚糖酶xyn-LVK在畢赤酵母中的表達(dá)方法和表達(dá)引物一樣，不同的是以合成的木聚糖酶xyn-CDBFV基因?yàn)槟０?。隨著甲醇誘導(dǎo)時(shí)間的延長，發(fā)酵上清液中木聚糖酶酶活力顯著增加，誘導(dǎo)180h后木聚糖酶活性可達(dá)68471 U/mL，菌體濕重達(dá)398g/L。

實(shí)施例2：木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV的純化

木聚糖酶xyn-LVK純化的具體過程是，將實(shí)施例1中發(fā)酵罐表達(dá)的上清液用超濾膜進(jìn)行濃縮，然后在每100mL的濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%的硫酸銨溶液，并不斷攪拌2.5h，然后在10000rpm離心15min，收集沉淀。沉淀用少量pH8.0的20mM Tris-HCl緩沖液溶解，并在大量該緩沖液中透析過夜，透析后的溶液過陰離子柱（HiTrap Q Sepharose XL 5mL）進(jìn)行純化。陰離子柱事先用pH8.0的20mM Tris-HCl緩沖液平衡，上樣后用0～1.0mol/L線性梯度的NaCl溶液洗脫，收集有木聚糖酶活性的洗脫管，收集液再用超濾離心管處理，使其濃縮，經(jīng)SDS-PAGE確認(rèn)后用于酶學(xué)性質(zhì)的分析。木聚糖酶xyn-CDBFV的純化方法和木聚糖酶xyn-LVK的純化方法基本一樣。

實(shí)施例3：木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV的酶學(xué)性質(zhì)分析

（1）木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV的最適pH和pH穩(wěn)定性

將純化的木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV稀釋到所需濃度，將樣品置于不同pH值下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測定其最適pH，以最適pH值下的酶活作為100%對照，計(jì)算相對酶活，并作相對酶活曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，木聚糖酶xyn-LVK和xyn-CDBFV的最適pH 曲線有所改變，xyn-LVK 最適pH 比xyn-CDBFV低，由原先的6.0降低到了5.0。

將純化的木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV稀釋到所需濃度，將樣品置于不同pH值的緩沖液中，室溫放置24h，然后檢測其酶活，以未處理的原酶液作為100%對照，作相對酶活曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，木聚糖酶xyn-LVK和xyn-CDBFV的pH 穩(wěn)定性曲線基本沒有改變。

（2）木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV的最適溫度和熱穩(wěn)定性

將純化的木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV稀釋到所需濃度，將樣品置于40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃溫度下測定酶活，以確定該酶的最適溫度，以最適溫度下的酶活作為100%對照，計(jì)算相對酶活，并作相對酶活曲線，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知， xyn-LVK 的最適溫度有了明顯的提高，從60℃提高到了75℃，并且在90℃時(shí)的相對酶活仍然能夠保持在60％左右。

將純化的木聚糖酶xyn-LVK和木聚糖酶xyn-CDBFV稀釋到所需濃度，將樣品置于90℃的烘箱中，分別在2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、15min、20 min取出酶液，冷卻至室溫，然后檢測其酶活，以未處理的原酶液作為100%對照，作相對酶活曲線，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，xyn-LVK 在90℃的熱穩(wěn)定性有了明顯的提高，在90℃處理4min 還能保留65％的酶活，處理8min 后還有42％的剩余酶活性。而xyn-CDBFV 在90℃處理2min 酶活性就損失了85％，6min 酶活性完全損失。xyn-LVK 在90℃的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該木聚糖酶能夠抵抗飼料高溫制粒時(shí)短暫的高溫處理。因此，本發(fā)明的優(yōu)化改良的木聚糖酶xyn-LVK 可在飼料工業(yè)中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。

盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。

序列表

<110> 深圳市綠微康生物工程有限公司

<120> 一種熱穩(wěn)定性改良的木聚糖酶xyn-LVK及其基因

<130> LVK201501

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 225

<212> PRT

<213> 瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）

<400> 1

Gln Ser Phe Cys Ser Ser Cys Ser His Ser Cys Gln Ser Val Lys Val

1 5 10 15

Thr Gly Asn Lys Val Gly Thr Ile Gly Gly Val Gly Tyr Glu Leu Trp

20 25 30

Ala Asp Ser Gly Asn Asn Ser Ala Thr Phe Tyr Ser Cys Gly Ser Phe

35 40 45

Ser Cys Thr Phe Gln Asn Ala Gly Asp Tyr Leu Cys Arg Ser Gly Leu

50 55 60

Ser Phe Asp Ser Thr Lys Thr Pro Ser Gln Ile Gly Arg Met Lys Ala

65 70 75 80

Asp Phe Lys Leu Val Lys Gln Asn Ser Ser Asn Val Gly Tyr Ser Tyr

85 90 95

Val Gly Val Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile

100 105 110

Val Asp Asn Trp Leu Ser Pro Phe Pro Pro Gly Asp Trp Val Gly Asn

115 120 125

Lys Lys His Gly Ser Phe Thr Ile Asp Gly Ala Gln Tyr Thr Val Tyr

130 135 140

Glu Asn Thr Arg Thr Gly Pro Ser Ile Asp Gly Asp Thr Thr Phe Asn

145 150 155 160

Gln Tyr Phe Ser Ile Arg Gln Gln Ala Arg Asp Cys Gly Thr Ile Asp

165 170 175

Ile Ser Ala His Phe Asp Gln Trp Glu Lys Leu Gly Met Thr Met Gly

180 185 190

Lys Leu His Glu Ala Lys Val Leu Gly Glu Ala Gly Asn Val Asn Gly

195 200 205

Gly Ala Ser Gly Thr Ala Asp Phe Cys Tyr Ala Lys Val Tyr Ile Gly

210 215 220

Asp

225

<210> 2

<211> 678

<212> DNA

<213> 瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）

<400> 2

caaagtttct gtagttcatg ttctcactct tgtcaaagtg taaaggtaac cggcaacaag 60

gttggaacta ttggtggtgt tggttacgaa ttatgggctg atagtggtaa taacagtgct 120

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cgtagtggtc tttctttcga tagtactaag accccatctc aaattggtcg tatgaaggct 240

gatttcaaac ttgtcaaaca aaatagttcc aatgttggtt attcctatgt tggtgtttac 300

ggttggacta gaagtccact tgtcgaatac tacattgtcg ataattggct tagtccattc 360

ccaccaggtg attgggttgg taacaagaag catggttctt tcactattga tggtgctcaa 420

tacactgttt atgaaaacac tcgtactggt ccatctattg atggtgatac caccttcaat 480

caatacttta gtattcgtca acaagctcgt gattgtggta ccattgatat ttctgctcac 540

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gtttacattg gtgattaa 678

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<213> 瘤胃真菌（Neocallimastix patriciarum）

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85 90 95

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