一種β-羰基羧酸酯還原酶的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用β-羰基羧酸酯類化合物與金屬離 子的顯色反應(yīng)，能夠快速方便大量的篩選出能夠生產(chǎn)β -羰基羧酸酯還原酶的方法，該方 法具有操作方便、快速、準(zhǔn)確和通量高等特點。
【背景技術(shù)】
[0002] 光學(xué)純手性仲醇是一類重要的化合物，被廣泛應(yīng)用于手性助劑和制藥領(lǐng)域。手性 仲醇的合成可通過化學(xué)法和生物酶法獲得?；瘜W(xué)合成手性仲醇需要還原劑、金屬催化劑、有 機(jī)溶劑，而且副產(chǎn)物多，對環(huán)境的污染嚴(yán)重。而生物酶法合成手性醇具有反應(yīng)條件溫和、選 擇性高、副反應(yīng)少、產(chǎn)物比較單一、收率高、光化學(xué)純度、無環(huán)境污染等特點。因為其具有獨 特的優(yōu)越性，成為了近年來國內(nèi)外研究的熱點。
[0003] 羰基還原酶可高效催化羰基化合物合成手性仲醇。為擴(kuò)大羰基還原酶酶源， 許多篩選方法應(yīng)用于羰基還原酶的篩選。TLC法簡單快捷，但其通量較低。分光光度法檢測 NADH的減少，其靈敏度較高，但是輔酶價格昂貴，不利于高通量檢測。高效氣相和高壓液相 檢測方法，靈敏度高，但是設(shè)備費用昂貴，操作繁瑣。綜上所述，建立一種快速、準(zhǔn)確、低成本 和易操作的羰基還原酶篩選方法是非常必要的。本研究小組發(fā)現(xiàn)在室溫下（25~35 °C )條 件下4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)等β -羰基羧酸酯可與金屬離子顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，并 在24孔板中建立了羰基還原酶的高通量篩選方法。該方法具有快速、準(zhǔn)確、易操作和通量 高等特點。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了所述的重組還原酶菌株大腸埃希氏菌fecAericAia coJi. CCZU-K14,該菌株已于2014年6月13日保藏在位于中國北京的北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號的中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中 心（CGMCC)，保藏號為 CGMCC No. 9298。
[0006] 本發(fā)明提供了一種羰基羧酸酯還原酶的高通量篩選方法。其特征在于，利用 4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)及其結(jié)構(gòu)類似物等β -羰基羧酸酯與金屬離子溶液發(fā)生顯色反 應(yīng)，于510 nm條件下分析。該方法可在24孔板中進(jìn)行操作，可建立β-羰基羧酸酯還原酶 的高通量篩選方法。在24孔板中篩選顯色方法操作步驟如下： (1)稱取重組A cWi CCZU-K14靜息細(xì)胞(濕重）懸浮于磷酸緩沖溶液體系（pH 7. 0， 100 mmol/L)形成10% (質(zhì)量濃度）的細(xì)胞懸液，加入終濃度為500-3000 mmol/L的底物 β -羰基羧酸酯、750-4500 mmol/L的葡萄糖和50 μ mol/L的NAD+混合均勻后在30°C、160 r/min的條件下進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化反應(yīng)。
[0007] (2)反應(yīng)結(jié)束，加入等體積乙酸乙酯萃取，顯色是在24孔板中進(jìn)行的。萃取液：顯 色劑 A (0.04 ~ 0.08 mol/L):顯色劑 B (0.1 ~ 0.3 mol/L) =20:800:800 (體積比），在 20~35°C下顯色反應(yīng)15~30 min后取顯色反應(yīng)液至另一 24孔板中，加入9倍體積的無水乙 醇混合均勻，用紫外-可見分光光度計測其在510 nm波長下進(jìn)行分析。
[0008] 其中步驟（1)所述方法，顯色劑 A 為 FeCl3、FeCl2、Fe2 (SO4) 3、FeS04、Fe (ClO4) 3、CoCljP ZnCl2中的一種；顯色劑B為HCl、H #04和HClO 4中的一種。
[0009] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明的一種β-羰基羧酸酯還原酶的高通量篩選方法，具有操作方便、快速、準(zhǔn)確和 通量高等特點。
[0010]
【附圖說明】
[0011] 圖I CCZU-K14靜息細(xì)胞還原4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)[圖注：圖中1-6為 CCZU-K14靜息細(xì)胞催化還原500 mmol/L的底物4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)反應(yīng)進(jìn)行0、1、 2、3、4、5 h的顯色測定結(jié)果；圖中1'-6'為滅活催化劑與還原反應(yīng)產(chǎn)物（4-氯-3-羥基丁酸 乙酯）與顯色劑的顯色結(jié)果(空白對照）]。
【具體實施方式】
[0012] 本發(fā)明所涉及的驗證方法菌株為重組大腸埃希氏菌 Escherichia coli. CCZU-K14,該菌株已于2014年6月13日保藏在位于中國北京的北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號的中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心中心 (CGMCC)，保藏號為CGMCC No. 9298。該菌株為一種生產(chǎn)羰基還原酶菌株，可催化底物4-氯 乙酰乙酸乙酯（COBE)合成4-氯-3羥基丁酸乙酯（義構(gòu)型，e. e.值>99. 9%)。
[0013] 本發(fā)明涉及的菌株重組A cWi CCZU-K14具有如下微生物學(xué)特征： 1.形態(tài)特征： 桿狀，周生鞭毛，能運動，無芽孢，大小為0. 5X 1~3 μπι。
[0014] 2.平板固體培養(yǎng)基上的菌落特征（30 °C，24 h): 圓形，1~4 mm ;培養(yǎng)初期表面有光澤、濕潤、光滑。
[0015] 3.生長環(huán)境 最適生長溫度37 °C，最適生長pH 7.0。生長溫度范圍為15~46 °C。
[0016] 實施例1 :FeCl 3顯色液分析 稱取A cWi CCZU-K14靜息細(xì)胞(濕重）懸浮于2 mL磷酸緩沖溶液體系（pH7. 0,100 mmol/L)形成10%(質(zhì)量濃度)的細(xì)胞懸液，加入終濃度為3000 mmol/L的底物4-氯乙酰乙酸 乙酯（C0BE)、4500 mmol/L 的葡萄糖和 300 ymol/L 的NAD+，混合均勾后在 30 °C、160 r/min 的條件下進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化反應(yīng)15 h。反應(yīng)結(jié)束后加入等體積乙酸乙酯溶液萃取，進(jìn)一步在24 孔板中進(jìn)行顯色，萃取液：顯色劑A (FeCl3溶液；0. 04 mol/L):顯色劑B (HC1;0. 3 mol/L) =20:800:800 (yL: yL: yL)，在20°C下振蕩反應(yīng)30min，顯色反應(yīng)液利用9倍體積的無 水乙醇混勻后，測其在510 nm波長下的紫外吸收值(標(biāo)準(zhǔn)曲線\。__^}=49. 25X0D51(];R2 = 0. 9915)。經(jīng)計算其轉(zhuǎn)化率為99. 1%，取上清液利用氣相色譜法測定其轉(zhuǎn)化率為99. 5%，兩種 方法測定結(jié)果基本一致，誤差〈5%。
[0017] 實施例2:Fe 2 (SO4) 3顯色液分析 稱取A cWi CCZU-K14靜息細(xì)胞(濕重）懸浮于2 mL磷酸緩沖溶液體系（pH7. 0,100 mmol/L)形成10% (質(zhì)量濃度）的細(xì)胞懸液，加入終濃度為1000 mmol/L的底物4-氯乙酰乙 酸乙酯（C0BE)、1500 mmol/L的葡萄糖和100 ymol/L的NAD+，混合均勻后在30°C、160 r/ min的條件下進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后加入等體積乙酸乙酯溶液萃取，進(jìn)一步 在24孔板中進(jìn)行顯色，萃取液：顯色劑A (Fe2 (SO4)3溶液；0. 08 mol/L):顯色劑B (H2SO4; 0.1mol/L)=20:800:800 UL: yL: yL)，在 35°C 下振蕩反應(yīng) 15min，顯色反應(yīng)液利 用9倍體積的無水乙醇混勻后，測其在510 nm波長下的紫外吸收值(標(biāo)準(zhǔn)曲線 Ycobe (mm〇i/L) =714. 28 X 0D51Q;R 2=0. 9934)。經(jīng)計算其轉(zhuǎn)化率為99. 2%，取上清液利用氣相色譜法測定其轉(zhuǎn) 化率為99. 8%，兩種方法測定結(jié)果基本一致，誤差誤差〈5%。
[0018] 實施例3:Fe (C10 4) 3顯色液分析 稱取A cWi CCZU-K14靜息細(xì)胞(濕重）懸浮于2 mL磷酸緩沖溶液體系（pH7. 0,100 mmol/L)形成10% (質(zhì)量濃度）的懸液，加入終濃度為500 mmol/L的底物4-氯乙酰乙酸乙 酯（C0BE)，混合均勻后在30°C、160 r/min的條件下進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后加 入等體積乙酸乙酯溶液萃取，進(jìn)一步在24孔板中進(jìn)行顯色，萃取液：顯色劑A(Fe (ClO4) 3溶 液；0.07 111〇1/1):顯色劑8(!1(：104;0.3 111〇1/1)=20:800:800 (41^:41^:41^)，在20°(：下 振蕩反應(yīng)30 min，顯色反應(yīng)液利用9倍體積的無水乙醇混勻后，測其在510 nm波長下的紫 外吸收值（Ycqbe (_1/u=666. 67X0D51Q;R 2=0. 9923)。經(jīng)計算其轉(zhuǎn)化率為95. 21%，取上清液利 用氣相色譜法測定其轉(zhuǎn)化率為96. 56%，誤差〈5%。
[0019] 實施例4:底物廣泛性分析 利用磷酸緩沖溶液（pH 7. 0, lOOmmol/L)配制A cWi CCZU-K14靜息細(xì)胞懸浮液（5%， 質(zhì)量濃度）于24孔板中，分別加入4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、4, 4, 4-三氟乙酰乙 酸乙酯、4-氯苯甲酰乙酸乙酯、2-甲基苯甲酰乙酸乙酯，使用底物終濃度為500 mmol/L， 輔底物葡萄糖終濃度為750 mmol/L，NAD+的終濃度為為50 μmol/L，進(jìn)一步混合均勻后， 于30°C、160 r/min的條件下進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化反應(yīng)I h，反應(yīng)結(jié)束后用等體積乙酸乙酯萃取， 進(jìn)一步在24孔板中進(jìn)行顯色，萃取液：顯色劑A (Fe (ClO4)3溶液；0. 07 mol/L):顯色劑B (HC104；0.1 mol/L) =20:800:800 (yL: yL: μ L)，在 20°C 下振蕩反應(yīng) 30 min，顯色反應(yīng) 液利用9倍體積的無水乙醇混勻后，測其在510 nm波長下的紫外吸收值，與氣相色譜法對 照。其結(jié)果如表1。
[0020] 實施例5:利用顯色法測定CCZU-K14靜息細(xì)胞還原4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE)反 應(yīng)進(jìn)程 利用磷酸緩沖溶液（pH 7.0,100 mmol/L)配制CCZU-K14靜息細(xì)胞懸浮液（5%，質(zhì)量濃 度)于24孔板中，加入終濃度為500 mmol/L的底物4-氯乙酰乙酸乙酯（C0BE)、750 mmol/L 的葡萄糖和50以111〇1/1的嫩0+，混合均勾后在30<€、16〇17/1]1；[11的條件下進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化反 應(yīng)。反應(yīng)不同的時間，分別取一定體積的反應(yīng)液，并利用等體積乙酸乙酯溶液萃取。進(jìn)一步 在24孔板中進(jìn)行顯色，萃取液：顯色劑A (Fe2 (SO4)3溶液；0. 07 mol/L):顯色劑B (H2SO4; 0.3mol/L)=20:800:800 (yL: yL: yL)，在 20°C 下振蕩反應(yīng) 30min，顯色反應(yīng)液利用 9 倍體積的無水乙醇混勻后，測其在510 nm波長下的紫外吸收值，其結(jié)果如圖1所示。
[0021] 表1分析不同底物轉(zhuǎn)化效果
【主權(quán)項】
1?重組還原酶菌株A cWi CCZU-K14,保藏號為CGMCC No. 9298。2. -種(6-羰基羧酸酯還原酶的的高通量篩選方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行： (1) 稱取重組A cWi CCZU-K14靜息細(xì)胞(濕重）懸浮于磷酸緩沖溶液體系（pH 7. 0， 100 mmol/L)形成10% (質(zhì)量濃度）的細(xì)胞懸液，加入終濃度為500-3000 mmol/L的底物 0 -羰基羧酸酯、750-4500 mmol/L的葡萄糖和50 y mol/L的NAD+混合均勻后在30°C、160 r/min的條件下進(jìn)行還原轉(zhuǎn)化反應(yīng)； (2) 反應(yīng)結(jié)束，加入等體積乙酸乙酯萃取，顯色是在24孔板中進(jìn)行的； 萃取液：顯色劑 A (0.04 ~ 0.08 mol/L):顯色劑 B (0.1 ~ 0.3 mol/L) =20:800:800 (體積比)，在20~35 °C下顯色反應(yīng)15~30 min后取顯色反應(yīng)液至另一 24孔板中，加入9倍 體積的無水乙醇混合均勻，用紫外-可見分光光度計測其在510 nm波長下進(jìn)行分析。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種0 -羰基羧酸酯還原酶的的高通量篩選方法，其特征在 于顯色劑 A 為 FeCl3、FeCl2、Fe2 (SO4) 3、FeS04、Fe (ClO4) 3、CoCl2S ZnCl 2中的一種。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種0 -羰基羧酸酯還原酶的的高通量篩選方法，其特征在 于顯色劑B為HCl或HClO4中的一種。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種0 -羰基羧酸酯還原酶的的高通量篩選方法，其特征在 于顯色劑B為H2SO4中的一種。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種β-羰基羧酸酯還原酶的篩選方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。提供了一種利用β-羰基羧酸酯類化合物與金屬離子顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)，并在24孔板中建立了β-羰基羧酸酯（例如，脂肪族和芳香族β-羰基羧酸酯）還原酶的高通量篩選方法。該方法具有操作簡單、快速、準(zhǔn)確和通量高等特點。CGMCC No.929820140613
【IPC分類】C12R1/19, C12Q1/26, C12N1/21
【公開號】CN105018399
【申請?zhí)枴緾N201410493856
【發(fā)明人】何玉財, 張丹平, 陶志成, 陸云, 楊振興, 方月, 孔維國, 陳祎桐, 郭飛, 陳欣未
【申請人】常州大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2014年9月25日