本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種采用熒光定量pcr或數(shù)字pcr檢測(cè)狗尾草或谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法。

背景技術(shù)：

1、狗尾草（ setaria?viridis）屬單子葉植物綱禾本科黍亞科狗尾草屬，是新型的轉(zhuǎn)基因模式植物，與雙子葉模式植物擬南芥相比具有生長周期短、植株矮小、易于種植、基因組小、二倍體、能產(chǎn)生大量自交系種子等優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的單子葉模式植物。由于其起源于熱帶，具有c4光合作用系統(tǒng)，與谷子、玉米、高粱、甘蔗、薏苡以及重要能源草類親緣關(guān)系接近，也是重要的c4植物模型。目前，狗尾草me34和a10的全基因組測(cè)序和重測(cè)序數(shù)據(jù)都已公布，國內(nèi)越來越多研究單位開始關(guān)注它，特別是谷子（ setaria?italica）育種家們。谷子也是禾本科黍亞科狗尾草屬的一年生植物，狗尾草是谷子的野生祖先。谷子和狗尾草的核型基本相同，帶型相近，基因組大小都約為510mb。狗尾草生長周期短，遺傳轉(zhuǎn)化效率高，將谷子候選基因在狗尾草中過表達(dá)或敲除可快速驗(yàn)證其功能，加快谷子育種的研究進(jìn)程。因此，狗尾草可作為谷子基因功能研究的重要轉(zhuǎn)基因模式植物。

2、在植物的轉(zhuǎn)基因育種研究中，外源基因的表達(dá)及其遺傳穩(wěn)定性受其整合進(jìn)入受體植物基因組的拷貝數(shù)的影響。當(dāng)外源基因以低拷貝（1~2個(gè)）插入到受體植物的基因組時(shí)，一般能夠高效的表達(dá)及穩(wěn)定遺傳，因此，在轉(zhuǎn)基因植物的育種研究中，通常會(huì)選擇外源基因低拷貝插入的轉(zhuǎn)基因株系。然而，低拷貝插入的轉(zhuǎn)基因株系一般都要從大量t0代轉(zhuǎn)基因株系中篩選得到，需要花費(fèi)大量的時(shí)間，因此，簡單、快速、高效、高通量的外源基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)方法對(duì)轉(zhuǎn)基因植物育種研究至關(guān)重要。

3、目前，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因插入拷貝數(shù)的傳統(tǒng)方法是southern雜交，其準(zhǔn)確性高，但成本也高，周期長，難以簡單快速的檢測(cè)大量樣本。近年來，熒光定量pcr（fluorescence?quantitative?pcr，qpcr）和數(shù)字pcr（digital?pcr，dpcr）因其簡單快速且高效的特點(diǎn)，已成功應(yīng)用于多種轉(zhuǎn)基因作物中外源基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)，但仍未見利用這兩種pcr方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因狗尾草中外源基因插入拷貝數(shù)檢測(cè)的報(bào)道。因此，亟需建立利用qpcr和dpcr快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因狗尾草中外源基因插入拷貝數(shù)的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供的是一種采用熒光定量pcr或數(shù)字pcr檢測(cè)狗尾草或谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

3、一種采用熒光定量pcr檢測(cè)狗尾草或谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，是以 ra1基因作為內(nèi)參基因，以 hyg篩選標(biāo)記基因作為外源基因，即篩選標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hygromycin?phosphotransferase， hyg），利用引物對(duì)ra1-f/ra1-r和引物對(duì)hyg-f/hyg-r，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子的基因組dna，并判斷轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中外源基因插入拷貝數(shù)；

4、其中， ra1基因（sevir.2g209800）為狗尾草中的單拷貝基因，該基因在谷子中對(duì)應(yīng)的基因號(hào)為seita.2g201700，且在谷子中也是單拷貝基因，兩基因序列完全一致，兩者的引物對(duì)序列也完全一致；狗尾草中 ra1基因（sevir.2g209800）的序列為如seq?id?no：7所示；谷子中 ra1基因（seita.2g201700）的序列為如seq?id?no：8所示；

5、檢測(cè)內(nèi)參基因 ra1的引物對(duì)序列：

6、正向引物ra1-f為：5’-?cctagtcgcgcagttgttga-3’，如seq?id?no：1所示；

7、反向引物ra1-r為：5’-?atgccaaggagaaacggcag-3’，如seq?id?no：2所示；

8、檢測(cè) hyg篩選標(biāo)記基因的引物對(duì)序列：

9、正向引物hyg-f為：5’-gtcaagaccaatgcggagca-3’?，如seq?id?no：3所示；

10、反向引物hyg-r為：5’-cccaatacgaggtcgccaac-3’?，如seq?id?no：4所示；

11、采用熒光定量pcr檢測(cè)過程中，轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的判斷方法為：

12、外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為0.5時(shí)（即外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為0.26~0.74時(shí)），轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子為單拷貝插入；

13、外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為1時(shí)（即外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為0.75~1.25時(shí)），轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子為雙拷貝插入；

14、外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為1.5時(shí)（外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為1.26~1.74時(shí)），轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子為三拷貝插入；

15、外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)約為2時(shí)（外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)為1.75~2.25時(shí)），轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子為四拷貝插入；

16、以此類推轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子的其它插入拷貝數(shù)，例如五拷貝插入、六拷貝插入等。

17、進(jìn)一步的，采用熒光定量pcr檢測(cè)過程中，以轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子的基因組dna為dna模板，利用引物對(duì)ra1-f/ra1-r和引物對(duì)hyg-f/hyg-r，進(jìn)行熒光定量pcr檢測(cè)。

18、進(jìn)一步的，采用熒光定量pcr檢測(cè)過程中，擴(kuò)增 ra1基因的反應(yīng)體系為：2?x?qpcrmaster?mix?10.00μl、low?rox?dye?0.20μl、濃度為10.00μm的ra1-f?0.40μl、濃度為10.00μm的ra1-r?0.40μl、濃度為30.00ng/μl的dna模板?2.00μl和ddh2o?7.00μl，總體積為20.00μl。

19、進(jìn)一步的，采用熒光定量pcr檢測(cè)過程中，擴(kuò)增 hyg基因的反應(yīng)體系為：2?x?qpcrmaster?mix?10.00μl、low?rox?dye?0.20μl、濃度為10.00μm的hyg-f?0.40μl、濃度為10.00μm的hyg-r?0.40μl、濃度為30.00ng/μl的dna模板?2.00μl和ddh2o?7.00μl，總體積為20.00μl。

20、進(jìn)一步的，采用熒光定量pcr檢測(cè)過程中，擴(kuò)增 ra1基因的和 hyg基因的擴(kuò)增程序均為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10s，62℃退火30s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線95℃?15s，62℃?60s，95℃?15s。

21、進(jìn)一步的，外源基因的相對(duì)拷貝數(shù)是以已知的雙拷貝的轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子作為參照因子，采用法分析待測(cè)轉(zhuǎn)基因狗尾草或待測(cè)轉(zhuǎn)基因谷子相對(duì)于參照因子拷貝數(shù)的倍數(shù)。

22、一種采用數(shù)字pcr檢測(cè)狗尾草或谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，是以 ra1基因作為內(nèi)參基因，以 hyg篩選標(biāo)記基因作為外源基因，利用引物對(duì)ra1-f/ra1-r和引物對(duì)hyg-f/hyg-r，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子的基因組dna，并判斷轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中外源基因插入拷貝數(shù)；

23、檢測(cè)內(nèi)參基因 ra1的引物對(duì)及探針序列：

24、正向引物ra1-f為：5’-?cctagtcgcgcagttgttga-3’，如seq?id?no：1所示；

25、反向引物ra1-r為：5’-?atgccaaggagaaacggcag-3’，如seq?id?no：2所示；

26、探針ra1-p為：vic-tcatgagctcaggttgtcgcgcgca-mgb，如seq?id?no：5所示；

27、檢測(cè) hyg篩選標(biāo)記基因的引物對(duì)及探針序列：

28、正向引物hyg-f為：5’-gtcaagaccaatgcggagca-3’?，如seq?id?no：3所示；

29、反向引物hyg-r為：5’-cccaatacgaggtcgccaac-3’?，如seq?id?no：4所示；

30、探針hyg-p為：fam-tcgaagtagcgcgtctgctgctcca-bhq1，如seq?id?no：6所示；

31、采用數(shù)字pcr檢測(cè)過程中，轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的判斷方法為：

32、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為0.5時(shí)（即外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值為0.26~0.74時(shí)），轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子為單拷貝插入；

33、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為1時(shí)（外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值為0.75~1.25時(shí)），轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子為雙拷貝插入；

34、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為1.5時(shí)（外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值為1.26~1.74時(shí)），轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子為三拷貝插入；

35、外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值約為2時(shí)（外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值為1.75~2.25時(shí)），轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子為四拷貝插入；

36、以此類推轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子的其它插入拷貝數(shù)，例如五拷貝插入、六拷貝插入等。

37、進(jìn)一步的，采用數(shù)字pcr檢測(cè)過程中，以轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子的基因組dna為dna模板，利用引物對(duì)ra1-f/ra1-r和引物對(duì)hyg-f/hyg-r，進(jìn)行數(shù)字pcr檢測(cè)。

38、進(jìn)一步的，數(shù)字pcr的反應(yīng)體系為：微滴式數(shù)字pcr用反應(yīng)預(yù)混液10.00μl、濃度為10.00μm的ra1-f?1.80μl、濃度為10.00μm的ra1-r?1.80μl、濃度為10.00μm的hyg-f?1.80μl、濃度為10.00μm的hyg-r?1.80μl、濃度為10.00μm的探針ra1-p?0.50μl、濃度為10.00μm的探針hyg-p?0.50μl、濃度為30.00ng/μl的dna模板?1μl和無核酸酶水0.80μl，總體積20.00μl。

39、進(jìn)一步的，數(shù)字pcr的擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃?10min；95℃?30s，62℃?1min，45個(gè)循環(huán)；98℃?10min；

40、數(shù)字pcr反應(yīng)結(jié)束后，將芯片放入生物芯片分析儀中讀取fam和vic熒光信號(hào)，并使用quantdrop?software進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)分析，得到dna模板中外源基因和內(nèi)參基因的拷貝數(shù)（copy/μl），計(jì)算轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中外源基因與內(nèi)參基因的拷貝數(shù)比值，通過比值判斷外源基因在轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子基因組中的插入拷貝數(shù)。

41、本發(fā)明的一種采用熒光定量pcr或數(shù)字pcr檢測(cè)狗尾草或谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法的有益效果為：

42、本發(fā)明提供的單拷貝的狗尾草基因或谷子基因，可作為用于轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)的內(nèi)參基因，以轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中的最常用的篩選標(biāo)記 hyg基因?yàn)橥庠椿?，利用?shù)字pcr或熒光定量pcr技術(shù)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的快速高通量檢測(cè)；

43、本發(fā)明提供了一種利用數(shù)字pcr或熒光定量pcr技術(shù)高通量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，具有簡單快速、樣本要求低、高效、高通量等特點(diǎn)，能夠提高大規(guī)模篩選轉(zhuǎn)基因株系的效率，可為轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子育種研究中外源基因插入拷貝數(shù)的檢測(cè)提供新的選擇；

44、本發(fā)明提供的一種采用熒光定量pcr檢測(cè)狗尾草或谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，可用于所有以 hyg為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因狗尾草的拷貝數(shù)檢測(cè)；本發(fā)明中狗尾草的 ra1基因與其在谷子中對(duì)應(yīng)的基因seita.2g201700的核苷酸序列完全一致，兩者的引物對(duì)序列也完全一致；因此本發(fā)明提供的方法也適用于以 hyg為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因谷子的拷貝數(shù)檢測(cè)；該方法具有簡單快速、成本低、樣本需求量少等優(yōu)點(diǎn)，其準(zhǔn)確性足以滿足檢測(cè)單低拷貝的育種需求，更適合批量檢測(cè)；

45、本發(fā)明提供的一種采用數(shù)字pcr檢測(cè)狗尾草或谷子中外源基因插入拷貝數(shù)的方法，可用于所有以 hyg為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因狗尾草或轉(zhuǎn)基因谷子的拷貝數(shù)檢測(cè)；本發(fā)明中狗尾草的 ra1基因與其在谷子中對(duì)應(yīng)的基因seita.2g201700的核苷酸序列完全一致，兩者的引物對(duì)序列也完全一致；因此本發(fā)明提供的方法也適用于以 hyg為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因谷子的拷貝數(shù)檢測(cè)；該方法具有絕對(duì)定量、準(zhǔn)確度高、簡單快速、樣本需求量少、能批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。