本發(fā)明涉及mir-34a-5p和/或靶基因notch1在調(diào)控雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、肌肉主要分為骨骼肌、平滑肌和心肌，而這三者之中，骨骼肌在全身體重的占比最大。骨骼肌含量決定了肉雞雞肉的產(chǎn)量，而肌纖維的數(shù)量、直徑及類型，都在不同的程度上影響著骨骼肌的含量。動物機(jī)體的生長受外部條件和遺傳因素影響，而遺傳因素涉及眾多基因及其相關(guān)通路的激活或沉默，是一個(gè)極其復(fù)雜的多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這些基因可能通過調(diào)控蛋白質(zhì)合成、肌肉細(xì)胞增殖或肌肉纖維類型的比例等方式，來影響肌肉的生長和發(fā)育。邊雞作為我國的一個(gè)優(yōu)良地方品種，具有肉質(zhì)好、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但其生長速度緩慢、飼料利用率低，各項(xiàng)生長性能指標(biāo)亟待提高。

2、微小rna(mirna)是一種長度約為22nt的非編碼序列，通過與mrna的3’utr區(qū)域結(jié)合來抑制靶基因的表達(dá)。mirna已被證實(shí)在許多生物學(xué)過程中起著關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移。一些肌肉特異性mirna，例如mir-1、mir-206、mir-133等，已被證實(shí)在骨骼肌的生長和再生中起重要作用。禽類胚胎期骨骼肌的生長發(fā)育對其產(chǎn)肉量有著重大影響，胚胎期影響骨骼肌生長發(fā)育的關(guān)鍵mirna和基因的篩選和確定至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種mir-34a-5p和/或靶基因notch1在調(diào)控雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用。

2、技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供干擾mir-34a-5p和/或過表達(dá)notch1基因在促進(jìn)雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，所述mir-34a-5p的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述靶基因notch1的ncbi登錄號為nm_001397796。

3、本發(fā)還提供了mir-34a-5p的抑制物在促進(jìn)雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，所述mir-34a-5p的抑制物的核苷酸序列如seq?id?no.23所示。

4、本發(fā)還提供了過表達(dá)mir-34a-5p和/或干擾notch1基因在抑制雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，所述mir-34a-5p的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述靶基因notch1的ncbi登錄號為nm_001397796。

5、本發(fā)還提供了mir-34a-5p的模擬物在抑制雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，所述mir-34a-5p的模擬物的核苷酸序列如seq?id?no.19～20所示。

6、本發(fā)還提供了notch1基因的干擾序列對在抑制雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，所述notch1基因的干擾序列對的核苷酸序列如seq?id?no.27～28、seq?id?no.29～30、seq?idno.31～32或seq?id?no.33～34任一對所示。

7、本發(fā)還提供了mir-34a-5p的特異性引物或含有所述mir-34a-5p的特異性引物的熒光定量檢測試劑盒在檢測雞骨骼肌生長發(fā)育狀況中的應(yīng)用，所述特異性引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

8、其中，所述熒光定量檢測試劑盒還包括2×mircute?plus?mirnapremix、通用反向引物和無酶雙蒸水。

9、其中，所述檢測試劑盒還包括內(nèi)參u6的引物對，所述內(nèi)參u6的引物對的核苷酸序列如seq?id?no.5～6所示。

10、其中，所述熒光定量檢測試劑盒還包括內(nèi)參β-actin的引物對，所述內(nèi)參β-actin的引物對的核苷酸序列如seq?id?no.7～8所示。

11、本發(fā)還提供了notch1基因的特異性引物對或含有所述notch1基因的特異性引物對的熒光定量檢測試劑盒在檢測雞骨骼肌生長發(fā)育狀況中的應(yīng)用，所述notch1基因的引物對的核苷酸序列如seq?id?no.25～26所示。

12、本發(fā)明通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選與雞骨骼肌生長發(fā)育相關(guān)的mirna，篩選得到mir-34a-5p，該mirna參與調(diào)控雞骨骼肌的生長發(fā)育，能加快雞育種過程中生長性能指標(biāo)的快速改良，通過預(yù)測mir-34a-5p的靶基因，并對mir-34a-5p和靶基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，最終得到mir-34a-5p及靶基因notch1在調(diào)控雞胚胎期骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用。

13、本發(fā)明采集雞胚腿肌原代成肌細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，對成肌細(xì)胞中mir-34a-5p進(jìn)行過表達(dá)和干擾后，提取細(xì)胞總rna進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna。利用本發(fā)明中mir-34a-5p的特異性上游引物和內(nèi)參u6的引物等組成的試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr，pcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同常規(guī)的熒光定量pcr，采用2-△△ct方法對該mirna的表達(dá)水平進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)檢測增殖和分化標(biāo)志基因的表達(dá)趨勢，結(jié)合cck-8、edu檢測、蛋白印記和間接免疫熒光試驗(yàn)綜合分析mir-34a-5p對雞成肌細(xì)胞增殖和分化的影響。通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證mir-34a-5p與預(yù)測靶基因notch1的靶向關(guān)系。利用本發(fā)明中notch1基因的特異性引物和內(nèi)參β-actin的引物等組成的試劑盒進(jìn)行熒光定量pcr，pcr反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同常規(guī)的熒光定量pcr，采用2-△△ct方法對該基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)檢測增殖和分化標(biāo)志基因的表達(dá)趨勢，結(jié)合cck-8、edu檢測、蛋白印記和間接免疫熒光試驗(yàn)綜合分析notch1基因?qū)﹄u成肌細(xì)胞增殖和分化的影響。

14、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點(diǎn)：1、本發(fā)明提供的試劑盒可用于檢測mir-34a-5p在雞肌肉組織和成肌細(xì)胞中的表達(dá)水平，檢測方法簡單快捷；2、本發(fā)明提供的mir-34a-5p可用于雞胚胎期骨骼肌生長發(fā)育的分子機(jī)制研究；3、在后續(xù)研究中通過對mir-34a-5p進(jìn)行過表達(dá)、干擾和靶向關(guān)系驗(yàn)證，確定其在雞胚胎期骨骼肌生長發(fā)育過程中的具體調(diào)控機(jī)制，完善非編碼rna在雞胚胎期骨骼肌生長發(fā)育中的調(diào)控理論；4、對notch1基因進(jìn)行干擾并進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，確定其在雞胚胎期骨骼肌生長發(fā)育過程中的具體作用；5、本發(fā)明提供的mir-34a-5p-notch1組合可為完善雞骨骼肌生長發(fā)育的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供依據(jù)。

技術(shù)特征：

1.干擾mir-34a-5p和/或過表達(dá)notch1基因在促進(jìn)雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述mir-34a-5p的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述靶基因notch1的ncbi登錄號為nm_001397796。

2.mir-34a-5p的抑制物在促進(jìn)雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述mir-34a-5p的抑制物的核苷酸序列如seq?id?no.23所示。

3.過表達(dá)mir-34a-5p和/或干擾notch1基因在抑制雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述mir-34a-5p的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述靶基因notch1的ncbi登錄號為nm_001397796。

4.mir-34a-5p的模擬物在抑制雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述mir-34a-5p的模擬物的核苷酸序列如seq?id?no.19~20所示。

5.notch1基因的干擾序列對在抑制雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，其特征在于，所述notch1基因的干擾序列對的核苷酸序列如seq?id?no.27~28、seq?id?no.29~30、seq?idno.31~32或seq?id?no.33~34任一對所示。

6.mir-34a-5p的特異性引物或含有所述mir-34a-5p的特異性引物的熒光定量檢測試劑盒在檢測雞骨骼肌生長發(fā)育狀況中的應(yīng)用，其特征在于，所述特異性引物的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述熒光定量檢測試劑盒還包括2×mircute?plus?mirnapremix、通用反向引物和無酶雙蒸水。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述熒光定量檢測試劑盒還包括內(nèi)參u6的引物對，所述內(nèi)參u6的引物對的核苷酸序列如seq?id?no.5~6所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述熒光定量檢測試劑盒還包括內(nèi)參β-actin的引物對，所述內(nèi)參β-actin的引物對的核苷酸序列如seq?id?no.7~8所示。

10.notch1基因的特異性引物對或含有所述notch1基因的特異性引物對的熒光定量檢測試劑盒在檢測雞骨骼肌生長發(fā)育狀況中的應(yīng)用，其特征在于，所述notch1基因的引物對的核苷酸序列如seq?id?no.25~26所示。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種miR?34a?5p和/或靶基因NOTCH1在調(diào)控雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，干擾miR?34a?5p和/或過表達(dá)NOTCH1基因在促進(jìn)雞骨骼肌生長發(fā)育中的應(yīng)用，所述miR?34a?5p的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。通過對miR?34a?5p進(jìn)行過表達(dá)、干擾和靶向關(guān)系驗(yàn)證，確定其在雞胚胎期骨骼肌生長發(fā)育過程中的具體調(diào)控機(jī)制，完善非編碼RNA在雞胚胎期骨骼肌生長發(fā)育中的調(diào)控理論；對NOTCH1基因進(jìn)行干擾并進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn)，確定其在雞胚胎期骨骼肌生長發(fā)育過程中的具體作用；本發(fā)明公開的miR?34a?5p?NOTCH1組合可為完善雞骨骼肌生長發(fā)育的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供依據(jù)。

技術(shù)研發(fā)人員：張跟喜,凌暄澤,李國輝,卓處文,周楷智,張紅紅,張莉祺,金崇富,張濤,郭曉東,戴國俊,謝愷舟
受保護(hù)的技術(shù)使用者：揚(yáng)州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/9/12