本發(fā)明涉及通過發(fā)酵法從碳源制備苯胺衍生物的方法。更詳細而言，本發(fā)明涉及利用基因工程的手法，制作被賦予了從分支酸生物合成4-氨基苯丙酮酸的功能的微生物，通過利用了這樣的微生物的發(fā)酵法，從葡萄糖這樣的碳源制備選自由4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)組成的組中的至少一種苯胺衍生物的方法。
背景技術(shù)：
：近年來，以由來自石油的二氧化碳造成的地球變暖問題為開端，要改變過度依賴石油的社會結(jié)構(gòu)的勢頭在世界中日益增高。隨著這樣的潮流，活用生物工藝的“生物精煉”的活動日漸活躍化，在世界各國正在加速研究，但遺憾的是，實際情況是幾乎仍未獲得與芳香族化合物的生物合成有關(guān)的研究成果，鑒于化學產(chǎn)業(yè)的芳香族化合物的重要性，人們正在積極推進芳香族聚合物合成等研究。例如，在以下的專利文獻1中，公開了與使用作為天然分子的4-氨基肉桂酸(4ACA)的聚合物合成有關(guān)的技術(shù)，報告了從4-氨基肉桂酸可以獲得高耐熱聚合物。此外，如以下的非專利文獻1所公開的那樣，關(guān)于4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生物合成，經(jīng)由莽草酸的代謝路徑變得清楚(參照本文件第2818頁Fig.1)，但是并沒有公開脫氨酶在生物體內(nèi)發(fā)揮作用、從4-氨基苯丙氨酸向4-氨基肉桂酸轉(zhuǎn)化的內(nèi)容，也沒有這方面的啟示。在以下的非專利文獻2中記載了以下內(nèi)容：將酵母粘紅酵母JN-1(Rhodotorulaglutinis)的苯丙氨酸脫氨酶(以下，簡稱為Rgpal)的基因分離，該酵母以保藏編號M2011490被保藏于CCTCC(ChinaCenterForTypeCultureCollection、中國典型培養(yǎng)物保藏中心)，此外，記載了通過該基因的定點誘變制作最適pH變異體。而且，由于以非專利文獻2的作者等為發(fā)明人的中國專利申請說明書(以下的專利文獻2)于2013年4月24日被公開發(fā)表，因此這樣的Rgpal的序列本身是公知的。然而，并沒有公開這樣的酶將4-氨基苯丙氨酸作為基質(zhì)可以生成4-氨基肉桂酸的內(nèi)容。如此，在作為4-氨基肉桂酸(4ACA)的前體方面，4-氨基苯丙氨酸(4APhe)是重要的物質(zhì)。此外，在以下的非專利文獻3中，如圖1所示，公開了分支酸通過PapA(4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶)被轉(zhuǎn)化為4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)，ADC通過PapB(4-氨基-4-脫氧分支酸變位酶)被轉(zhuǎn)化為4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸(ADP)，ADP通過PapC(4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶)被轉(zhuǎn)化為4-氨基苯丙酮酸。此外，可以認為4-氨基苯丙酮酸通過微生物的內(nèi)源性酶的作用被轉(zhuǎn)化為4-氨基苯丙氨酸(4APhe)。此外，在以下的專利文獻3中公開了以下內(nèi)容：至少通過屬于氨基脫氧分支酸合成酶的類別的酶的進行催化的、4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)的生物合成獲得含有4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)及4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸(ADP)的發(fā)酵培養(yǎng)液，同時在提高了活性水平的、具有4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的宿主微生物體內(nèi)，通過發(fā)酵來進行，并且這些化合物以一起或單獨的任一種方式，從發(fā)酵培養(yǎng)液回收。然而，在單純使用現(xiàn)有已知的pap系基因，即，抗生素生產(chǎn)路徑中已知的三種關(guān)鍵酶(例如，委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)的PapA、PapB、PapC)的情況下，發(fā)酵法的4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生產(chǎn)率不超過0.2g/L左右，即使對現(xiàn)有已知的pap系的組合進行各種研究，充其量也只是停留在0.9g/L左右。在通過發(fā)酵法從葡萄糖等碳源工業(yè)性地大量地制備包含4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的苯胺衍生物時，這樣低的產(chǎn)量就成了阻礙(參照圖1)。如上所述，通過發(fā)酵法從葡萄糖等碳源通過發(fā)酵法能夠工業(yè)性地大量地獲得包含4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的苯胺衍生物的制備方法尚未確立，并且強烈地希望有這樣的開發(fā)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻專利文獻1：國際公開第2013/073519號專利文獻2：CN103060352A說明書專利文獻3：日本特表2008-501326號公報非專利文獻非專利文獻1：He,etal.,Microbiology(2001)非專利文獻2：Zhou,etal.,BiotechnolLett(2013)35:751-756非專利文獻3：J.AM.CHEM.SOC.2003,125,935-939技術(shù)實現(xiàn)要素：發(fā)明所要解決的問題如上所述，在單純使用現(xiàn)有已知的pap系基因，即，抗生素生產(chǎn)路徑中已知的三種關(guān)鍵酶(例如，委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)PapA、PapB、PapC)的情況下，發(fā)酵法的4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生產(chǎn)率不超過0.2g/L左右，即使對現(xiàn)有已知的pap系的組合進行各種研究充其量也只是停留在0.9g/L左右。本申請的發(fā)明人等將與4-氨基肉桂酸(4ACA)合成有關(guān)的酶基因?qū)胧褂矛F(xiàn)有的pap系基因的、生產(chǎn)0.2～0.9g/L的4APhe的轉(zhuǎn)化體，但是并不能合成4ACA。鑒于這樣的現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本發(fā)明所要解決的問題是提供一種苯胺衍生物的制備方法，該制備方法能夠通過發(fā)酵法從葡萄糖這樣的碳源工業(yè)性地大量地獲得包括4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的苯胺衍生物。用于解決問題的方案本申請發(fā)明人等為了提高4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生產(chǎn)率，使用基因數(shù)據(jù)庫探索了編碼與委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)的PapA、PapB、PapC具有同源性的蛋白質(zhì)的新型pap樣基因之后，與大腸桿菌屬于相同變形菌門的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescence)SBW25菌株(DeLeijFetal.(1995)ApplEnvironMicrobiol61:3443-3453)PFLU1770、PFLU1771、PFLU1772分別顯示了34％(PapC)、44％(PapA)、28％(PapB)的所述同源性，制作使這些基因表達的重組大腸桿菌并供于4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的發(fā)酵，極大地提高了生產(chǎn)率，能夠生產(chǎn)1.8g/L的4APhe。即，是在現(xiàn)有技術(shù)中不能達成4APhe的克級生產(chǎn)的技術(shù)。令人驚奇的，如上所述，即使將與4-氨基肉桂酸(4ACA)合成有關(guān)的酶基因?qū)胧褂矛F(xiàn)有的pap系基因的、生產(chǎn)0.2～0.9g/L的4APhe的轉(zhuǎn)化體中，也不能合成4ACA，但是在將該酶基因?qū)肷a(chǎn)1.8g/L的4APhe的轉(zhuǎn)化體的情況下，能夠首次合成4ACA。本申請發(fā)明人等推測：大腸桿菌中的從分支酸到4-氨基丙酮酸的轉(zhuǎn)化在現(xiàn)有技術(shù)中不能高效率地進行，但通過這樣的基因改変，變得能夠高效率地進行該轉(zhuǎn)化，其結(jié)果是，4APhe的產(chǎn)量提高，通過使4APhe的產(chǎn)量超過閾值，能夠?qū)崿F(xiàn)現(xiàn)在不能達成的4ACA的制備?；谶@樣的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的發(fā)明人等積極研究并反復(fù)進行實驗，結(jié)果完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下所述。[1]一種所述苯胺衍生物的制備方法，包括以下的工序：在具有從分支酸生物合成4-氨基苯丙酮酸功能的微生物中，通過導(dǎo)入至少三個外來基因，在規(guī)定培養(yǎng)條件下，制作能夠生產(chǎn)1.8g/L以上的4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的微生物；然后在適于該微生物的繁殖和/或維持的條件下，使該微生物與碳源接觸，制備選自由4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)組成的組中的至少一種苯胺衍生物。[2]根據(jù)所述[1]中記載的方法，所述至少三個外來基因是papA、papB、以及papC。[3]根據(jù)所述[2]中記載的方法，所述papA、papB、以及papC分別來自熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescence)。[4]根據(jù)所述[3]中記載的方法，所述papA、papB、以及papC分別由序列號7、9、5所示的序列構(gòu)成。[5]根據(jù)所述[1]～[4]中任一項所記載的方法，在制作所述微生物的工序中，還破壞編碼苯丙氨酸合成酶的至少一個基因。[6]根據(jù)所述[5]中記載的方法，所述被破壞的基因是pheA。[7]根據(jù)所述[1]～[6]中任一項所記載的方法，在制作所述微生物的工序中，還導(dǎo)入選自由aroG、aro10以及pal組成的組中的至少一個外來基因。[8]根據(jù)所述[1]～[7]中任一項所記載的方法，所述微生物選自由大腸桿菌、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌屬或發(fā)酵單胞菌屬的細菌、以及酵母(Saccharomyces)屬或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬的酵母組成的組。[9]根據(jù)所述[8]中記載的方法，所述微生物是大腸桿菌。[10]根據(jù)所述[1]～[9]中任一項所記載的方法，所述碳源選自由D-葡萄糖、蔗糖、低聚糖、多糖、淀粉、纖維素、米糠、廢糖蜜、玉米分解液、以及纖維素分解液組成的組。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的方法，能夠通過發(fā)酵法從碳源工業(yè)性地大量地制備選自由4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)組成的組中的至少一種苯胺衍生物。附圖說明圖1是表示從葡萄糖經(jīng)由分支酸、4-氨基苯丙酮酸，至4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的路徑的示意圖。圖2是表示發(fā)酵培養(yǎng)基的組成的表。圖3是表示由PFABCΔAro菌株進行的4APhe生產(chǎn)的圖表。具體實施方式以下，對本發(fā)明的實施方式進行詳細的說明。除非另有說明，在本說明書中使用的全部技術(shù)或科學用語具有與本公開所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員一般理解的意義相同的意義。在公開的方法或組合物的實施中能夠使用與本說明書所記載的相同或等價的方法或物質(zhì)，但在本說明書中記載了示例的方法、裝置、物質(zhì)等。對于用語“微生物”而言，包含來自古細菌領(lǐng)域(domain)、細菌領(lǐng)域、以及真核生物領(lǐng)域的原核微生物種類及真核微生物種類，在后者中，包含酵母、絲狀菌、原蟲、藻類、或者更加高級的原生生物。在本實施方式中，只要是具有從分支酸生物合成4-氨基苯丙酮酸功能的微生物，任一種都可以，但是優(yōu)選選自由大腸桿菌、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬、假單胞菌屬或發(fā)酵單胞菌屬的細菌、以及酵母(Saccharomyces)屬或裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬的酵母組成的組，從迅速的生育能力、發(fā)酵管理的容易度的觀點考慮，特別優(yōu)選大腸桿菌。用語“重組微生物”和“重組宿主細胞”在本說明書中互換地使用，是指以表達或過量表達內(nèi)源性的多核苷酸、或者表達載體中所包含的物質(zhì)等異種多核苷酸的方式在遺傳性上改變了的微生物，或者具有內(nèi)源性基因的表達變化的微生物?！白兓笔侵富虻谋磉_，或者編碼一個或多個多肽、多肽亞基的RNA分子或等價的RNA分子的水平，或者表達上調(diào)或表達下調(diào)一個或多個多肽、多肽亞基的活性，其結(jié)果是，表達、水平、或者活性與在沒有變化的狀態(tài)下觀察相比較大或較小。關(guān)于基因序列，用語“表達”是指基因的轉(zhuǎn)錄、及在適當?shù)那闆r下，獲得的mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的、向蛋白質(zhì)的翻譯。因此，正如由上下文而變清楚那樣，蛋白質(zhì)的表達從開放閱讀框(OpenReadingFrame)序列的轉(zhuǎn)錄以及翻譯開始產(chǎn)生。宿主細胞的所需的產(chǎn)物的表達水平能夠基于存在、對應(yīng)于細胞中的mRNA的量，或通過選擇的序列編碼的所需的產(chǎn)物的量而求得。例如，從選擇的序列轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠通過PCR或Northern雜交來定量化(參照Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。通過選擇的序列編碼的蛋白質(zhì)能夠通過各種方法來定量化，例如，通過使用與蛋白質(zhì)反應(yīng)識別、結(jié)合的抗體的ELISA、通過檢測蛋白質(zhì)的生物活性、或者通過不依存這樣的活性的檢測，例如，使用蛋白質(zhì)印跡法或者放射免疫分析法等來定量化。參照上述Sambrooketal.。一般而言，編碼與用于產(chǎn)生所需的代謝產(chǎn)物的代謝路徑有關(guān)的目標酶。用語“重組微生物”及“重組宿主細胞”不僅是指特定的重組微生物，也可以理解為是指這樣的微生物的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境的影響，由于在世代接替中可以引起某種特定的改變，因此這樣的后代實際上有時與親代細胞并不相同，但是在本說明書中使用的情況下，依然包含在該用語的范圍內(nèi)。用語“操作”是指在微生物中產(chǎn)生能夠檢測的變化的、微生物的任意處理，該處理并不僅限于此，但是包含對于微生物插入異種的多核苷酸和/或多肽、以及使微生物所固有多核苷酸和/或多肽突變。用語“在代謝上進行操作”或“代謝的操作”是指用于所需的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生的，伴隨生物合成基因、與操縱子相關(guān)的基因、以及這樣的多核苷酸的控制要素的合理的路徑設(shè)計及裝配?！霸诖x上進行操作”還能夠包括：使用包括與到達所需的路徑的中間體競爭的競爭代謝路徑的降低、破壞或敲除的基因操作以及適當?shù)呐囵B(yǎng)條件的，轉(zhuǎn)錄、翻譯、由蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及蛋白質(zhì)的功能性的調(diào)節(jié)以及最優(yōu)化得到的、代謝通量的最優(yōu)化。用語“在代謝上進行操作了的微生物”以及“改變了的微生物”在本說明書中能夠互換地使用，不僅是指特定的對象細胞，也指這樣的細胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境的影響，由于在世代接替中可以引起某種特定的改變，因此這樣的后代實際上有時與親代細胞并不相同，但是在本說明書中使用的情況下，依然包含在該用語的范圍內(nèi)。用語“生物合成路徑”也稱為“代謝路徑”，是指用于將一種化學物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其他的化學物質(zhì)的一系列同化或異化的生化反應(yīng)。在基因產(chǎn)物以并列、或連續(xù)的方式在相同的基質(zhì)上發(fā)揮作用，產(chǎn)生相同的產(chǎn)物；或者在相同的基質(zhì)和代謝產(chǎn)物最終生成物之間的代謝中間體(即，代謝產(chǎn)物)上發(fā)揮作用、或產(chǎn)生該代謝中間體的情況下，該基因產(chǎn)物屬于相同的“代謝路徑”。用語“異種的(外來)”表示分子，特別是在參照酶及多核苷酸在本說明書中使用的情況下，表示在分子來源的生物、或在自然中發(fā)現(xiàn)的生物以外的生物中表達的分子，與表達水平無關(guān)，該表達水平能夠低于、等于、或高于天然微生物的分子表達水平。用語“天然的”或“內(nèi)源性的”，表示分子，特別是在參照酶以及多核苷酸在本說明書中使用的情況下，表示在分子來源的生物、或自然中發(fā)現(xiàn)的生物中表達的分子，與表達水平無關(guān)，該表達水平能夠低于、等于、或高于天然微生物的分子表達水平?？梢岳斫鉃樘烊坏拿富蚨嗪塑账岬谋磉_能夠在重組微生物中改變。用語“供給原料”定義為向微生物或發(fā)酵過程供給的原料、或原料的混合物，能夠由此制作其他的產(chǎn)物。例如，生物質(zhì)或來自生物質(zhì)的碳化合物等碳源是在發(fā)酵過程用于產(chǎn)生生物燃料的微生物的供給原料。供給原料能夠含有碳源以外的營養(yǎng)成分。用語“碳源”一般是指為了原核生物增值或真核細胞增值，適用用作碳的供給源的物質(zhì)。作為碳源并不僅限于此，可以舉出生物質(zhì)加水分解物、淀粉、蔗糖、纖維素、半纖維素、木糖、木質(zhì)素、以及這些基質(zhì)的單體成分。碳源不限于此，能夠包括含有聚合物、糖、酸、醇、醛、酮、氨基酸、多肽等的、各種形態(tài)的各種有機化合物。作為這些有機化合物能夠舉出例如各種單糖，例如葡萄糖、右旋糖(D-葡萄糖)、麥芽糖、低聚糖、多糖、飽和或不飽和脂肪酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、乙醇、米糠、廢糖蜜、玉米分解液、纖維素分解液、或者它們的混合物。用語“基質(zhì)”或者“適當?shù)幕|(zhì)”是指通過酶的作用能轉(zhuǎn)化為其他的化合物、或表示能被轉(zhuǎn)化的任意物質(zhì)或化合物。該用語不僅是一種化合物，也包含化合物的組合，例如，含有至少一種基質(zhì)或其衍生物的溶液、混合物、其他物質(zhì)。而且，用語“基質(zhì)”不僅是提供適于用作來自任意生物質(zhì)的糖等起始原料的碳源的化合物，也包括如本說明書所記載那樣的、在與在代謝上進行操作的微生物相關(guān)的路徑中使用的中間體及最終生成物代謝產(chǎn)物。用語“發(fā)酵”或“發(fā)酵法”定義為微生物在含有供給原料及營養(yǎng)成分等原料的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的過程，微生物將供給原料等原料轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。用語“規(guī)定的培養(yǎng)條件”是指在以下實施例中定義的發(fā)酵培養(yǎng)條件。用語“多核苷酸”在本說明書中與用語“核酸”互換地使用，是指由包括核苷酸、核甙、或者它們的類似物的兩個以上的單體形成的有機聚合物，它們不限于此，但是在任意長度的單鏈或雙鏈的、正義或反義脫氧核糖核酸(DNA)、以及適當?shù)那闆r下，包含含有siRNA的、任意長度的單鏈或雙鏈的、正義或反義核糖核酸(RNA)。用語“核苷酸”是指由結(jié)合于嘌呤或嘧啶堿基以及磷酸基的核糖或脫氧核糖形成的、是核酸的堿基結(jié)構(gòu)單位的、任意的、幾個化合物。用語“核甙”是指由與脫氧核糖或核糖結(jié)合的嘌呤或嘧啶堿基形成的、特別在核酸中發(fā)現(xiàn)的化合物(鳥苷或腺苷)。用語“核苷酸類似物”或“核甙類似物”分別是指一個或多個各種原子被不同的原子或不同的官能團取代了的核苷酸或核甙。因此，用語多核苷酸包括任意長度的核酸、DNA、RNA、它們的類似物以及片段。三個以上核苷酸的多核苷酸也稱為核苷酸低聚物或者寡核苷酸。可以理解為在本說明書所記載的多核苷酸中包括“基因”，在本說明書所記載的核酸分子中包括“載體”或“質(zhì)粒”。因此，用語“基因”也稱為“結(jié)構(gòu)基因”，是指編碼構(gòu)成一個或多個蛋白質(zhì)、或酶的全部或一部分的氨基酸的特定的序列的多核苷酸，能夠包括啟動子序列等控制(不轉(zhuǎn)錄)DNA序列，該序列例如決定基因表達的條件?；虻霓D(zhuǎn)錄區(qū)域能夠包含內(nèi)含子、5’-非翻譯區(qū)域(UTR)、以及3’-UTR、和包含編碼序列的非翻譯區(qū)。用語“載體”是能夠在生物、細胞或細胞成分間搬運和/或移動核酸的任意手段。作為載體，能夠舉出病毒、噬菌體、前病毒、質(zhì)粒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子、以及例如YAC(酵母人工染色體)、BAC(細菌性人工染色體)、以及PLAC(植物人工染色體)等的人工染色體，它是“附加體”，即，能夠自發(fā)地復(fù)制，與宿主細胞的染色體組合。載體可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、在相同鏈內(nèi)由DNA及RNA的雙方構(gòu)成的多核苷酸、聚賴氨酸結(jié)合DNA或RNA、肽結(jié)合DNA或RNA、脂質(zhì)體結(jié)合DNA等，它本質(zhì)上不是附加體，或者載體能夠設(shè)為包含所述多核苷酸結(jié)構(gòu)中的一個或多個的生物，例如，農(nóng)桿菌或細菌等。用語“轉(zhuǎn)化(transformation)”是指將載體導(dǎo)入宿主細胞中的過程。轉(zhuǎn)化(或轉(zhuǎn)導(dǎo)、或轉(zhuǎn)染)能夠通過包括化學物質(zhì)轉(zhuǎn)化(例如，醋酸鋰轉(zhuǎn)化)、電穿孔、顯微注射、微粒子銃(或者粒子轟擊介導(dǎo)遞送)、或者農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的幾個方法中的任一個來實現(xiàn)。用語“酶”在本說明書中使用的情況下，是指催化或促進一個或多個化學或生物化學反應(yīng)的任意的物質(zhì)，其通常包括完全或部分由多肽構(gòu)成的酶，但也能夠包括由含有多核苷酸的不同的分子構(gòu)成的酶。用語“蛋白質(zhì)”或者“多肽”在本說明書中使用的情況下，表示由兩個以上的氨基酸單體和/或其類似物構(gòu)成的有機聚合物。在本說明書中使用情況下，用語“氨基酸”或“氨基酸單體”是指包括甘氨酸及D或L的兩種光學異構(gòu)體的任意的天然和/或合成氨基酸。用語“氨基酸類似物”是指一個或多個的各個原子被不同的原子，或不同的官能團取代了的氨基酸。因此，用語多肽包括全長的蛋白質(zhì)及肽、以及包含它們的類似物及片段的、任意長度的氨基酸聚合物。三個以上氨基酸的多肽也稱為蛋白質(zhì)低聚物或寡肽。如上所述，本發(fā)明的第一方式是一種苯胺衍生物的制備方法，包括以下工序：在具有從分支酸生物合成4-氨基苯丙酮酸的功能的微生物中，通過導(dǎo)入至少三個外來基因，在規(guī)定培養(yǎng)條件下，制作能夠生產(chǎn)1.8g/L以上的4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的微生物；然后在適于該微生物的繁殖和/或維持的條件下，使該微生物與碳源接觸，制備選自由4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)組成的組中的至少一種苯胺衍生物。所述至少三個外來基因優(yōu)選為papA、papB、以及papC，更優(yōu)選為分別來自熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescence)的該papA、papB、以及papC，進一步優(yōu)選地為分別由序列號7、9、5所示的核苷酸序列構(gòu)成的該papA、papB、以及papC。但是，在本發(fā)明中，所述至少三個外來基因編碼的氨基酸序列包含分別由具有與序列號8、10、6所示的氨基酸序列相比至少90％的序列一致性的氨基酸序列構(gòu)成的、并且具有PapA、PapB、以及PapC酶活性的蛋白質(zhì)，這樣的序列一致性能夠是至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％以及99％。此處，“序列一致性”意味著在多肽序列(或者氨基酸序列)或者多核苷酸序列(或者堿基序列)的兩個鏈之間，在構(gòu)成該鏈的各氨基酸殘基之間或各堿基之間的相互的適合關(guān)系中能夠決定為一致的量(數(shù))，意味著兩個多肽序列或者兩個多核苷酸序列之間的序列相關(guān)性的程度。一致性能夠很容易地算出。測定兩個多核苷酸序列或者兩個多肽序列之間的一致性的方法有許多是已知的，“序列一致性”的用語對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的。而且，在本發(fā)明中，在所述至少三個外來基因編碼的氨基酸序列中包含：由在序列號8、10、6所示的氨基酸序列中，缺少、置換、插入、或者增加一個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列構(gòu)成的、并且具有PapA、PapB、以及PapC酶活性的蛋白質(zhì)。此處，“數(shù)個”能夠是至多10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個或者2個。變異DNA能夠通過例如化學合成、基因工程的手法、誘發(fā)突變等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意方法進行制造。具體而言，對由編碼序列號8、10、6所示的氨基酸序列的核苷酸序列構(gòu)成的DNA，使用與作為誘變劑的藥物接觸作用的方法、照射紫外線的方法、基因工程的手法等，通過向這些DNA導(dǎo)入變異，能夠取得變異DNA。此處，作為基因工程的手法中的一種的定點誘變法由于是能夠在特定的位置導(dǎo)入特定的變異的手法，因此有用，能夠按照Sambrook,J.etal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989等所記載的方法來進行。通過使用適當?shù)谋磉_系統(tǒng)使該變異DNA表達，能夠獲得由缺失、置換、插入、或增加一個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列形成的蛋白質(zhì)。而且此外，在本發(fā)明中，所述至少三個外來基因包含序列號7、9、5所示的核苷酸配列與由互補的堿基序列形成的核酸在高嚴格條件下進行雜交，并且編碼具有PapA、PapB、以及PapC酶活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列形成的核酸。在本說明書中，“嚴格(stringent)條件”是指使能夠選擇且檢測多核苷酸和DNA基因組的特異組合成為可能的條件。嚴格條件通過鹽濃度、有機溶劑(例如，甲酰胺)、溫度、其他的公知條件的適當組合來定義。即，通過是否降低鹽濃度、是否增加有機溶劑濃度、是否使雜交溫度上升來增加嚴格性。而且，雜交后的清洗條件也影響嚴格性。此外，該清洗條件也通過鹽濃度和溫度定義，通過鹽濃度的減少和溫度的上升來增加清洗的嚴格性。因此，“嚴格條件”意味著僅在各堿基序列間的一致性的程度是例如，整體平均約為90％以上那樣的、具有高一致性的堿基序列間，特異地形成有雜交的條件。具體而言，“嚴格條件”是指在約45℃下以6.0×SSC進行雜交后，在50℃下以2.0×SSC進行清洗。由于嚴格的選擇，清洗工程中的鹽濃度能夠選擇例如從作為低嚴格的約2.0×SSC、50℃到作為高嚴格的約0.1×SSC、50℃。而且，還能夠使清洗工程的溫度從低嚴格條件的室溫、約22℃增大到高嚴格條件的約65℃。雜交能夠按照本領(lǐng)域公知的方法、以公知的方法為標準的方法進行。此外，在使用市售的基因庫的情況下，能夠按照隨附的使用說明書所記載的方法進行。在本實施方式中，在制作所述微生物的工序中，還優(yōu)選破壞編碼苯丙氨酸合成酶的至少一個基因，例如，pheA。此外，還優(yōu)選導(dǎo)入選自由aroG、aro10以及pal組成的組中的至少一個外來基因。以下，對與發(fā)明的代謝路徑有關(guān)的酶進行說明。從分支酸到4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)的生物合成根據(jù)K.S.Andersonetal.,JACS113(1991)3198-3200是公知的。在Parsonsetal.,Biochem42(2003)5684-5693的第5690頁，對此記載了ADC在明顯不滿足的基質(zhì)的吩嗪生物合成PhzD蛋白質(zhì)的影響下ADC僅能勉強地進行加水分解。此外，由于ADC合成在自然界是從分支酸到葉酸(folate)合成中的第1工序，因此，氨基脫氧分支酸合成酶在自然界能夠大量地獲得?？梢酝茰y它們存在于所有的葉酸營養(yǎng)型有機體中，例如，細菌、酵母、植物、以及低級真核生物。已知氨基脫氧分支酸合成酶也與p-氨基苯甲酸的合成有關(guān)。在本發(fā)明中，使用了尚未確認從分支酸向4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)的轉(zhuǎn)化活性的papA樣基因(PfpapA)。由于從4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)向4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸(ADP)的生物合成路徑根據(jù)例如Tengetal.,J.Am.Chem.Soc.107(1985)5008-5009是公知的，但是可以認為ADP的生物合成及回收正如其對于ADC是公知那樣，恐怕生成物ADP是不穩(wěn)定，因此沒有被記載過。該文獻與Blancetal.,Mol.Mic.23(1997)191-202的公開相同，示出了4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)和4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸(ADP)的、各自能夠向4-氨基苯丙氨酸(4APhe)生物合成的路徑，但是完全沒有啟示生成物ADC及ADP的、各自向4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的發(fā)酵路徑及回收。如上所述，在專利文獻3中，公開了至少通過屬于氨基脫氧分支酸合成酶的類別的酶進行催化的、4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)的生物合成通過獲得含有4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)及4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸(ADP)的發(fā)酵培養(yǎng)液，同時在提高了的活性水平下在具有4-氨基-4-脫氧分支酸合成酶的宿主微生物體內(nèi)進行發(fā)酵來進行，并且，這些化合物一起或單獨地從發(fā)酵培養(yǎng)液回收。在本發(fā)明中，使用了尚未確認從4-氨基-4-脫氧分支酸(ADC)向4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸(ADP)的轉(zhuǎn)化活性的papB樣基因(PfpapB)。在從4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸(ADP)向4-氨基苯丙酮酸的生物合成路徑中，涉及4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶。4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸脫氫酶是進行ADP的氧化脫碳酸的酶，是使ADP的1位羧基脫離，生成具有芳香環(huán)的4-氨基苯丙酮酸的酶。在本發(fā)明中，使用了尚未確認從4-氨基-4-脫氧預(yù)苯酸(ADP)向4-氨基苯丙酮酸的轉(zhuǎn)化活性的papC樣基因(PfpapC)。在從4-氨基苯丙酮酸向4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的生物合成路徑中，涉及氨基轉(zhuǎn)移酶。氨基轉(zhuǎn)移酶是將氨基酸的氨基向α-酮酸轉(zhuǎn)移的酶，并已知酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等與芳香族氨基酸的生物合成有關(guān)。此時，利用谷氨酸作為氨基供體。在本發(fā)明中，在從4-氨基苯丙酮酸向4-氨基苯丙氨酸(4APhe)的轉(zhuǎn)化中，使用了宿主微生物的內(nèi)源性酶。在從4-氨基苯丙氨酸(4APhe)向4-氨基肉桂酸(4ACA)的生物合成路徑中，涉及脫氨酶。脫氨酶是指使苯丙氨酸脫氨酶、酪氨酸脫氨酶、組氨酸脫氨酶等芳香族氨基酸的α-氨基脫離生成α-β不飽和羧酸和氨的酶，最好是來自NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)保藏號NP_187645.1、NCBI保藏號DQ013364.1、NCBI保藏號EGU13302.1、以及NCBI保藏號KF770992.1等植物、微生物的脫氨酶。苯丙氨酸脫氨酶(Pal)是具有將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸的活性的酶，到目前為止，成功地使用使來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的Pal4基因(野生型、及變異型的F126E、F126D)或者粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)的PAL基因(RgPal)表達的大腸桿菌進行休止菌體反應(yīng)，將4APhe轉(zhuǎn)化為4ACA。在本發(fā)明中，在從4-氨基苯丙氨酸(4APhe)向4-氨基肉桂酸(4ACA)的轉(zhuǎn)化中使用了RgPal。在從4-氨基苯丙酮酸向2-(4-氨基苯基)醛的生物合成路徑中，涉及脫羧酶。脫羧酶是指使丙酮酸衍生物的羧酸基脫離生成醛衍生物和二氧化碳的酶，特別是，使用能夠?qū)⒁员奖釣槭椎姆枷阕灞嵫苌镒鳛榛|(zhì)來利用的脫羧酶。為了該目的，使用來自酵母的苯丙酮酸酸脫羧酶(NCBI保藏號NM_001180688.3)，也能夠利用NCBI保藏號XP_002498188、NCBI保藏號XP_444902.1等類似的酶。在本發(fā)明中，在從4-氨基苯丙酮酸向2-(4-氨基苯基)醛的轉(zhuǎn)化中，使用已知將苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為苯乙醛的苯丙酮酸脫羧酶的酵母Aro10。在從2-(4-氨基苯基)醛向4-氨基苯基乙酸的生物合成路徑中，涉及醛脫氫酶。醛脫氫酶是以NAD+或NADP+作為輔酶、將醛氧化獲得羧酸的酶，可以使用來自原核生物、真核生物的醛脫氫酶。特別是，可以使用能夠?qū)⒁员揭胰槭椎姆枷阕迦┳鳛榛|(zhì)來利用的醛脫氫酶。特別是，為了該目的，可以使用作為來自酵母的苯乙酰胺醛脫氫酶的NCBI保藏號NP_013893.1、NCBI保藏號NP_013892.1、與他們類似的酶。在從2-(4-氨基苯基)醛向4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的生物合成路徑中，涉及醇脫氫酶。醇脫氫酶是以NADH或NADPH作為輔酶還原醛獲得醇的酶，可以使用來自原核生物、真核生物的醇脫氫酶。特別是，可以使用能夠?qū)⒁员揭胰槭椎姆枷阕迦┳鳛榛|(zhì)來利用的醇脫氫酶。特別是，為了該目的，能夠使用作為來自酵母的醇脫氫酶的NCBI保藏號NP_014555.1、NCBI保藏號NP_014032.1、NCBI保藏號NP_013800.1、NCBI保藏號NP_011258.1、NCBI保藏號NP_009703.1、以及與他們類似的酶。也能夠利用苯胺衍生物的生產(chǎn)宿主表達的、來自生產(chǎn)宿主的酶。在本發(fā)明中，在從2-(4-氨基苯基)醛向4-氨基苯乙醇(4APE)的轉(zhuǎn)化中，使用了宿主微生物的內(nèi)源性酶。此外，大腸桿菌的AroG及AroF是在芳香族氨基酸的生物合成路徑中催化初步反應(yīng)的酶的一種，并在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸的合成中使用。已知AroG的酶活性被苯丙氨酸抑制。對反饋抑制表現(xiàn)耐性的變異型AroG，在使用大腸桿菌的芳香族氨基酸及其類似物的高生產(chǎn)率中利用，但是AroG4是該變異型AroG的一種。此處，在以下的實施例中，導(dǎo)入了AroG4。此外，大腸桿菌的PheA為苯丙氨酸合成系的酶，具有將分支酸(chorismate)轉(zhuǎn)化苯丙酮酸(phenylpyruvate)的活性。由于分支酸也是PapA的基質(zhì)，因此可以預(yù)見通過破壞pheA基因，作為PapA基質(zhì)的分支酸的宿主細胞內(nèi)濃度上升。此處，在以下的實施例中，破壞了pheA基因。實施例通過以下的實施例等對本發(fā)明進行具體的說明。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成在圖2中表示發(fā)酵培養(yǎng)基的組成。在發(fā)酵中，使用以下培養(yǎng)條件，并將此設(shè)為本說明書的“規(guī)定培養(yǎng)條件”。規(guī)定的培養(yǎng)條件(前培養(yǎng))向試管中加入4ml的液體的以下LB培養(yǎng)基，向其中添加100μl大腸桿菌的甘油保存液，在37℃、120rpm下培養(yǎng)6小時。(培養(yǎng)基組成(/L))在以下的表1中表示LB培養(yǎng)基組成。使用了用高壓滅菌器進行121℃、15分鐘滅菌了的培養(yǎng)基。表1LB培養(yǎng)基pH7.0Tryprone10g/LYeastextract5g/LNaCl10g/L(本培養(yǎng))在50ml的試管中加入5ml的所述發(fā)酵培養(yǎng)基，向其中添加500μl前培養(yǎng)液并在37℃、120rpm下培養(yǎng)12小時。隨后，添加IPTG以使最終濃度成為0.1mM，再培養(yǎng)12小時。使用了燒瓶的培養(yǎng)如下所述：在500ml的帶翼燒瓶中，加入以最終濃度為10g/l的方式添加了葡萄糖的100ml的所述發(fā)酵培養(yǎng)基，向其中添加500μl前培養(yǎng)液并在30℃下進行培養(yǎng)。需要說明的是，在使用大腸桿菌NST37(DE3)(ATCC31882，美國專利第4,681,852號，基因型aroG,aroF,pheA,tyrR,tyrA,trpE)或其衍生物作為表達用宿主時，在培養(yǎng)基中添加酪氨酸和色氨酸以使酪氨酸和色氨酸成為0.05g/l。在IPTG的表達誘導(dǎo)后，在每培養(yǎng)12小時，添加葡萄糖以使葡萄糖成為5g/l。在培養(yǎng)36小時后，調(diào)查作為評價對象化合物的4APhe的產(chǎn)量。菌株的制作(pheA基因破壞菌株的制作)按照Baba,T.etal.Mol.Syst.Biol.2,2006.0008(2006)所報告的順序，使用含有與pheA基因的ORF外側(cè)50bp相同的序列及FRT序列的引物(Primerset)(序列號4：5'-gtgaaaacagtacgggtactgtactaaagtcacttaaggaaacaaacatggaagttcctattctctagaaagtataggaacttctggacagcaagcgaaccggaattgc-3'；以及序列號3：5'-gatgattcacatcatccggcaccttttcatcaggttggatcaacaggcacgaagttcctatactttctagagagaataggaacttctcagaagaactcgtcaagaaggcg-3')，以pZE21MCS(LutzandBujard,Nucl.AcidsRes.(1997)25(6):1203-1210)為模板擴增了卡那霉素耐性基因。將獲得的基因片段作為破壞用基因盒。通過將NST37菌株(ATCC31882、美國專利第4,681,852號、基因型aroG,aroF,pheA,tyrR,tyrA,trpE)的基因組上的含有pheA基因區(qū)域利用Red(注冊商標)/ET(注冊商標)Recombination置換為破換用基因盒，獲得pheA基因破壞菌株?；蚱茐木甑幕蚪M上的卡那霉素耐性基因利用FLP-FRTrecombinationsystem去除。將獲得的pheA基因破壞菌株命名為NST37(DE3)/ΔpheA菌株。此外，該菌株在不含有苯丙氨酸的M9培養(yǎng)基中不能繁殖。(aroG4、aroF表達用質(zhì)粒的構(gòu)筑)利用GeneScript公司的人工基因合成服務(wù)，合成在末端包含具有EcoRI和HindIII裂解位點的aroG4基因的DNA片段(序列號1、APPL.ENVIRON.MICROBIOL、63,761-762(1997))。用T4DNAPolymerase將其平滑化之后，連接于具有預(yù)先用EcoRV切割了的氯霉素耐性基因的pACYC184(日本基因公司)。將獲得的質(zhì)粒作為pACYC-aroG4。將其導(dǎo)入NST37(DE3)/ΔpheA，制作NST37(DE3)/ΔpheA/pACYC-aroG4菌株。(PFLU1770、PFLU1771、PFLU1772表達用質(zhì)粒的構(gòu)筑)使用基因數(shù)據(jù)庫搜索編碼與委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)的PapABC顯示同源性的蛋白質(zhì)的基因之后，屬于和大腸桿菌相同變形菌門的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescence)SBW25菌株(DeLeijFetal.(1995)ApplEnvironMicrobiol61:3443-3453)的PFLU1770、PFLU1771、PFLU1772分別顯示了34％(PapC)、44％(PapA)、28％(PapB)的同源性。此處，制作使這些基因表達的重組大腸桿菌，調(diào)查4APhe的產(chǎn)量。利用GeneScript公司的人工基因合成服務(wù)，合成了屬于和大腸桿菌相同變形菌門的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescence)SBW25菌株的PFLU1770基因(序列號5、PfPapC基因)、PFLU1771基因(序列號7、PfPapA基因)、以及PFLU1772基因(序列號9、PfPapB基因)。此時，將各基因的堿基序列的密碼子在大腸桿菌的表達用最優(yōu)化。通過將連接于pUC57(Genescript公司)的各基因，用各種限制酶切割，并連接于pETduet-1(Novagen公司)、pRSFduet-1(Novagen公司)或pCDFduet-1(Novagen公司)，來構(gòu)筑pET-PFLU1771、pRSF-PFLU1771、pCDF-PFLU1771、pET-PFLU1770_1772、pRSF-PFLU1770_1772、以及pCDF-PFLU1770_1772。即，人工基因合成PFLU1771(PfpapA)，導(dǎo)入pETduet-1來制作pET-PFLU1771。此外，人工基因合成PFLU1770(PfpapC)和PFLU1772(PfpapB)，插入pCDFduet-1來制作pCDF-PFLU1770_1772。(SvpapABC、SppapBC表達質(zhì)粒的構(gòu)筑)制作以下的三種質(zhì)粒。此時，作為PCR的模板，使用委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)(ATCC保藏號10712)以及始旋鏈霉菌(Streptomycespristinaespiralis)(ATCC保藏號25486)的全部DNA。pET-svpapA：使用以下的引物對(序列號11：5’-gacacatatgcgcacgcttctgatcgac-3’和序列號12：5’-gacgatatcatcgggcgcccgccacggc-3’)通過PCR擴增包含svPapA基因(Heetal.,Microbiol,147:2817-2829(2001))的DNA片段。使用限制酶NdeI和EcoRV使其消化，并連接于使用相同的酶處理了的pETduet-1，獲得了pET-svpapA。pRSF-svpapBC：使用以下的引物對(序列號13：5’-gagccatgggcaccgagcagaacgagctg-3’和序列號14：5’-cagaagcttcaccgccggtcctcggccgtc-3’)通過PCR擴增包含svPapB基因(Heetal.,Microbiol,147:2817-2829(2001))的DNA片段。使用限制酶NcoI和HindIII將其消化，并連接于使用相同酶處理了的pRSFduet-1，獲得質(zhì)粒。將使用以下引物對(序列號15：5’-cagagacatatgagcggcttcccccgcag-3’和序列號16：5’-gactcgagtcatcggtccttctcgccttcg-3’)通過PCR擴增而獲得的包含svPapC基因(Heetal.,Microbiol,147:2817-2829(2001))的DNA片段連接于所獲得的質(zhì)粒的NdeI-XhoI部位，從而獲得pRSF-svpapBC。pRSF-sppapBC：使用以下引物對(序列號17：5’-cagccatgggcaccccgcccgccatcccc-3’和序列號18：5’-cagaagcttcacgacacggccccccgcg-3’)通過PCR擴增包含spPapB基因(Blancetal.,Mol.Nicrobiol.23:191-202(1997))的DNA片段。使用限制酶NcoI和HindIII將其消化，并連接于使用相同酶處理了的pRSFduet-1，獲得質(zhì)粒。將使用以下引物對(序列號19：5’-cagagacatatgaggggtggttcggtgttcg-3’和序列號20：5’-cagatatcagtgcagggcggtgaacatc-3’)通過PCR擴增而獲得的包含spPapC基因(Blancetal.,Mol.Nicrobiol.23:191-202(1997))的DNA片段連接于所獲得的質(zhì)粒的NdeI-EcoRV部位，從而獲得pRSF-sppapBC。(Aro10表達用質(zhì)粒的構(gòu)筑)以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)S288C(ATCC204508)的基因組作為模板，使用以下引物對(序列號21：5’-gagccatggcacctgttacaattga-3’和序列號22：5’-gacggatcctattttttatttcttttaaagtgc-3’)通過PCR擴增Aro10基因(序列號23)。使用限制酶NcoI和BamHI將其消化，并連接于使用相同酶處理了的pRSF-duet1，從而獲得pRSF-aro10。(pET-PFLU1771_Rgpal的制作)使用以下引物對(序列號25：5’-gacggatccgatggccccctccgtcgactc-3’和序列號26：5’-gctgaattcttatgccatcatcttgacgag-3’)通過使用PCR擴增包含來自酵母粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis)的PAL基因(序列號27)(RgPAL基因)的DNA片段。使用限制酶BamHI和EcoRI將其消化，并連接于使用相同酶處理了的pET-PFLU1771，從而獲得pET-PFLU1771_Rgpal。(pRSF-Rgpal的制作)使用以下引物對(序列號25和序列號26)通過PCR擴增包含RgPAL基因的DNA片段。使用限制酶BamHI和EcoRI將其消化，并連接于使用相同酶處理了的pRSFduet-1，從而獲得pRSF-Rgpal。使用發(fā)酵罐的培養(yǎng)向包含500ml的4APhe生產(chǎn)用培養(yǎng)基的、1.0L容積發(fā)酵罐(BMJ-1:Biotto)中，接種1/10量的在LB培養(yǎng)基培養(yǎng)了的前培養(yǎng)液。以0.6L/min通入空氣，并將攪拌速度設(shè)定為500r.p.m。在O.D.達到0.4-0.5時添加IPTG以使最終濃度是0.1mM。使用進給控制系統(tǒng)BF510(ABLEBiott公司)進行在葡萄糖統(tǒng)計的培養(yǎng)。此時，設(shè)定BF510，以使在每1小時測定葡萄糖濃度，當測定值低于1.5g/l時，向培養(yǎng)槽添加1g葡萄糖、0.2g氯化銨。樣品的各種分析法細胞濃度使用分光光度計(UVmini-1240)在600nm下進行測量。葡萄糖濃度的測量使用葡萄糖檢測試劑盒(Wako)，通過比色定量來進行。培養(yǎng)基中的4APhe的濃度測量使用HPLC(1200infinityseries:HewlettPackerd)，測量210、254以及280nm的波長的吸光度作為指標。實施例1將所述pET-PFLU1771和所述pCDF-PFLU1770_1772導(dǎo)入大腸桿菌NST37(DE3)/ΔpheA/pACYC-aroG4獲得PFABCΔAro菌株。將IPTG濃度設(shè)為0.1mM將各菌株在所述的“規(guī)定的培養(yǎng)條件”下進行培養(yǎng)，調(diào)查培養(yǎng)36小時后的4APhe的產(chǎn)量。其結(jié)果是，PFABCΔAro菌株生產(chǎn)領(lǐng)了1.8g/L的4APhe。比較例1在利用和實施例1相同的手法，使用始旋鏈霉菌(Streptomycespristinaespiralis)的papABC(pET-spPapA和pRSF-spPapBC)的情況下，獲得0.2g/L的4APhe。此外，在使用委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)的papA(pET-svpapA)和始旋鏈霉菌的papBC(pRSF-sppapBC)的情況下，能夠獲得0.9g/L的4APhe，但是不如實施例1的結(jié)果理想。實施例2：PFABCΔAro菌株在發(fā)酵罐的培養(yǎng)使用所述的“使用發(fā)酵罐的培養(yǎng)”所示的方法，在使用PFABCΔAro菌株進行培養(yǎng)之后，如圖3所示，成功地生產(chǎn)了最大4.0g/L的4APhe(對糖收率：15％)。在產(chǎn)量不產(chǎn)生變化的培養(yǎng)44小時的對糖收率為13％。實施例3：4-氨基肉桂酸(4ACA)的生產(chǎn)將所述pET-PFLU1771_Rgpal、所述pCDF-PFLU1770_1772、所述pRSF-Rgpal的三種質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌NST37(DE3)/ΔpheA/pACYC-aroG4。將獲得的菌株使用發(fā)酵罐進行培養(yǎng)之后，生產(chǎn)了3mg/L的4ACA。比較例2與此相反，在和實施例3相同培養(yǎng)條件下，在使用現(xiàn)有的pap系基因的情況下，不能生產(chǎn)4ACA。實施例4：4-氨基苯乙基乙醇(4APE)的生產(chǎn)使用酵母的Aro104嘗試發(fā)酵生產(chǎn)APE。培養(yǎng)將pRSF-aro10導(dǎo)入PFABCΔAro而獲得菌株。此時，在IPTG濃度0.1mM或0.3mM的任一種中，培養(yǎng)24小時后，確認4APE的積累。產(chǎn)業(yè)上的可利用性通過本發(fā)明所涉及的方法，能夠通過發(fā)酵法從碳源工業(yè)性地大量地制備選自由4-氨基苯丙氨酸(4APhe)、4-氨基肉桂酸(4ACA)、2-(4-氨基苯基)醛、4-氨基苯基乙酸、以及4-氨基苯乙基乙醇(4APE)組成的組中的至少一種苯胺衍生物。當前第1頁1 2 3