本發(fā)明涉及生物催化工藝領(lǐng)域，具體涉及一種高底物耐受性的腈水解酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、煙酸(nicotinic?acid)是一種水溶性維生素b，也稱為維生素b3或煙醇酸。其化學(xué)名為尼克酸。煙酸是生物體內(nèi)的重要成分之一，可以促進(jìn)細(xì)胞代謝，維持皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)和消化系統(tǒng)的健康。此外，煙酸還可以降低血脂和膽固醇，對預(yù)防動脈粥樣硬化和心血管疾病有一定的作用。煙酸廣泛應(yīng)用于食品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，可以作為維生素添加劑或藥物成分，具有重要的經(jīng)濟(jì)價值?？勺鳛槭称凤暳咸砑觿⒕S生素類藥物、化學(xué)合成中間體等，市場需求極大。但目前國內(nèi)煙酸產(chǎn)業(yè)現(xiàn)有生產(chǎn)工藝較落后、生產(chǎn)規(guī)模較小、三廢污染嚴(yán)重，產(chǎn)量難以滿足市場需求。采用腈水解酶可一步催化3-氰基吡啶(3-cyanopyridine)合成煙酸，該方法具有作用條件溫和、副產(chǎn)物少、轉(zhuǎn)化效率高等優(yōu)點。

2、腈水解酶能夠催化腈類化合物轉(zhuǎn)化為羧酸和氨，被稱為“綠色生物催化劑”。腈水解酶應(yīng)用廣泛，其對乙腈、丙烯腈等脂肪族底物，咪唑、吡啶等雜環(huán)芳香族底物有著較好的催化效果，然而多數(shù)腈水解酶產(chǎn)生菌仍存在對腈類底物耐受能力差的問題，嚴(yán)重阻礙其應(yīng)用。shreenath?prasad等人篩選得到的rhodococcus?sp.ndb?1165腈水解酶在底物濃度大于50mm就對酶活有明顯影響。monika等人測得gordonia?terrae?mtcc8139腈水解酶在底物濃度50mm時酶活最好，500mm完全抑制。

3、腈水解酶催化腈類化合物的過程中產(chǎn)生的羧酸會使反應(yīng)環(huán)境ph下降，在現(xiàn)有技術(shù)中，一般通過在反應(yīng)過程中控制ph以控制催化進(jìn)程。但是催化ph窄仍是腈水解酶應(yīng)用于工業(yè)的一個難題，拓寬ph也是腈水解酶工業(yè)化應(yīng)用的另一挑戰(zhàn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明針對現(xiàn)有煙酸合成工藝中存在的底物耐受性差及催化ph范圍窄的缺陷，提供了一株高底物耐受性且催化ph范圍寬的工程菌及其突變體在煙酸生物制備中的應(yīng)用；該工程菌株及其突變體具有較高的底物耐受性，能夠在較短反應(yīng)時間內(nèi)達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率，催化ph范圍寬，具有良好的應(yīng)用前景，具體技術(shù)方案如下：

2、第一方面，本發(fā)明提供了一種腈水解酶突變體，所述腈水解酶突變體由ncbi登錄號為wp_154591789.1的野生型腈水解酶突變得到，具體為以下突變的一種，各突變位點及其突變前后的氨基酸單字母簡寫如下所示：

3、y54f；w59f；h136q；e138l；t171p；t173e；w189t；p190v；l194m；l194f；a201q；a201h；a201t；a201y；f202l；q207i；q207n；q207s；s208l；s208q；y54f/h136q/w189t；w59f/h136q/t173e；t173e/p190v/a201t；w189t/p190v/a201q；a201h/f202l/q207i；f202l/q207n/s208l；l194m/a201y/q207n；l194f/a201q/q207s/s208l；t171p/w189t/a201h/q207n；w59f/e138l/q207n/s208q；w189t/p190v/a201q/q207n。

4、本發(fā)明所使用的腈水解酶為來源于砷球菌arsenicicoccus?cauae的nit?b4酶，ncbi登錄號為wp_154591789.1，氨基酸序列如seq?id?no.2所示，其編碼基因序列如seq?idno.1所示。

5、第二方面，本發(fā)明提供了一種上述的腈水解酶突變體的編碼基因。

6、第三方面，本發(fā)明提供了一種包含上述編碼基因的表達(dá)載體。

7、第四方面，本發(fā)明提供了一種上述編碼基因的基因工程菌。

8、進(jìn)一步地，所述基因工程菌的出發(fā)菌株為大腸桿菌(escherichia?coli?bl21(de3))。

9、第四方面，本發(fā)明提供了上述的腈水解酶突變體、上述的編碼基因，或上述的基因工程菌，或野生型腈水解酶在合成煙酸中的應(yīng)用，所述野生型腈水解酶的ncbi登錄號為wp_154591789.1。

10、第五方面，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)煙酸的方法，包括：以3-氰基吡啶為底物，以上述的腈水解酶突變體，或上述的基因工程菌，或野生型腈水解酶為催化劑催化合成煙酸，所述野生型腈水解酶的ncbi登錄號為wp_154591789.1。

11、進(jìn)一步地，所述反應(yīng)ph為5～10。

12、進(jìn)一步地，所述催化過程中底物投料濃度為50～400mm。

13、進(jìn)一步地，所述催化過程以水為溶劑，反應(yīng)溫度為25℃～55℃。

14、進(jìn)一步地，使用基因工程菌為催化劑時，所述基因工程菌的質(zhì)量用量以菌體干重計為1.0～4.0g/l。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

16、(1)本發(fā)明以來源于砷球菌arsenicicoccus?cauae的ncbi登錄號為wp_154591789.1的野生型腈水解酶為基礎(chǔ)，通過突變獲得了在通過3-氰基吡啶合成煙酸的反應(yīng)中具有高底物耐受性的腈水解酶突變體。

17、(2)本發(fā)明中獲得的基因工程菌在生產(chǎn)煙酸的反應(yīng)中不僅具有較高的酶活，還能夠在較短反應(yīng)時間內(nèi)達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率，并且可以適應(yīng)較大的ph范圍。

18、(3)本發(fā)明提供的生產(chǎn)煙酸的方法，其產(chǎn)品分離純化簡單、成本低，生產(chǎn)過程環(huán)保、污染較小、符合綠色化學(xué)理念。

技術(shù)特征：

1.一種腈水解酶突變體，其特征在于，所述腈水解酶突變體由ncbi登錄號為wp_154591789.1的野生型腈水解酶突變得到，具體為以下突變的一種，各突變位點及其突變前后的氨基酸單字母簡寫如下所示：

2.一種如權(quán)利要求1所述的腈水解酶突變體的編碼基因。

3.一種包含權(quán)利要求2所述的編碼基因的表達(dá)載體。

4.一種包含權(quán)利要求2所述編碼基因，或權(quán)利要求3所述的載體的基因工程菌。

5.如權(quán)利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的出發(fā)菌株為大腸桿菌escherichia?coli?bl21(de3)。

6.如權(quán)利要求1所述的腈水解酶突變體，或如權(quán)利要求2所述的編碼基因，或如權(quán)利要求5所述的基因工程菌，或野生型腈水解酶在合成煙酸中的應(yīng)用，其特征在于，所述野生型腈水解酶的ncbi登錄號為wp_154591789.1。

7.一種生產(chǎn)煙酸的方法，其特征在于，包括：以3-氰基吡啶為底物，以如權(quán)利要求1所述的腈水解酶突變體，或如權(quán)利要求4所述的基因工程菌，或野生型腈水解酶為催化劑催化合成煙酸，其特征在于，所述野生型腈水解酶的ncbi登錄號為wp_154591789.1。

8.如權(quán)利要求7所述的煙酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述催化過程的ph為4～10。

9.如權(quán)利要求7所述的煙酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述催化過程的底物濃度為50～400mm。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物催化工藝領(lǐng)域，具體涉及一種高底物耐受性的腈水解酶突變體及其應(yīng)用，所述腈水解酶突變體由NCBI登錄號為WP_154591789.1的野生型腈水解酶突變得到。本發(fā)明所得到的腈水解酶突變體在將3?氰基吡啶催化為煙酸的反應(yīng)中不僅具有更高的酶活，而且可以在較短的反應(yīng)時間內(nèi)達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率，并且在底物濃度增加的情況下，突變體的酶活下降的幅度很小。并且在4～10的pH范圍內(nèi)，突變體的酶活變化的幅度也很小，說明本發(fā)明所提供的腈水解酶突變體不僅具有高底物耐受性，且催化pH范圍也較寬。

技術(shù)研發(fā)人員：吳堅平,朱琪,鄭文隆,楊立榮
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/17