一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫及其制備方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。單域抗體酵母cDNA文庫包含羊痘弱毒苗免疫駱駝的抗原劑量、免疫程序和血清抗體效價(jià)；其制備方法包括：駱駝淋巴細(xì)胞分離、總RNA提取及mRNA分離、純化；CDSⅢ和SMART引物逆轉(zhuǎn)錄合成全長cDNA；設(shè)計(jì)兩套擴(kuò)增引物，采用同源重組的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGADT7共轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞Y187；構(gòu)建駱駝抗羊痘病毒的VHH基因cDNA文庫；計(jì)算文庫庫容量；擴(kuò)增cDNA文庫進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)等步驟。本發(fā)明提供了一種具備相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好、抗原結(jié)合性能好、易表達(dá)等優(yōu)勢的抗羊痘病毒的雙峰駝VHH重鏈單域抗體酵母cDNA文庫及其制備方法。
【專利說明】
一種抗羊痘病毒雙峰^VHH重鏈單域抗體cDNA文庫及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫及其制備方法，屬 于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊痘(Capripox)是由羊痘病毒（Capripoxvirus，CPV)引起可以感染山羊、綿羊及 瘡皮膚病(Lumpy skin disease)的一種急性、熱性、接觸性傳染病。羊痘是所有動(dòng)物痘病中 最為嚴(yán)重的一種，因其與羊傳染性膿皰(俗稱羊口瘡)存在臨床癥狀上的相似性、血清學(xué)反 應(yīng)的交叉性，以及內(nèi)臟型羊痘的頻發(fā)給該病的確診造成更大的困難。單域抗體(VHH)是目前 可以獲得具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、功能完整、可結(jié)合抗原的最小結(jié)構(gòu)單元，由于其免疫原性低、易表 達(dá)、親和力高、耐熱等特點(diǎn)成為當(dāng)前分子影像研究的重要靶標(biāo)分子。要建立羊痘早期快速診 斷技術(shù)，明確羊痘病毒的致病機(jī)理，需從病毒的功能性抗體入手，通過病毒新型納米VHH抗 體文庫來篩選病毒功能抗體是解決該問題的關(guān)鍵，而構(gòu)建VHH cDNA文庫是解決該問題的基 礎(chǔ)。
[0003] VHH單域抗體可特異識(shí)別病毒和其它致病微生物的特殊結(jié)構(gòu)蛋白，協(xié)助宿主抗感 染免疫防御已得到廣泛應(yīng)用。有研究者將該單域抗體與乳酸桿菌表面蛋白融合，可表達(dá)于 乳酸桿菌表面，以此喂食小鼠可顯著降低由輪狀病毒引起的痢疾發(fā)病率。由于多數(shù)寄生蟲 可通過蟲體表面覆蓋的各類糖蛋白逃脫宿主免疫防御，單域抗體也可用于寄生蟲感染的診 斷和治療小分子特異單域抗體偶聯(lián)熒光染料后，可識(shí)別寄生蟲表面糖蛋白并滲透進(jìn)入蟲 體，以此檢測血液中的寄生蟲感染，若偶聯(lián)β內(nèi)酰胺酶則可將頭孢菌素等前藥轉(zhuǎn)化為毒性藥 物殺死寄生蟲。Kim等研究表明，將超順磁性氧化鐵納米顆粒（SPIONs)和ScFv組成abf-SPIONs，對治療癌胚抗原（CEA)具有潛在作用。Shanta等指出，應(yīng)用針對淀粉樣前體蛋白 (APP)的ScFv抑制阿爾茨海默氏病細(xì)胞β-分泌酶的活性，解決了 mAb在治療過程中的困難。 Hultberg A等通過9個(gè)甘氨酸絲氨酸殘基連接的呼吸道合胞體病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV)雙特異性納米抗體RSV-D3/E4(9GS)微量中和RSV病毒的能力是RSV-E4/D3(9GS)的 17 倍，IC50 為 6nmol/L。
[0004] 抗體庫的容量和多樣性很大程度上影響從中淘選出特異性抗體的概率以及抗體 的親和力。自1976年構(gòu)建的第一個(gè)cDNA文庫以來，其方法不斷的改進(jìn)，其中SMART (switching mechanism at 5'end of the RNA transcript)方法構(gòu)建的cDNA文庫能夠代 表原有樣品中mRNA的豐度，保存了生物遺傳信息的完整性。而且該方法只需要少至25ng的 mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA庫，更重要的是得到的cDNA能 夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接擴(kuò)增基因、構(gòu)建cDNA文庫、已知序列釣全 長cDNA(RACE)，和用于芯片檢測的cDNA探針的擴(kuò)增等。同時(shí)酵母雙雜交技術(shù)能夠從構(gòu)建的 宿主細(xì)胞cDNA文庫中篩選出與已知目的蛋白相互作用的蛋白，因此構(gòu)建酵母文庫顯得尤為 重要。
[0005] 綜上所述，構(gòu)建抗羊痘病毒酵母cDNA抗體文庫，篩選具有羊痘病毒型特異性、生物 學(xué)活性好、結(jié)合抗原能力強(qiáng)、具有潛在中和功能的抗體，尤其單域抗體之類的新型抗體，對 于建立敏感的羊痘病毒的臨床診斷方法，研究病毒的感染機(jī)理具有極其重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫及其制備 方法，提供一種具備相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好、抗原結(jié)合性能好、易表達(dá)等優(yōu)勢 的抗羊痘病毒的雙峰駝VHH重鏈單域抗體酵母cDNA文庫及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術(shù)手段解決上述技術(shù)問題：
[0008] 本發(fā)明的一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫及其制備方法，一種 抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫，其包括羊痘弱毒苗免疫駱駝的抗原劑量、免 疫程序和血清抗體效價(jià)。
[0009] -種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫，所述山羊痘弱毒苗免疫駱駝 劑量為:首免6頭份、二免12頭份、三免8頭份、四免8頭份;所述免疫程序?yàn)?卡介苗致敏1周 后，山羊痘弱毒疫苗首免、第15天二免、第30天三免、第60天四免;所述血清抗體效價(jià)為:空 白 0D45。= 0 · 049、陰性對照0D45。= 0 · 054、陽性對照0D45。= 2 · 250、四免后血清 0D45。= 3 · 055。 [0010] 一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫的制備方法，其包括以下步驟：
[0011] (1)駱駝淋巴細(xì)胞分離、總RNA提取及mRNA分離、純化；
[0012 ](2) CDSm和SMART引物逆轉(zhuǎn)錄合成全長cDNA;
[0013] (3)設(shè)計(jì)兩套擴(kuò)增引物，采用同源重組的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGADT7共轉(zhuǎn)染酵母細(xì) 胞Y187;
[0014] (4)構(gòu)建駱駝抗羊口瘡病毒的VHH基因 cDNA文庫；
[0015] (5)計(jì)算文庫庫容量；
[0016] (6)擴(kuò)增cDNA文庫進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。
[0017] 所述步驟（1)中分離淋巴細(xì)胞中Total RNA濃度為4329ng/ul，純度0D260/0D280為 1.98〇
[0018]所述步驟(3)中第一輪擴(kuò)增引物為：
[0019] SEQ ID NO.1:5 '-GTCCTGGCTGCTTCTACAAGG-3'，
[0020] SEQ ID NO·2:5 '-GGTACGTGGTTGAACTGTTCC-3 '。
[0021] 第二輪擴(kuò)增引物為：
[0022] SEQ ID N0.3:5'-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAAGTGGGAGTCTGGGGGAGG-3'，
[0023] SEQ ID NO.4：5'-GTATCGATGCCCACCCTCTAGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCTGGG T-3, 。
[0024] 所述步驟(4)中構(gòu)建酵母cDNA文庫庫容為2 · 0xl06cfu/ml。
[0025] 本發(fā)明涉及淋巴細(xì)胞的分離:外周血中單個(gè)核細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等， 其體積、形態(tài)和密度與其它細(xì)胞不同，根據(jù)這一原理，利用淋巴細(xì)胞分離液，經(jīng)過密度梯度 離心使一定密度的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度分布，從而將各種血細(xì)胞加以分離，將分離到的淋 巴細(xì)胞重懸于RNAlater，該RNAlater是防止RNA降解的淋巴細(xì)胞保存劑，避免RNA由于長期 保存或使用不當(dāng)引起降解從而達(dá)不到建庫要求。
[0026] 本發(fā)明涉及全部VHH cDNA的制備，普通情況下，mRNA以oligo(dT)為引物，在普通 逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其合成的cDNA長度是有限的，往往涵蓋不了mRNA的豐度，這樣 得到的文庫不具備廣譜性。本發(fā)明以一種改造的oligo(dT)寡苷酸作為引物（CDSm)，在 MMLV(莫洛尼鼠白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶催化作用下合成第一鏈，在合成cDNA的反應(yīng)時(shí)由于事 先加進(jìn)的3'末端帶Oligo(dG)的SMART(RNA5'端轉(zhuǎn)錄切換機(jī)構(gòu)）引物，當(dāng)合成cDNA到達(dá)mRNA 的5 '末端時(shí)碰到真核mRNA特有的"帽子結(jié)構(gòu)"，即甲基化的G時(shí)會(huì)連續(xù)在合成的cDNA末端加 上幾個(gè)(dC)，SMART引物的Oligo(dG)與合成cDNA末端突出的幾個(gè)C配對后形成cDNA的延伸 模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會(huì)自動(dòng)轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的 末端，這樣得到的cDNA是高質(zhì)量、高產(chǎn)量的全長cDNA，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有 樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接構(gòu)建cDNA文庫、擴(kuò)增基因、已知序列釣全長cDNA (RACE)和用于芯片檢測的cDNA探針的擴(kuò)增等。
[0027]本發(fā)明構(gòu)建的酵母cDNA文庫具有相對分子量小、組織穿透力強(qiáng)、體內(nèi)清除快、易于 大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)和進(jìn)行基因工程改進(jìn)等優(yōu)點(diǎn)，因此比完整長度的單克隆抗體具有更大的 優(yōu)勢和發(fā)展前景。另外，本發(fā)明針對羊痘病毒構(gòu)建的cDNA文庫是一種具備型特異性、生物學(xué) 活性好、結(jié)合抗原能力強(qiáng)、具有潛在中和功能的抗體文庫，尤其是單域抗體之類的新型抗 體，對于建立敏感羊痘病毒的臨床診斷方法，研究病毒的感染機(jī)理具有極其重要的作用。 [0028]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明提供了一種具備相對分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好、 抗原結(jié)合性能好、易表達(dá)等優(yōu)勢的抗羊痘病毒的雙峰駝VHH重鏈單域抗體酵母cDNA文庫及 其制備方法。
【附圖說明】
[0029]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0030] 圖1為總RNA完整性電泳檢測圖，其中DNA分子量marker:Lambda EcoT14I digest; 250bp DNA Ladder marker；
[0031] 圖2為pGADT7-cDNA文庫質(zhì)粒驗(yàn)證結(jié)果圖；
[0032] 圖3為pGADT7-cDNA文庫插入片段擴(kuò)增驗(yàn)證結(jié)果圖，其中DNA分子量markenLambda EcoT14I digest；250bp DNA Ladder marker〇
【具體實(shí)施方式】
[0033] 以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 羊痘弱毒苗免疫駱駝實(shí)驗(yàn)
[0036] 選取兩月齡母駱駝，先采血制備陰性血清，然后前腿三角肌外側(cè)皮內(nèi)注射卡介苗 進(jìn)行致敏并進(jìn)行觀察，lw后于駱駝另一側(cè)尾根內(nèi)側(cè)及股內(nèi)側(cè)皮內(nèi)分點(diǎn)進(jìn)行免疫:首次免疫 劑量為6頭份羊的免疫量;第15天進(jìn)行二免，劑量為12頭份;第30天進(jìn)行三免，劑量為8頭份； 第60天進(jìn)行四免，劑量為8頭份;第70天于頸靜脈采集駱駝血，分離血清，羊痘抗體檢測試劑 盒(美國Q&D公司)檢測血清抗體效價(jià)。
[0037] 檢測結(jié)果為:空白(?45〇 = 0.049;陰性對照OD45〇 = 0.054;陽性對照OD45〇 = 2.250;第 四次免疫后駱駝血清OD450 = 3.055?？梢?，血清抗體效價(jià)比較好。
[0038] 實(shí)施例2
[0039] 分離淋巴細(xì)胞，制備總RNA并純化mRNA
[0040] 1 ·制備抗凝劑:480mg/100ml;朽1 檬酸鈉 1.32g/100ml，葡萄糖 1.47g/100ml，高壓滅 菌后備用，抗凝劑用量為17.5%。
[0041 ] 2.分離淋巴細(xì)胞
[0042]駱駝第4次免疫后1周，頸靜脈采集駱駝抗凝血100ml，等量加入全血稀釋液，混勻； 以5:9的比例先加淋巴細(xì)胞分離液，之后先慢后快加稀釋好的抗凝血，水平離心機(jī)1800rpm， 18-22°C，20min;小心收集淋巴細(xì)胞層于新的收集管，以5倍量細(xì)胞洗滌液稀釋之，水平離心 機(jī)lOOOrpm, 18-22°C，lOmin;棄上清，沉淀再用細(xì)胞洗滌液稀釋，水平離心機(jī)lOOOrpm, 18-22 °C，10min離心;棄上清，沉淀即為分離到的淋巴細(xì)胞，將其懸浮于RNAlater中，置-70°C保存 備用。
[0043] 3.細(xì)胞總RNA收獲
[0044] 吸取上述淋巴細(xì)胞液400ul，加入lmlTRizol，混勻，4°C靜置5min;加入200ul三氯 甲烷，混勻，室溫靜置3min，12000r/min，4°C，離心15min;吸取750ul上清，加等量異丙醇，室 溫靜置1〇111；[11，100001'/111；[11，4°0，離心10111；[11;輕棄上清，沉淀加75%乙醇，80001'/111；[11，4°0，離 心5min;沉淀置通風(fēng)櫥10min使之干燥；20ul無 RNA酶的水溶解的沉淀即為收獲的總RNA， ND2000測得Total RNA濃度為4329ng/ul，純度0D260/0D280為1.98。其電泳檢測見圖1
[0045] 4 .mRNA 純化
[0046] 細(xì)胞Total RNA中mRNA利用Oligotex mRNA Mini Kit分離純化方法進(jìn)行分離純 化，將上述總RNA稀釋至500ul體積，加入500yL0BB緩沖液，混勻，70 °C水浴中孵化3min，25 °C 靜置10min，12000r/min，4°C，2min ;吸棄上清，400yL 0W1緩沖液重懸沉淀，全量上柱， 12000r/min，4°C，lmin;棄濾液，400yL 0W2緩沖液洗柱，12000r/min，4°C，lmin;將柱置于新 的1.5mL無 RNA酶離心管，吸50yL0EB緩沖液到柱上，室溫靜置lmin，12000r/min，4°C，lmin， 所得為純化的1^祖，其濃度為101.3即/111，純度00260/00280為1.96 ;283、183、53 3條帶清 晰，28S: 18S約為2:1，說明RNA和mRNA純度較高，滿足文庫構(gòu)建的需要。完整性驗(yàn)證的變性瓊 脂糖凝膠電泳如圖1。
[0047] 實(shí)施例3
[0048] 全長cDNA合成、cDNA合成雙鏈及純化 [0049] 1.全長cDNA合成
[0050] 在0.2ml的PCR擴(kuò)增管中依次加入下列組分：
[0052]點(diǎn)擊混勻，將離心管放置于72°C金屬浴，孵育2min，立即置冰上，冷卻2min，點(diǎn)擊收 集，依次加入下列組分：
[0054]點(diǎn)擊混勻，將離心管放置于42°C金屬浴，反轉(zhuǎn)錄lh，室溫冷卻，加入lulRNA酶抑制 劑(2u/ul)，得到的產(chǎn)物為全長cDNA，置-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0055] 2.CDNA合成雙鏈及純化
[0056] 在0.2ml的PCR第一輪擴(kuò)增管中依次加入下列組分：
[0058] 上述擴(kuò)增程序:95°(：1111丨11;95°(：158,681€5111丨11，20個(gè)循環(huán) ；681€5111丨11。將擴(kuò)增產(chǎn)物電 泳，凝膠純化回收900bp產(chǎn)物，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0059] 在0.2ml的PCR第二輪擴(kuò)增管中依次加入下列組分：

[0062]上述擴(kuò)增程序：95°(：1111丨11;95°(：158,681€5111丨11，20個(gè)循環(huán) ；681€5111丨11。擴(kuò)增產(chǎn)物電 泳，凝膠
[0063]回收試劑盒從凝膠中純化收集400bp產(chǎn)物，置-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0064] 實(shí)施例4
[0065] cDNA文庫的構(gòu)建、質(zhì)量評(píng)價(jià)及鑒定：
[0066] l.cDNA文庫構(gòu)建
[0067] 采用TOG/LiAc法制備酵母Y187感受態(tài)細(xì)胞。每600uL感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化20ul雙鏈 cDNA和6ul pGADT7-Rec，將轉(zhuǎn)化的菌液均勻涂布于直徑100mm的和150mm的SD/-Leu平板上， 30°C倒置培養(yǎng)3-5d直至克隆出現(xiàn)。再次將平板置于4°C冰箱，放置3-4h。給每塊平板加入5mL 凍存液(含25 %甘油的YPDA液體培養(yǎng)基），并加入無菌玻璃珠，水平方向反復(fù)搖動(dòng)，之后收集 菌液，所得產(chǎn)物為酵母cDNA初級(jí)文庫，質(zhì)粒鑒定結(jié)果如圖2。
[0068] 2.文庫的質(zhì)量評(píng)價(jià)
[0069] 取共轉(zhuǎn)化產(chǎn)物菌液，按1/10、1/100和1/1000稀釋，分別涂100ul稀釋液至 100mmSD/-LeU平板，30 °C倒置培養(yǎng)3-5d直至克隆出現(xiàn)，對生長的單菌落計(jì)數(shù)，依公式:板子 克隆數(shù)/鋪板體積(ml )X稀釋倍數(shù)=菌斑形成單位/ml。計(jì)算得文庫庫容為2.0xl06cfu/ml。 [0070] 3.文庫擴(kuò)增鑒定
[0071]隨機(jī)挑取16個(gè)單菌落，用pGADT-Rec通用測序引物進(jìn)行菌落PCR，分析文庫插入片 段的大小以及重組率。PCR反應(yīng)參數(shù):94°C預(yù)變性5min;94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C 延伸2min，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。取7ul PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳分 析。圖3電泳結(jié)果顯示cDNA文庫的覆蓋范圍為400-2000bp，平均插入片段約為lOOObp。由菌 落PCR結(jié)果可以得知文庫的重組率為100%。
[0072]最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較 佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技 術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本 發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫，其特征在于:包括羊痘弱毒苗免 疫駱駝的抗原劑量、免疫程序和血清抗體效價(jià)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫，其特征在 于:所述山羊痘弱毒苗免疫駱駝劑量為:首免6頭份、二免12頭份、三免8頭份、四免8頭份;所 述免疫程序?yàn)?卡介苗致敏1周后，山羊痘弱毒疫苗首免、第15天二免、第30天三免、第60天 四免；所述血清抗體效價(jià)為：空白OD 45Q = 0.049、陰性對照OD45Q = 0.054、陽性對照OD450 = 2 · 250、四免后血清 0D45。= 3 · 055。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫的制備方 法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 駱駝淋巴細(xì)胞分離、總RNA提取及mRNA分離、純化； (2) ⑶SHI和SMART引物逆轉(zhuǎn)錄合成全長cDNA; (3) 設(shè)計(jì)兩套擴(kuò)增引物，采用同源重組的方法將擴(kuò)增產(chǎn)物與pGADT7共轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞 Y187； (4) 構(gòu)建駱駝抗羊口瘡病毒的VHH基因 cDNA文庫； (5) 計(jì)算文庫庫容量； (6) 擴(kuò)增cDNA文庫進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫的制備方 法，其特征在于:所述步驟（1)中分離淋巴細(xì)胞中Total RNA濃度為4329ng/ul，純度0D260/ 0D280為1.98。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫及其制備 方法，其特征在于:所述步驟(3)中第一輪擴(kuò)增引物為： SEQ ID N0.1:5'-GTCCTGGCTGCTTCTACAAGG-3'， SEQ ID N0.2:5'-GGTACGTGGTTGAACTGTTCC-3'。 第二輪擴(kuò)增引物為： SEQ ID NO.3： 5 '-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAAGTGGGAGTCTGGGGGAGG-3 '， SEQ ID NO.4： 5 '-GTATCGATGCCCACCCTCTAGCCGAGGCGGCCGACATGGAGACGGTGACCTGGGT-3 ' 〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種抗羊痘病毒雙峰駝VHH重鏈單域抗體cDNA文庫及其制備 方法，其特征在于:所述步驟(4)中構(gòu)建酵母cDNA文庫庫容為2.0xl0 6cfu/ml。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK105887208SQ201610281583
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】吳錦艷, 田宏, 尚佑軍, 陳妍, 王光祥, 尹雙輝, 蒙學(xué)蓮, 欒志舫, 劉湘濤, 張志東
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所