本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種通過抑制二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ)活性而降血糖的馬鮫魚魚頭寡肽及其在治療糖尿病方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、糖尿病(diabetes?mellitus)是一組因胰島素絕對或相對分泌不足以及靶組織細(xì)胞對胰島素敏感性降低引起蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征，其中高血糖為主要標(biāo)志。糖尿病的主要臨床表現(xiàn)為多飲、多尿、多食和體重下降(“三多一少”)，以及血糖高、尿液中含有葡萄糖(正常的尿液中不應(yīng)含有葡萄糖)等。糖尿病若得不到有效的治療，可引起身體多系統(tǒng)的損害，長期存在的高血糖，將導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙。因此研發(fā)高效的降血糖藥物對糖尿病的治療至關(guān)重要。

2、胰高血糖素樣肽-1(glp-1)是回腸內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的一種腦腸肽，通過刺激胰島素、抑制升糖素、抑制胃排空和促進(jìn)胰島細(xì)胞重生的方式來降低血糖。glp-1具有促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素的雙重作用，故當(dāng)患者血糖下降以后，可對胰島素分泌產(chǎn)生刺激，以及對胰升血糖素起到抑制作用，使血糖維持在一個平穩(wěn)的狀態(tài)，以防誘發(fā)心腦血管疾病。但人體自身產(chǎn)生的glp-1極易被體內(nèi)的二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ)降解，血漿半衰期不足2分鐘。因此，尋找dpp-ⅳ抑制劑，降低glp-1的降低速率，維持體內(nèi)glp-1的高水平，就可以抑制胰高血糖素分泌，從而降低血糖。該方法成為開發(fā)治療糖尿病藥物的主攻方向之一。

3、馬鮫魚屬于脊椎動物，魚綱，鯖科鲅屬的一屬魚類的統(tǒng)稱，又稱藍(lán)點(diǎn)馬鮫。中國沿海均有分布，以東海、黃海、渤海較多。肉可供鮮食或制成干品、罐頭食品，肝是制造魚肝油的原料。馬鮫魚膽固醇含量低，富含提高人腦智力的dha元素和大量蛋白質(zhì)、氨基酸以及鈣、鐵、鈉等微量元素，還具有提神和防衰老等食療功效，常食對治療貧血、早衰、營養(yǎng)不良、產(chǎn)后虛弱和神經(jīng)衰弱等癥有一定輔助療效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明設(shè)計的目的在于提供一種具有治療糖尿病用途的馬鮫魚魚頭寡肽，該寡肽通過抑制二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ)活性而實(shí)現(xiàn)降血糖效果，可應(yīng)用于制備治療或者輔助治療糖尿病的藥物和功能產(chǎn)品。

2、該具有降血糖作用的馬鮫魚魚頭寡肽，其特征在于該寡肽氨基酸序列為phe-cys-gly-pro-arg-gly-ser-leu(fcgprgsl)，分子量為836.0da。

3、該具有降血糖作用的馬鮫魚魚頭寡肽的制備方法，包括下述步驟：

4、(1)馬鮫魚魚頭的預(yù)處理：馬鮫魚魚頭解凍、去雜質(zhì)，組織搗碎機(jī)搗碎，按料液比1g:8～10ml加入乙酸乙酯，用超聲輔助脫脂，重復(fù)三次；超聲輔助脫脂后于6000rmp離心25～30min，收集固體沉淀物干燥、研磨、過200目篩，得馬鮫魚魚頭粉末。

5、(2)馬鮫魚魚頭粉末的酶解：將上述脫脂魚頭粉末按照料液比1g:8～10ml加入到na2hpo4-檸檬酸緩沖液中，攪勻，溶液調(diào)溫至35～40℃，調(diào)節(jié)ph值至2.2～2.5，加入魚肚粉末重量2.5～3.0％的胃蛋白酶，酶解5～6h，于沸水浴中10min滅酶活；溶液調(diào)ph值至7.2～7.6，加入魚頭粉末重量1.5～2.0％菠蘿蛋白酶，酶解3.5～4.0h，于沸水浴中10min滅酶活，于8000rmp離心18min，收集上清液，即得馬鮫魚魚頭蛋白酶解液。

6、(3)馬鮫魚魚頭酶解液的超濾分級的制備：將上述馬鮫魚魚頭蛋白酶解液經(jīng)截留分子量為1.0kda和5.0kda的超濾膜進(jìn)行分級，收集3個分級組分(mw<1kda、1kda<mw<5kda和mw>5.0kda)，測定各組分對二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ)的抑制活性(用半數(shù)抑制濃度ic50表示)，選擇活性最好的組分，即馬鮫魚魚頭超濾酶解物；

7、(4)馬鮫魚魚頭二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ)抑制寡肽的分離純化：將上述馬鮫魚魚頭超濾酶解物依次經(jīng)大孔吸附樹脂純化、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(rp-hplc)純化，得到馬鮫魚魚頭二肽基肽酶ⅳ(dpp-iv)抑制寡肽。

8、作為優(yōu)選，步驟1)的馬鮫魚為藍(lán)點(diǎn)馬鮫魚(scomberomorous?niphonius)。

9、作為優(yōu)選，步驟1)的超聲輔助脫脂的工藝參數(shù)為：超聲功率280-300w、超聲溫度30-35℃、超聲時間25～30分鐘。

10、作為優(yōu)選，步驟4)中的大孔吸附樹脂純化、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(rp-hplc)純化的具體過程為：

11、大孔吸附樹脂純化：將馬鮫魚魚頭超濾酶解物配成20～25mg/ml的溶液，加入到hp20ss型大孔吸附樹脂柱(2.5×50cm)，上樣流速為2.0bv/h，靜置吸附2.0～2.5h；然后用3倍柱體積的超純水洗脫除去未吸附成分，再用4～5被柱體積的75％乙醇溶液洗脫，流速0.8～1.2ml/min，收集洗脫溶液，干燥，即為馬鮫魚魚頭大孔吸附樹脂層析酶解物；

12、凝膠柱層析：將馬鮫魚魚頭大孔吸附樹脂層析酶解物溶解于超純水配成濃度為25～30mg/ml的溶液，經(jīng)過sephadex?g-15柱層析(2.0×150cm)分離，用超純水進(jìn)行洗脫，流速0.8～1.0ml/min，根據(jù)214nm下色譜圖收集各色譜峰，測定各個色譜峰的dpp-ⅳ抑制活性，活性最高色譜峰樣品即為凝膠層析酶解物。

13、rp-hplc純化：將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成35～40μg/ml的溶液，利用rp-hplc進(jìn)行純化，根據(jù)制備寡肽的活性得1個高dpp-ⅳ抑制活性的寡肽phe-cys-gly-pro-arg-gly-ser-leu(fcgprgsl)，esi-ms測定其分子量為836.0da。

14、再優(yōu)選，所述rp-hplc條件為：進(jìn)樣量12～15μl；hypersil?ods?c18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：43％乙腈；洗脫速度0.8～1.2ml/min；紫外檢測波長214nm。

15、該馬鮫魚魚頭寡肽phe-cys-gly-pro-arg-gly-ser-leu(fcgprgsl)可顯著抑制二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ)活力，對dpp-ⅳ的ic50為0.402mg/ml；phe-cys-gly-pro-arg-gly-ser-leu(fcgprgsl)顯著降低糖尿病小鼠餐后血糖水平，改善小鼠口服麥芽糖糖耐量和葡萄糖糖耐量，降低總膽固醇(tc)和甘油三酯(tg)的含量。fcgprgsl具有安全無毒副作用、降血糖功效顯著等優(yōu)點(diǎn)，可應(yīng)用于制備治療或者輔助治療糖尿病的藥物和功能產(chǎn)品。

16、本發(fā)明以馬鮫魚加工副產(chǎn)物-魚頭為原料，利用酶解工藝和色譜制備技術(shù)制備通過抑制二肽基肽酶ⅳ(dpp-ⅳ)活性而實(shí)現(xiàn)降血糖效果的寡肽，該寡肽可用于制備治療糖尿病的藥物和功能產(chǎn)品。

技術(shù)特征：

1.一種馬鮫魚魚頭寡肽，其特征在于，所述寡肽的氨基酸序列為：phe-cys-gly-pro-arg-gly-ser-leu，分子量為：836.0da。

2.如權(quán)利要求1所述的一種馬鮫魚魚頭寡肽，其特征在于，所述寡肽采用以下方法制備：

3.權(quán)利要求1所述的馬鮫魚魚頭寡肽在制備用于抑制dpp-ⅳ活力和降低血糖的藥物中的應(yīng)用。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述馬鮫魚魚頭寡肽對二肽基肽酶ⅳ的半抑制濃度ic50為0.402mg/ml。

5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述馬鮫魚魚頭寡肽能顯著降低糖尿病小鼠餐后血糖水平，改善小鼠口服麥芽糖糖耐量和葡萄糖糖耐量，降低總膽固醇和甘油三酯的含量。

6.權(quán)利要求1所述的馬鮫魚魚頭寡肽在制備治療或輔助治療糖尿病的藥物和功能產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明一種具有治療糖尿病用途的馬鮫魚魚頭寡肽及應(yīng)用，以馬鮫魚魚頭為原料，通過超聲脫脂、復(fù)合酶解，超濾膜分級和色譜制備得到二肽基肽酶Ⅳ（DPP?Ⅳ）抑制寡肽Phe?Cys?Gly?Pro?Arg?Gly?Ser?Leu(FCGPRGSL)，質(zhì)譜測定其分子量為836.0?Da。本發(fā)明制備的馬鮫魚魚頭寡肽Phe?Cys?Gly?Pro?Arg?Gly?Ser?Leu(FCGPRGSL)可顯著地抑制DPP?Ⅳ活力，降低模型小鼠的餐后血糖水平，提高小鼠口服葡萄糖糖耐量和麥芽糖糖耐量，降低模型小鼠的甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）的水平，且安全無毒副作用。因此，Phe?Cys?Gly?Pro?Arg?Gly?Ser?Leu(FCGPRGSL)可應(yīng)用于制備治療或者輔助治療糖尿病的藥物和功能產(chǎn)品。

技術(shù)研發(fā)人員：劉家齊,王玉梅
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江海洋大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/17