一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ace抑制肽的方法
【專利摘要】一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白質(zhì)制備ACE抑制肽的方法，以魔芋蛋白質(zhì)為原料，利用菠蘿蛋白酶進行酶解，在一定酶解條件下酶解一段時間，經(jīng)過滅酶、冷卻、調(diào)節(jié)pH值、離心得到酶解液，酶解液通過超濾、SephadexG?25凝膠層析、RT?HPLC分離純化后，得到高純度ACE抑制肽液，經(jīng)冷凍干燥得到魔芋ACE抑制肽粉末。本發(fā)明對實現(xiàn)魔芋飛粉有效利用，生產(chǎn)其高附加值產(chǎn)品具有重要意義。
【專利說明】
-種薇蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制化的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于ACE抑制膚制備領(lǐng)域，具體設(shè)及一種渡蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE 抑制膚的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 全國年產(chǎn)魔芋飛粉1500~2000噸。魔芋飛粉含蛋白質(zhì)20%左右，目前對魔芋的利 用主要集中于魔芋精粉(葡甘聚糖），而魔芋飛粉大多W低價作為飼料或干燥劑出售，利用 價值低。
[0003] 高血壓是一種W動脈血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)的慢性疾病，常引起屯、、腦、腎等重 要器官的病變并出現(xiàn)相應(yīng)的后果。高血壓患者一般需要長期服用降血壓藥物，運可能會導(dǎo) 致出現(xiàn)咳嗽、腎功能減退、蛋白尿、肝功能異常、血管神經(jīng)性水腫等不良反應(yīng)。因此天然、有 效、無副作用、可長期服用的ACE抑制膚成為高血壓藥物方面研究的熱點。
[0004] 自1965年首次發(fā)現(xiàn)ACE抑制膚W來，國內(nèi)外研究人員已從不同來源的蛋白質(zhì)中制 備出各種具有血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的膚類物質(zhì)。ACE抑制膚是指血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 抑制劑。ACE抑制膚對ACE活性區(qū)域結(jié)合能力較強，共同特點是與ACE活性部位的鋒離子結(jié)合 的能力比AngI或緩激膚更強，而且結(jié)合之后不易從ACE結(jié)合區(qū)域釋放，從而阻礙ACE催化 AngI水解成Angn W及催化舒緩激膚水解成為失活片段的兩個過程，起到降血壓的作用。
[0005] 因此，利用魔芋飛粉生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，一方面拓寬了ACE抑制膚的來源，另一方 面更好的開發(fā)利用魔芋飛粉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種渡蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制膚的方法，該 方法通過對魔芋飛粉進行處理，能夠得到ACE抑制膚，提高了魔芋飛粉的附加值。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)：
[000引一種渡蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制膚的方法，包括W下步驟：
[0009] (1)將魔芋蛋白溶液pH值調(diào)節(jié)為4~9后，加入渡蘿蛋白酶進行酶解反應(yīng)，得到酶解 液；
[0010] (2)將酶解液滅酶后調(diào)節(jié)pH值至魔芋蛋白等電點，然后離屯、，收集上清液，上清液 為ACE抑制膚。
[0011] 所述步驟(1)中魔芋蛋白溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~5%。
[0012] 每克魔芋蛋白溶液中加入的渡蘿蛋白酶的量為3000~5000U。
[001引所述步驟（1 )pH值是采用1. OmoL/L NaOH溶液調(diào)節(jié)的。
[0014] 所述步驟(1)酶解溫度為40~70°C，酶解時間為1~化。
[0015] 所述步驟(2)中滅酶具體是在IOCTC下保溫至少lOmin。
[0016] 所述步驟(2)中離屯、的轉(zhuǎn)速為9000~lOOOOr/min，時間為10~20min。
[0017] 將步驟（2)中上清液經(jīng)過超濾、Sephadex G-25凝膠層析、RT-HPLC分離，再經(jīng)冷凍 干燥，得到魔芋ACE抑制膚粉末。
[0018] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果：
[0019] 本發(fā)明W魔芋飛粉為原料，先調(diào)節(jié)魔芋蛋白溶液pH值后與渡蘿蛋白酶進行酶解反 應(yīng)，再經(jīng)過滅酶后調(diào)節(jié)pH值至魔芋蛋白等電點，即可得到ACE抑制膚，并且本發(fā)明得到的ACE 抑制膚的抑制率高達70% W上，說明制備得到了ACE抑制膚，并且活性較高，本發(fā)明利用魔 芋飛粉制備了 ACE抑制膚，一方面拓寬了魔芋飛粉的開發(fā)利用領(lǐng)域，另一方便也拓寬了 ACE 抑制膚的來源;本發(fā)明制備方法簡單，利于大量生產(chǎn)，并且成本低。本發(fā)明對實現(xiàn)魔芋飛粉 有效利用，生產(chǎn)其高附加值產(chǎn)品具有重要意義。
[0020] 進一步的，本發(fā)明將得到的酶解液在IOCTC條件下，保溫至少lOmin，充分使其中的 蛋白酶滅活。
[0021] 進一步的，本發(fā)明將上清液經(jīng)過超濾、Sephadex G-25凝膠層析、RT-HPLC分離，再 經(jīng)冷凍干燥，能夠得到純度較高的魔芋ACE抑制膚粉末。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明進一步闡述，但不限于此。
[0023] 本發(fā)明中的酶解工藝：
[0024] 利用渡蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白質(zhì)制備ACE抑制膚的方法，將魔芋蛋白溶解于純凈 水中，配置成蛋白溶液;蛋白液置于恒溫磁力攬拌器上加熱；調(diào)節(jié)pH，加入渡蘿蛋白酶混合 均勻，在恒溫磁力攬拌器進行酶解反應(yīng)的酶解條件為:pH4.0~8.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)1~5%， 加酶量3000~5000U/g，酶解時間1~化，酶解溫度40~70°C ;將酶解液置于100°C恒溫水浴 鍋中滅酶至少lOmin，待酶解液溫度降至室溫，調(diào)節(jié)其抑為魔芋蛋白等電點；9000~1000化/ min離屯、10~20min，收集上清液。
[00巧]將上清液液經(jīng)過超濾、Sephadex G-25凝膠層析、RT-HPLC得到高純度ACE抑制膚 液，經(jīng)冷凍干燥得到魔芋ACE抑制膚粉末。
[0026] 本發(fā)明采用如下方法測定ACE的抑制率：
[0027] 利用Cushman檢測法進行檢測：取75uL、皿L(馬尿酷-組氨酷-亮氨酸）與25uL、ACE 抑制劑(多膚液)充分混勻。在37°C水浴鍋中溫育5min，加入25uL、25mu/mL ACE棚酸鹽溶液， 在37°C水浴鍋中反應(yīng)40min。結(jié)束后加入200uL、1.0moL/L鹽酸溶液破壞反應(yīng)環(huán)境，終止反應(yīng) 進程。然后于各試管中加入乙酸乙醋1.7血，混合后離屯、4000r/min離屯、IOmin;吸取1.2血乙 酸乙醋層于另一試管中，放入l〇〇°C烘箱中，揮發(fā)溶劑40min。拿出冷卻后加入去離子水3血， 混勻后在波長228nm下測定其吸光度，計算公式為：
[002引
[0029] 式中:Al-ACE抑制膚和ACE都存在溶液的吸光度值
[0030] A2-不加 ACE抑制膚存在溶液的吸光度值 [0031 ] A3-ACE與HHL存在空白溶液的吸光度值
[0032] 實施例1
[0033] (1)將魔芋蛋白溶解于純凈水中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的魔芋蛋白溶液；
[0034] (2)用1. OmoL/L化0田容液調(diào)節(jié)抑值后，加入渡蘿白酶混合均勻，在恒溫磁力攬拌 器上進行酶解反應(yīng)，得到酶解液;其中，酶解條件為:抑值為4.0,底物（即魔芋蛋白溶液)質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為1 %，加酶量為3000U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入渡蘿白酶的量為3000U)，酶 解時間為化，酶解溫度為40°C;
[0035] (3)將酶解液置于100°C恒溫水浴鍋中滅酶lOmin;
[0036] (4)待酶解液溫度降至室溫，調(diào)節(jié)其抑值至魔芋蛋白等電點，然后在9000r/min下 離屯、IOmin，收集上清液。測其ACE抑制率>30%。說明得到了ACE抑制膚，并且具有活性。
[0037] (5)將上清液經(jīng)過超濾、S巧hadex G-25凝膠層析、RT-HPLC，得到高純度ACE抑制膚 液，經(jīng)冷凍干燥得到魔芋ACE抑制膚粉末。
[003引實施例2
[0039] (1)將魔芋蛋白溶解于純凈水中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的魔芋蛋白溶液；
[0040] (2)用1. OmoL/L化O田容液調(diào)節(jié)抑值后，加入渡蘿白酶混合均勻，在恒溫磁力攬拌 器進行酶解反應(yīng)，得到酶解液;其中，酶解條件為:抑值為5.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %，加酶量 為3500U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入渡蘿白酶的量為3500U)，酶解時間為化，酶解溫 度為50°C;
[0041] (3)將酶解液置于100°C恒溫水浴鍋中滅酶15min;
[0042] (4)待酶解液溫度降至室溫，調(diào)節(jié)其抑值至魔芋蛋白等電點，然后在9500r/min下 離屯、15min，收集上清液。測其ACE抑制率巧0%。
[0043] (5)將上清液經(jīng)過超濾、S巧hadex G-25凝膠層析、RT-HPLC，得到高純度ACE抑制膚 液，經(jīng)冷凍干燥得到魔芋ACE抑制膚粉末。
[0044] 實施例3
[0045] (1)將魔芋蛋白溶解于純凈水中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的魔芋蛋白溶液；
[0046] (2)用1. OmoL/L化0田容液調(diào)節(jié)抑值后，加入渡蘿白酶混合均勻，在恒溫磁力攬拌 器進行酶解反應(yīng)，得到酶解液;其中，酶解條件為:抑值為6.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3 %，加酶量 為4000U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入渡蘿白酶的量為4000U)，酶解時間為化，酶解溫 度為55°C;
[0047] (3)將酶解液置于100°C恒溫水浴鍋中滅酶lOmin;
[004引（4)待酶解液溫度降至室溫，調(diào)節(jié)其抑值至魔芋蛋白等電點，然后在100(K)r/min下 離屯、20min，收集上清液。測其ACE抑制率>70%。
[0049] (5)將上清液經(jīng)過超濾、S巧hadex G-25凝膠層析、RT-HPLC，得到高純度ACE抑制膚 液，經(jīng)冷凍干燥得到魔芋ACE抑制膚粉末。
[00加 ]實施例4
[0051] (1)將魔芋蛋白溶解于純凈水中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的魔芋蛋白溶液；
[0052] (2)用1. OmoL/L化0田容液調(diào)節(jié)抑值后，加入渡蘿白酶混合均勻，在恒溫磁力攬拌 器進行酶解反應(yīng)，得到酶解液;其中，酶解條件為:抑值為7.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 %，加酶量 為4500U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入渡蘿白酶的量為4500U)，酶解時間為4h，酶解溫 度為60°C;
[0053] (3)將酶解液置于100°C恒溫水浴鍋中滅酶20min;
[0054] (4)待酶解液溫度降至室溫，調(diào)節(jié)其抑至魔芋蛋白等電點，然后在9500r/min離屯、 15min，收集上清液。測其ACE抑制率>60%。
[005日](5)將上清液經(jīng)過超濾、Sephadex G-25凝膠層析、RT-HPLC得到高純度ACE抑制膚 液，經(jīng)冷凍干燥得到魔芋ACE抑制膚粉末。
[0056] 實施例5
[0057] (1)將魔芋蛋白溶解于純凈水中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的魔芋蛋白溶液；
[005引（2)用1. OmoL/L化0田容液調(diào)節(jié)抑值后，加入渡蘿白酶混合均勻，在恒溫磁力攬拌 器進行酶解反應(yīng)，得到酶解液;其中，酶解條件為:抑值為8.0，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 %，加酶量 為5000U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入渡蘿白酶的量為5000U)，酶解時間為化，酶解溫 度為70°C;
[0059] (3)將酶解液置于100°C恒溫水浴鍋中滅酶20min;
[0060] (4)待酶解液溫度降至室溫，調(diào)節(jié)其抑值至魔芋蛋白等電點，然后在9000r/min下 離屯、lOmin，收集上清液。測其ACE抑制率>40%。
[0061 ] (5)將上清液經(jīng)過超濾、S巧hadex G-25凝膠層析、RT-HPLC，得到高純度ACE抑制膚 液，經(jīng)冷凍干燥得到魔芋ACE抑制膚粉末。
[0062] 實施例6
[0063] (1)將魔芋蛋白溶解于純凈水中，配置成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的魔芋蛋白溶液；
[0064] (2)用1. OmoL/L化0田容液調(diào)節(jié)抑值后，加入渡蘿白酶混合均勻，在恒溫磁力攬拌 器上進行酶解反應(yīng)，得到酶解液;其中，酶解條件為:抑值為9.0,底物（即魔芋蛋白溶液)質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為1 %，加酶量為3000U/g(即在每克魔芋蛋白溶液中加入渡蘿白酶的量為3000U)，酶 解時間為地，酶解溫度為55 °C;
[0065] (3)將酶解液置于100°C恒溫水浴鍋中滅酶lOmin;
[0066] (4)待酶解液溫度降至室溫，調(diào)節(jié)其抑值至魔芋蛋白等電點，然后在9000r/min下 離屯、IOmin，收集上清液。
[0067] (5)將上清液經(jīng)過超濾、S巧hadex G-25凝膠層析、RT-HPLC，得到高純度ACE抑制膚 液，經(jīng)冷凍干燥得到魔芋ACE抑制膚粉末。
【主權(quán)項】
1. 一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將魔芋蛋白溶液pH值調(diào)節(jié)為4~9后，加入菠蘿蛋白酶進行酶解反應(yīng)，得到酶解液； (2) 將酶解液滅酶后調(diào)節(jié)pH值至魔芋蛋白等電點，然后離心，收集上清液，上清液為ACE 抑制肽。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征 在于，所述步驟(1)中魔芋蛋白溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~5%。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征 在于，每克魔芋蛋白溶液中加入的菠蘿蛋白酶的量為3000~5000U。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征 在于，所述步驟（1 )pH值是采用1. OmoL/L NaOH溶液調(diào)節(jié)的。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征 在于，所述步驟(1)酶解溫度為40~70°C，酶解時間為1~6h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征 在于，所述步驟(2)中滅酶具體是在100°C下保溫至少lOmin。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征 在于，所述步驟(2)中離心的轉(zhuǎn)速為9000~10000r/min，時間為10~20min。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種菠蘿蛋白酶酶解魔芋蛋白制備ACE抑制肽的方法，其特征 在于，將步驟（2)中上清液經(jīng)過超濾、Sephadex G-25凝膠層析、RT-HPLC分離，再經(jīng)冷凍干 燥，得到魔芋ACE抑制肽粉末。
【文檔編號】C12P21/06GK105838765SQ201610311391
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月11日
【發(fā)明人】毛跟年, 周亞麗, 賀磊, 曹晴, 許牡丹
【申請人】陜西科技大學(xué)