從忽地笑鱗莖中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物防治細(xì)菌領(lǐng)域，具體來說，涉及一種從忽地笑鱗莖中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]生活于健康植物組織和器官的細(xì)胞間隙或細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌稱為內(nèi)生細(xì)菌，其中有些是病原菌的拮抗微生物。作為植物微生態(tài)系統(tǒng)的組成成員，某些內(nèi)生細(xì)菌可通過產(chǎn)生抗生素、水解酶類等抗菌活性物質(zhì)抑制病原菌。利用微生物防治植物真菌病害具有對環(huán)境無污染、對人畜無害、減緩病原菌耐藥性的優(yōu)點(diǎn)。研究人員已從水稻、棉花、番茄等植物中分離到拮抗細(xì)菌，其中有些己經(jīng)進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用階段，并產(chǎn)生了一定的社會和環(huán)境效益。
[0003]水稻稻痕病是由稻痕病菌(Magnaportheoryzae)引起的病害，廣泛分布于水稻各產(chǎn)區(qū)。全球因稻瘟病引起的水稻減產(chǎn)現(xiàn)象大幅增加，稻瘟病發(fā)病可造成水稻減產(chǎn)10%到30%，嚴(yán)重時可導(dǎo)致顆粒無收。采用抗病品種和化學(xué)殺菌劑仍是當(dāng)前防治稻瘟病的主要方法，但是，存在的問題是抗稻瘟病水稻品種較單一、稻瘟病菌各生理小種較復(fù)雜且具有一定的變異性，而化學(xué)農(nóng)藥有一定的毒性，污染環(huán)境，且長期使用化學(xué)農(nóng)藥病原菌會產(chǎn)生抗藥性。這些問題使水稻稻瘟病的防治受到一定限制，成為制約農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙。
[0004]忽地笑是石蒜科石蒜屬的多年生草本植物，富含多種生物堿，具有較高的藥用和生防應(yīng)用價(jià)值，在石蒜屬植物中尋找對環(huán)境友好、無毒害的生防微生物，作為化學(xué)農(nóng)藥的理想替代品是防治水稻稻瘟病等真菌病害的新途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0005]本發(fā)明的目的是提供一種從忽地笑鱗莖中分離篩選拮抗細(xì)菌的方法，包括以下步驟:
(1)采集忽地笑鱗莖，自來水沖洗，切塊，備用；
(2)用NaClO浸泡，然后用無菌水反復(fù)沖洗4次；
(3)將消毒后的單鱗片用刀片切成Icm2大小的小方塊，放置在LB固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48h，長出的菌體轉(zhuǎn)接至相同的培養(yǎng)基上劃線純化，直至純化到單菌落，將純化后所得的單菌落接至LB培養(yǎng)基斜面上保存；
(4)將斜面保存的菌株接入LB液體培養(yǎng)基30°C震蕩培養(yǎng)，活化后與供試病原真菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)；
(5)通過觀察有無抑菌圈，挑選出可拮抗病原真菌的內(nèi)生細(xì)菌。
[0006]在一個具體的實(shí)施方式中，步驟(I)為取生長狀況良好的忽地笑鱗莖，自來水沖洗，剝?nèi)ズ诤稚鈱?，切除根部，留取鱗莖中部(約1/3)，并將其切成4塊。
[0007]在一個具體的實(shí)施方式中，步驟(2)為將切好的鱗莖放入三角瓶中，用NaClO浸泡15min，在浸泡的過程中不斷輕輕攪動鱗莖塊，然后用無菌水反復(fù)沖洗4次，晾干，備用。
[0008]在一個具體的實(shí)施方式中，步驟(3)為將表面消毒后的鱗莖切成Icm2的鱗莖小塊，用滅過菌的鑷子將切好的鱗莖小塊貼放到LB固體培養(yǎng)基上，每皿均勻擺放4塊，放入培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)48h后將長出的菌落轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行劃線純化，30°C培養(yǎng)48h，將純化后所得的單菌落接至相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上，4°C冰箱保存。
[0009]在一個具體的實(shí)施方式中，步驟(4)為將保存于斜面試管中的細(xì)菌菌株轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)。用無菌打孔器打取直徑為6mm的供試菌水稻稻瘟病菌菌餅，置于直徑為90mm的PDA平板中央，培養(yǎng)2-3d后，在圍繞菌餅十字交叉的四個角落的分別接種經(jīng)過純化的內(nèi)生細(xì)菌菌株，進(jìn)行對峙培養(yǎng)，于28°C培養(yǎng)5-6d，以只接病原菌，不接分離菌株為對照。
[0010]在一個具體的實(shí)施方式中，PDA培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g/L，葡萄糖或蔗糖10g/L，瓊脂15g/L。
[0011]在一個具體的實(shí)施方式中，LB培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl1g/1^，瓊脂158/1。
[0012]本發(fā)明的拮抗細(xì)菌分離篩選方法具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明方法很容易得到新的拮抗細(xì)菌菌株，分離到的菌株HDXY是從忽地笑鱗莖中篩選獲得的，其對稻瘟病菌具有十分明顯的拮抗作用；菌株HDXY生長周期短，環(huán)境要求低，有利于擴(kuò)大培養(yǎng)，為水稻稻瘟病生物防治提供基礎(chǔ)準(zhǔn)備。
【附圖說明】
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[0013]圖1為拮抗細(xì)菌HDXY與供試稻瘟病菌的對峙圖。
[0014]圖2為拮抗細(xì)菌的菌落形態(tài)。
【具體實(shí)施方式】
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[0015]以下作為實(shí)施例對本發(fā)明的方法進(jìn)一步說明，將有助于對本發(fā)明的進(jìn)一步的理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不受這些實(shí)施例的限定，其保護(hù)范圍由權(quán)利要求書決定。
[0016]實(shí)施例1
[0017]從忽地笑鱗莖中分離篩選鑒定拮抗細(xì)菌的方法具體包含下列步驟:
I采集不同地區(qū)忽地笑，放入塑料袋保存中并記錄
2材料表面消毒與拮抗細(xì)菌分離 2.1鱗莖處理
取生長狀況良好的鱗莖，自來水沖洗，剝?nèi)ズ诤稚鈱?，切除根部，切留鱗莖中部(約I/3)，并將其切成4塊，備用。
2.2表面消毒
將切好的鱗莖放入三角瓶中，用NaC 1浸泡15mi η，在浸泡的過程中不斷輕輕攪動鱗莖塊，然后用無菌水反復(fù)沖洗4次，晾干，備用。
2.3細(xì)菌分離培養(yǎng)
將表面消毒后的鱗莖切成Icm2的鱗莖小塊，用滅過菌的鑷子將切好的鱗莖小塊貼放到LB固體培養(yǎng)基上，每皿均勻擺放4塊，放入培養(yǎng)箱中，30°C培養(yǎng)，48h后將長出的菌落轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行劃線純化，30°C培養(yǎng)48h，將純化后所得的單菌落接至相應(yīng)培養(yǎng)基斜面上，4°C冰箱保存。 3拮抗細(xì)菌的篩選
將放置于4°C冰箱中的斜面試管取出，轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，30°C震蕩培養(yǎng)。用無菌打孔器打取直徑為6mm的供試水稻稻瘟病菌菌餅，置于直徑為90mm的TOA平板中央，培養(yǎng)2-3d后，在圍繞菌餅十字交叉的四個角落的分別接種活化后的內(nèi)生細(xì)菌菌株，進(jìn)行對峙培養(yǎng)，28°C培養(yǎng)5-6d。以只接病原菌，不接分離菌株為對照，觀察所分離的細(xì)菌菌株對供試水稻稻瘟病菌的抑菌作用。
4抑菌譜檢測
從圖1中可以看出，篩選到的拮抗細(xì)菌HDXY與稻瘟病菌多個生理小種對峙培養(yǎng)均可見明顯的抑菌現(xiàn)象。另外，措抗細(xì)菌HDXY對小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、煙曲霉(Aspergillus funigatus)和白色念珠菌(Candida Albicans)也有抑制作用。
5形態(tài)學(xué)特征
將待鑒定拮抗細(xì)菌在LB平板上劃線，30°C培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)并記錄。HDXY菌落呈圓形、淡黃色、表面光滑、邊緣整齊、不透明(圖2)。
挑取LB平板上30°C培養(yǎng)48h的待鑒定拮抗菌進(jìn)行革蘭氏染色，1000倍光鏡顯微觀察其菌體，并記錄觀察結(jié)果。菌株HDXY革蘭氏染色為陰性，顯微鏡下菌體呈直或微彎曲桿狀，具1-3根鞭毛。
516S rDNA基因擴(kuò)增及序列分析
提取菌株基因組DNA作為模板，采用細(xì)菌通用引物PCR擴(kuò)增其16S rDNA片段。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR產(chǎn)物回收純化，送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。
PCR所用引物為:16S-27: 5 ’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；16 S-1492:5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’
PCR反應(yīng)體系(25yL):稀釋DNA模板lyL;dNTP 2yL;引物 16S_271yL;引物 16S_14921yL;10XPCR Buffer 2.5yL；Taq DNA聚合酶0.2yL;滅菌超純水補(bǔ)足至25yL。
PCR 反應(yīng)條件:94°C5min ； 94°C30s，52°C30s，72°Clmin，30 個循環(huán)；72°C 1min，4°C 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后測序。
[0018]根據(jù)菌株形態(tài)及培養(yǎng)特征和16SrDNA基因序列分析，將菌株HDXY鑒定為唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia glad1li)。
[0019]伯克霍爾德氏菌作為多種病原菌的拮抗菌，是一類重要的生防菌。利用生防菌制備微生物制劑來防治病害可以大幅度的減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境帶來的污染，同時達(dá)到控制病害發(fā)生的目的。分離出拮抗菌是制備微生物制劑的前提，也為更好的開展真菌病害的生物防治做出了準(zhǔn)備。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種從忽地笑鱗莖中分離篩選拮細(xì)菌的方法，包括以下步驟: (I)取生長狀況良好的忽地笑鱗莖，自來水沖洗，剝?nèi)ズ诤稚鈱樱谐?，切留鱗莖中部(約1/3)，并將其切成4塊； (2 )用NaCl O浸泡，然后用無菌水反復(fù)沖洗4次； (3)將消毒后的單鱗片用刀片切成Icm大小的小方塊，將切好的鱗莖放在LB固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48h后將長出的菌體轉(zhuǎn)接至相同的培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)48h后劃線純化，直至純化到單菌落，將純化后所得的單菌落接至LB培養(yǎng)基斜面上保存； (4)將斜面保存的菌株接入LB液體培養(yǎng)基30°C震蕩培養(yǎng)，活化后與供試稻瘟病菌在I3DA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行對峙培養(yǎng)； (5)通過觀察有無抑菌圈，挑選出現(xiàn)抑菌圈的可拮抗稻瘟病菌的內(nèi)生細(xì)菌。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述LB液體培養(yǎng)基配方為:胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L和NaCl 10g/L，調(diào)整pH為7，在上述配方中加入15 g/L的瓊脂即為LB固體培養(yǎng)基;PDA固體培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯200 g/L，葡萄糖或蔗糖10 g/L，瓊脂15 g/L ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述步驟(4)的對峙培養(yǎng)為:將供試稻瘟病菌用無菌打孔器打取直徑為6_的菌餅，置于直徑為90mm的PDA固體培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)2_3 d后，再在稻瘟病菌菌餅十字交叉的角落分別接種4株分離到的內(nèi)生細(xì)菌。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從忽地笑鱗莖中分離篩選拮抗內(nèi)生細(xì)菌的方法，該方法通過內(nèi)生菌分離方法從忽地笑鱗莖中分離得到內(nèi)生細(xì)菌，采用改進(jìn)的對峙培養(yǎng)方法，將供試稻瘟病菌點(diǎn)在平板中央，培養(yǎng)2-3天，再在圍繞稻瘟病菌十字交叉的四個角落分別接種4個細(xì)菌菌株，培養(yǎng)5-6天，觀察有抑菌效果的即為篩選獲得的拮抗細(xì)菌。獲得一株對水稻稻瘟病菌有明顯抑制作用的拮抗細(xì)菌，抑菌譜實(shí)驗(yàn)證明其對小麥赤霉病菌、煙曲霉和白色念珠菌也有抑制作用。本發(fā)明能顯著提高篩選效率，所分離到的拮抗細(xì)菌可作生防菌，制成微生物制劑，為病害生物防治提供基礎(chǔ)。
【IPC分類】C12N1/02, C12N1/20, C12R1/01
【公開號】CN105524871
【申請?zhí)枴緾N201610064924
【發(fā)明人】李曉丹, 汪仁, 夏冰, 程麗
【申請人】江蘇省中國科學(xué)院植物研究所
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年1月29日