一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于組織工程生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽，其分子結(jié)構(gòu)分為三個部分：一端具有多重DOPA氨基酸序列，即支撐部分；中間為間隔氨基酸序列，即間隔部分；另一端為具有生物活性的多肽序列，即活性部分。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的生物模擬活性肽可以極大地改進(jìn)目前鈦基醫(yī)用生物材料的表面改性方法存在的不足。使用本發(fā)明的生物模擬活性肽對鈦基醫(yī)用生物材料進(jìn)行改性時(shí)，避免了繁復(fù)的修飾步驟，只需一步法即可制備生物功能化的鈦基醫(yī)用生物材料，因此具有簡單高效性、靈活性以及生物活性的可選擇性的優(yōu)勢。更重要的是，本發(fā)明設(shè)計(jì)的多肽分子具備高度生物模擬性，有利于其在臨床的推廣使用。
【專利說明】
一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于組織工程生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]醫(yī)用鈦或其合金材料具有高機(jī)械強(qiáng)度、抗疲勞性能、抗腐蝕性和抗應(yīng)變原性，是臨床應(yīng)用最廣泛的承力植入材料。然而，鈦基材料屬生物惰性材料，這樣的性能導(dǎo)致它只能與生長骨之間產(chǎn)生機(jī)械結(jié)合而不能形成化學(xué)結(jié)合，因而植入骨內(nèi)時(shí)難以實(shí)現(xiàn)很好的骨整合作用。研究表明，通過對鈦基合金進(jìn)行表面活化處理，可以顯著改善鈦基材料的表面性能，改性技術(shù)不僅可提高金屬表面的穩(wěn)定性和耐磨性，而且可賦予生物活性，即可使新骨組織直接沉積于金屬表面，而無纖維結(jié)締組織的中間隔層。因此，近年來醫(yī)用鈦合金材料的表面改性研究已成為醫(yī)用生物材料的研究熱點(diǎn)之一。
[0004]目前，人們已經(jīng)采用各種物理和化學(xué)的方法來對鈦表面進(jìn)行改性處理，通過改變鈦表面氧化鈦膜的結(jié)構(gòu)、化學(xué)成份以及通過引入表面生物分子等可賦予鈦基金屬材料生物活性，從而在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)材料與硬組織間的生物活性結(jié)合。目前物理技術(shù)類的改性方法需要用到多種復(fù)雜的技術(shù)手段，如:熱噴涂、脈沖激光、離子濺射、噴砂、電化學(xué)法和離子注入法等。通過這種表面物理性能的方式條件鈦材料表面的生物功能需要大量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和復(fù)雜設(shè)施。相比而言，通過表面引入生物活性分子的方式則更為直接。一些具有生物活性的分子，如:多肽、蛋白、生長因子甚至無機(jī)離子(Ca2+)都可以通過物理吸附或者共價(jià)接入的方式改性醫(yī)用鈦基生物材料。但是當(dāng)前的物理吸附方式會造成嚴(yán)重的分子泄露，而化學(xué)方式則需要復(fù)雜的化學(xué)手段和非生物兼容的化學(xué)分子來作為活性分子的橋接。因此這一類方法的普遍適用性和實(shí)用性大打折扣。
[0005]針對上述醫(yī)用鈦合金材料表面改性方法所面臨的各種問題，本發(fā)明專利從合理的分子設(shè)計(jì)出發(fā)，通過生物模擬多肽合成技術(shù)，設(shè)計(jì)制備出一端含有多重DOPA氨基酸序列、一端含有生物活性肽分子的生物模擬活性肽。DOPA氨基酸，S卩3，4-L-二羥基苯丙氨酸(3，4_dihydroxy-L-phenylalanine)，廣泛存在于貽貝類生物所分泌的粘附蛋白中C3DOPA中的兒茶酚(即，鄰苯二酚)可以和多種材料表面材料共價(jià)和非共價(jià)方式結(jié)合，是貽貝類生物附著于礁石船只等表面的重要手段。研究證明，DOPA基團(tuán)和二氧化鈦表面在水中簡單接觸的情況下很快形成穩(wěn)定的配位結(jié)合作用。而且，鈦合金材料表面都會被包覆一層致密、穩(wěn)定的二氧化鈦氧化層(2-20nm)。基于此，我們設(shè)計(jì)的生物模擬活性肽則可以通過簡單地、一步法對鈦合金醫(yī)用材料進(jìn)行表面改性。相比于傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法，本發(fā)明設(shè)計(jì)的生物模擬活性肽可以極大地改進(jìn)目前鈦基醫(yī)用生物材料的表面改性方法存在的不足。使用本發(fā)明的生物模擬活性肽對鈦基醫(yī)用生物材料進(jìn)行改性具有簡單高效性、靈活性以及生物活性的可選擇性(如細(xì)胞貼附因子和成骨生長因子)的優(yōu)勢，因此在鈦合金醫(yī)用材料表面改性領(lǐng)域顯示出極大地應(yīng)用前景。更重要的是，本發(fā)明所涉及的多肽分子的高度生物模擬性(絕對的多肽分子)，將極其有利于在臨床的推廣使用。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對上述面臨的各種問題，本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種可用于“一步法”表面改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽。本發(fā)明涉及的生物模擬活性肽可采用標(biāo)準(zhǔn)的多肽合成技術(shù)制備，并能通過簡單的浸泡方式“一步法”接枝在鈦基材料表面，具有簡單高效、靈活多樣、生物兼容等優(yōu)點(diǎn)，因此適于推廣和最終的臨床應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的一個技術(shù)方案為:一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽，其特征在于，其分子結(jié)構(gòu)分為三個部分:一端具有多重DOPA氨基酸序列，即支撐部分；中間為間隔氨基酸序列，即間隔部分；另一端為具有生物活性的多肽序列，即活性部分。
[0008]適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽的制備方法為標(biāo)準(zhǔn)的固相多肽合成法。其中，每個氨基酸序列的連接順序是根據(jù)生物模擬活性肽的氨基酸序列依次合成的。
[0009]例如，具有改進(jìn)細(xì)胞貼附性能的生物模擬活性肽(D0PA)4-G5-RGDS，其支撐部分含有四重的DOPA氨基酸序列，間隔部分含有五重的甘氨酸序列，活性部分則接有細(xì)胞貼附性能的RGDS活性序列，按照固相合成技術(shù)，這一代表性的生物模擬活性肽的合成步驟顯示如圖1，簡述如下:
首先將磷酸節(jié)酯保護(hù)的絲氨酸(Fmoc-O-(benzylphospho)-Serine-OH，I mmol)、2-氯三苯甲基氯樹脂(1.6 g，1.6 mmol)和二異丙基乙胺(DIPEA，4 mmol)溶解在15 mL二氯甲烷(DCM)中，反應(yīng)4小時(shí)后，用甲醇(MeOH)將樹脂表面沒有反應(yīng)的基團(tuán)消耗，樹脂表面則被引入磷酸芐酯保護(hù)絲氨酸。用含有20%哌啶的甲基吡咯烷酮(NMP)溶液除去Fmoc基團(tuán)，露出氨基。隨后將樹脂加入含有Fmoc-Asp(0tBu)-0H/B0P/DIPEA (I.5/1.5/1.5，mmol)的WP溶液中，以此接入叔丁基氧(OtBu)保護(hù)的天門冬氨酸。除去Fmoc基團(tuán)，重復(fù)上一步驟分別接上甘氨酸和五甲基苯并呋喃-5-磺?；?Pbf)保護(hù)的精氨酸，進(jìn)而得到活性基團(tuán)被保護(hù)的Fmoc-RGDS-Res in。重復(fù)上述操作接入五個甘氨酸序列作為鏈接肽，得到Fmoc-GGGGGRGDS-Resin。隨后，使用Fmoc-D0PA(Acetonide )_0H為DOPA氨基酸原料，分步接入四重DOPA 氨基酸，得到丙酮保護(hù)的 Fmoc-(D0PA)4_GGGGGRGDS-Resin，用乙酸酐(Ac20)/DIPEA/NMP(1:4:40)脫去Fmoc基團(tuán)，同時(shí)乙?；被?。用三氟乙酸(TFA，2%)的二氯甲烷溶液將多肽從樹脂表面斷裂，隨后用2 mL的TFA/Me0H/H20/DCM (體積比，30/2.5/2.5/65)水解3 h，用高效液相色譜分離純化即得到脫保護(hù)基團(tuán)的生物模擬細(xì)胞粘附肽:(D0PA)4_GGGGGRGDS。
[0010]其他的生物模擬活性肽的合成步驟與此類似，按照所設(shè)計(jì)的氨基酸序列依次合成。
[0011]本發(fā)明所涉及生物模擬活性肽分子結(jié)構(gòu)的各個部分具有以下特征:
1.支撐部分是含有DOPA氨基酸序列的多肽結(jié)構(gòu)，其中，所含的DOPA氨基酸序列的數(shù)目為I到100，所處的位置為整個分子的N端、C端或者是中間部分；
2.間隔部分中的氨基酸序列數(shù)目為O到100，氨基酸的種類為丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(He)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、絲氨酸(Ser )、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)等天然氨基酸的一種或幾種。所處的位置應(yīng)在支撐部分和活性部分之間；
3.活性部分是各種具有生物活性的多肽序列，如:細(xì)胞粘附肽、細(xì)胞生長肽、成骨生長肽、抗菌肽、神經(jīng)活性肽、激素調(diào)節(jié)肽、抗高血壓活性肽、抗氧化活性肽、免疫活性肽等。所處的位置為整個分子的N端、C端或者是中間部分；
4.本發(fā)明涉及的生物模擬活性肽分子，包括N端或C端被修飾或被標(biāo)記后的肽序列，如:N端乙?；?、C端酰胺化、同位素標(biāo)記(NI5，Cl 3)、磷酸化(Ser、Thr、Tyr)、脂肪酸修飾(Pal、Myr)，環(huán)肽修飾(酰胺環(huán)、二硫鍵環(huán)及定點(diǎn)成環(huán))，焚光標(biāo)記(FAM、FITC、Rodamine、HYNIC等)，生物素標(biāo)記(B1TIN)、復(fù)合抗原修飾(MAP4，MAP8，MAP16分支)、熒光淬滅基團(tuán)標(biāo)記(EDANS，DABCYL)、小分子化合物修飾、PEG修飾、甲基化修飾、側(cè)鏈修飾等。
[0012]對不同生物活性的生物模擬活性肽分子，我們可通過鑒定其在鈦材料表面的結(jié)合性能，體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞響應(yīng)性以及植入體內(nèi)后的生物功能進(jìn)行驗(yàn)證。例如，我們所設(shè)計(jì)合成的代表性的細(xì)胞貼附生物模擬活性肽(D0PA)4-G5-RGDS，若將鈦醫(yī)用材料簡單地浸泡與此多肽溶液之后，表面可以被檢測出明顯氮元素含量增加，細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)證明細(xì)胞貼附性能有明顯增強(qiáng)，則本發(fā)明方法可行。此外，我們還可以通過將表面接有(DOPA)4-G5-RGDs的鈦材料植入動物體的骨中，觀察鈦材料的骨整合性能驗(yàn)證本發(fā)明方法可行。
[0013]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果:
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的生物模擬活性肽可以極大地改進(jìn)目前鈦基醫(yī)用生物材料的表面改性方法存在的不足。使用本發(fā)明的生物模擬活性肽對鈦基醫(yī)用生物材料進(jìn)行改性時(shí)，避免了繁復(fù)的修飾步驟，只需一步法即可制備生物功能化的鈦基醫(yī)用生物材料，因此具有簡單高效性、靈活性以及生物活性的可選擇性(如細(xì)胞貼附活性多肽和成骨生長活性的多肽)的優(yōu)勢。更重要的是，本發(fā)明設(shè)計(jì)的多肽分子的高度生物模擬性(絕對的多肽分子)，有利于其在臨床的推廣使用，尤其在鈦基醫(yī)用材料表面改性領(lǐng)域顯示出極大地應(yīng)用前景。
[0014]
【附圖說明】
[0015]圖1代表性的細(xì)胞貼附生物模擬活性肽(D0PA)4-G5-RGDS的合成示意圖；
圖2 (D0PA)4-G5-RGDS的ESI質(zhì)譜圖；
圖3細(xì)胞在表面改性前后的貼附性能示意圖；
圖4 (D0PA)4-G4_YGFGG的ESI質(zhì)譜圖；
圖5表面改性有成骨生長肽YGFGG前后的鈦釘在兔子股骨髁部位的骨整合性能示意圖； 圖6為(D0PA)4-G5-RGDS的結(jié)構(gòu)圖。
[0016]
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步地說明。
[0018](I)(DOPA)4-G5-RGDs用于“一步法”改進(jìn)Ti02表面細(xì)胞貼附性能
生物模擬細(xì)胞貼附肽(DOPA)4-G5-RGDs的分子結(jié)構(gòu)如圖6，其中:支撐部分含有四重的DOPA氨基酸序列，間隔部分含有五重的甘氨酸序列，活性部分則接有細(xì)胞貼附性能的RGDS活性序列。其制備方法見圖1。一步法改性的步驟如下:將(D0PA)4-G5-RGDS配置成一定的濃度，溶劑為去離子水、PBS緩沖液、乙醇或甲醇等常用溶劑，濃度在0.0l-lOmg/mL之間。將醫(yī)用鈦基生物材料(如，T12鍍層的玻片或者自攻皮質(zhì)骨鈦釘)浸泡于上述溶液中，浸泡時(shí)間為30min至72h之間，即可得到表面改性有細(xì)胞粘附分子RGS的T12表面。
[0019]結(jié)果分析:
圖2顯示的(DOPA)4-G5-RGDs的質(zhì)譜圖，分子量的結(jié)果確定了我們成功得到這個活性的多肽分子。圖3顯示的是表面改性有細(xì)胞粘附分子RGS的T12其表面細(xì)胞貼附性能的變化，未改性的鈦釘材料在沒有血清的培養(yǎng)條件下細(xì)胞貼附性能明顯不如改性后的T12表面材料，結(jié)果充分說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的生物模擬細(xì)胞貼附肽(D0PA)4-G5-RGDS可以有效改進(jìn)T12表面材料的細(xì)胞貼附性能。
[0020]
(2)(D0PA)4-G4_YGFGG用于“一步法”表面改性醫(yī)用鈦基材料
生物模擬成骨生長肽(D0PA)4-G5-YGFGG的分子結(jié)構(gòu)，其中:支撐部分含有四重的DOPA氨基酸序列，間隔部分含有四重的甘氨酸序列，活性部分則接有細(xì)胞貼附性能的YGFGG活性序列。一步法改性的步驟如下:將(D0PA)4-G5-YGFGG配置成一定的濃度，溶劑為去離子水、PBS緩沖液、乙醇或甲醇等常用溶劑，濃度在0.0l-lOmg/mL之間。將醫(yī)用自攻皮質(zhì)骨鈦釘浸泡于上述溶液中，浸泡時(shí)間為30min至72h之間，即可得到表面改性有成骨生長肽YGFGG的鈦釘。結(jié)果分析:
結(jié)果分析:
圖4顯示的(DoPA)4-G4-YGFGG的質(zhì)譜圖，分子量的結(jié)果確定了我們成功得到這個活性的多肽分子。圖5顯示的是表面改性有成骨生長肽YGFGG的鈦釘在這植入兔子股骨髁4周后，其表面骨整合性能的變化，未改性的鈦釘材料的骨整合效果明顯不如改性后的鈦釘，結(jié)果再次深入地說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的生物模擬成骨生長肽(DoPA)4-G4-YGFGG可以有效改進(jìn)醫(yī)用鈦釘材料在體內(nèi)的骨整合效果。因此，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的生物模擬活性肽可以簡單高效的“一步法”改性鈦基生物醫(yī)用材料，并顯示出潛在的臨床優(yōu)勢，具有極強(qiáng)的應(yīng)用推廣前景。
[0021]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出:對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和等同形式的替換，這些改進(jìn)和等同替換得到的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽，其特征在于，其分子結(jié)構(gòu)分為三個部分:一端具有多重DOPA氨基酸序列，即支撐部分；中間為間隔氨基酸序列，SP間隔部分;另一端為具有生物活性的多肽序列，即活性部分。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽，其特征在于，多重DOPA氨基酸序列的氨基酸數(shù)目為I到100，所處的位置靠近整個分子的N端、C端或者是中間部分。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽，其特征在于，間隔部分中的氨基酸序列數(shù)目為O到100，氨基酸的種類為丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、組氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、天冬氨酸(Asp)、色氨酸(Trp)、蛋氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、谷氨酸(Glu)構(gòu)成的天然氨基酸的一種或幾種;間隔部分在支撐部分和活性部分之間。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽，其特征在于，活性部分為細(xì)胞粘附肽、細(xì)胞生長肽、成骨生長肽、抗菌肽、神經(jīng)活性肽、激素調(diào)節(jié)肽、抗高血壓活性肽、抗氧化活性肽或免疫活性肽;活性部分的位置為靠近整個分子的N端、C端或者是中間部分。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的生物模擬活性肽，其特征在于，所述的生物模擬活性肽分子的N端或C端被修飾或被標(biāo)記。6.“一步法”改性醫(yī)用鈦基材料的制備方法，將權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的生物模擬活性肽配置成一定的濃度，溶劑為去離子水、PBS緩沖液、乙醇或甲醇，生物模擬活性肽濃度在0.0l-lOmg/mL之間；將醫(yī)用鈦基生物材料浸泡于上述溶液中，浸泡時(shí)間為30min至72h之間，即可得到改性醫(yī)用鈦基材料。
【文檔編號】C07K19/00GK105949322SQ201610311276
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】潘國慶, 施勤, 楊惠林
【申請人】蘇州大學(xué)附屬第醫(yī)院, 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院