一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于有機光電材料技術(shù)領(lǐng)域。該配合物包括C^N配體、金屬中心和含有烷基鏈的輔助配體，結(jié)構(gòu)式如下式所示。本發(fā)明的磷光銥配合物能夠被可見光激發(fā)，產(chǎn)生在近紅外區(qū)域的發(fā)射光，從而減弱激發(fā)光源對生物樣品的損傷并具有較深的組織穿透深度。此外，該配合物有著良好的抗光漂白性能，在成像上可以實現(xiàn)對細胞組織較長時間有效的觀測。本發(fā)明的磷光銥配合物可應(yīng)用于溶酶體標記以及生物成像領(lǐng)域，其具有簡單的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及良好的生物相容性，是很好的溶酶體靶向磷光探針。
【專利說明】
一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其制備方法和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其制備方法和應(yīng)用，屬于 有機光電材料技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前研究較多的電致磷光材料主要包括銥、釕、鉑、鋨等有機金屬配合物，其中磷 光環(huán)金屬銥配合物有著優(yōu)異的磷光特性，例如高的量子產(chǎn)率，大的Stokes位移，長的磷光壽 命，發(fā)光顏色的易調(diào)節(jié)性以及好的抗光漂白性，是目前研究得最多的一種磷光材料。并且磷 光過渡金屬配合物的發(fā)射壽命(幾百納秒到幾十微秒)比熒光(幾納秒)長得多，這個特性不 僅賦予其對氧氣敏感的特性，還使其能夠在時間分辨成像技術(shù)中發(fā)揮其特長，有效濾除背 景熒光的干擾，目前，它們已廣泛應(yīng)用于生物成像和傳感探針等領(lǐng)域中。申請公開號為 CN104402936A的專利申請中記載了一種銥配合物的制備方法，但是其制備而成的銥配合物 中配體結(jié)構(gòu)只有一種，無法通過配體結(jié)構(gòu)的調(diào)整而調(diào)節(jié)發(fā)光波長從而使電致發(fā)光器件的顏 色覆蓋整個可見光區(qū)。
[0003] 溶酶體內(nèi)部含有多種水解酶，這些酶能夠降解幾乎所有種類的生物分子，因此溶 酶體是細胞內(nèi)的消化器官。細胞自溶、防御以及對某些物質(zhì)的利用均與溶酶體的消化作用 有關(guān)，因此對活細胞中溶酶體進行生物成像具有重要意義。但是由于細胞一般沒有明確有 效的靶點，能夠?qū)崿F(xiàn)特定細胞靶向作用的化學(xué)小分子很少。目前為止，以特定細胞器為靶 點，如溶酶體，能夠在活體細胞中作用于這些靶點的，應(yīng)用比較成熟的有染料和抗體兩類。 一般染料都會有光漂白性和光致毒性，在紫外可見光的照射下短時間內(nèi)即失去熒光活性， 或者產(chǎn)生單線態(tài)氧等極易對活細胞發(fā)生毒害作用的物質(zhì)，不利于活體細胞的無損傷成像。 抗體雖然低毒，但是價格昂貴、易失活的特性限制了其應(yīng)用。申請公開號為CN101962536A的 專利申請中記載了一種溶酶體靶向的熒光物質(zhì)，但是其化學(xué)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，生物相容性不是 很好。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是:提出了一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其 制備方法和應(yīng)用，以實現(xiàn)對溶酶體的靶向功能，利于細胞的無損傷成像。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是：一種具有溶酶體靶向功能的 磷光銥配合物，包括C~N配體、金屬中心以及含有烷基鏈的輔助配體，該銥配合物具有如下 結(jié)構(gòu)式：
[0007] 其中，C~N配體為下列中的任意一個：
[0009]為了解決上述另一技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是:一種制備具有溶酶體靶 向功能的磷光銥配合物的制備方法，該方法的合成路線如下：
[0011]具體步驟:室溫下將化合物1與甲醇鈉溶液攪拌反應(yīng)22小時，然后向反應(yīng)液中加入 氯化銨反應(yīng)6小時，反應(yīng)結(jié)束后過濾掉未反應(yīng)的氯化銨，將濾液旋干去除甲醇溶劑，得到淺 黃色粉末，之后用乙醚洗滌三次，除去未反應(yīng)的化合物1，再用乙醇-乙醚的混合溶劑重結(jié) 晶，得到白色固體化合物2;再將化合物2與乙酰乙酸乙酯在乙醇鈉催化條件下加熱回流24 小時，旋干除掉溶劑后將固體溶于適量去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至4-5,水中會有大量白色固 體析出，過濾得該白色固體，并用水和乙醚洗滌三次，得到白色固體化合物3;將化合物3、溴 己烷與K 2C03溶于丙酮后在氮氣氛圍中60°C回流攪拌過夜，再將反應(yīng)液用水和二氯甲烷萃取 三次除去殘留的的K 2C03，收集有機相，用無水Na2S04干燥后旋蒸除去有機溶劑，將得到的油 狀混合物用層析柱提純，得到黃色油狀液體化合物4;最后將化合物4和銥二氯橋在二氯甲 烷與甲醇的混合溶劑中，在氮氣氛圍下55°C回流攪拌過夜，反應(yīng)完成后待反應(yīng)溶液溫度降 至室溫，再向其中加入KPF 6繼續(xù)攪拌2小時，之后旋蒸除掉有機溶劑，并將得到的固體用層 析柱提純，得到紅色粉末狀固體Ir-alkyl(l-7)。
[0012] 為了解決上述另一技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案是:具有溶酶體靶向功能的 磷光銥配合物的應(yīng)用，該磷光銥配合物應(yīng)用于活細胞溶酶體的標記。
[0013] 進一步的，該磷光銥配合物應(yīng)用于細胞成像領(lǐng)域。
[0014] 進一步的，該磷光銥配合物應(yīng)用于生物標記領(lǐng)域。
[0015] 進一步的，該磷光銥配合物應(yīng)用于乏氧檢測領(lǐng)域。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的磷光銥配合物能夠被可見光激 發(fā)，產(chǎn)生在近紅外區(qū)域的發(fā)射光，從而減弱激發(fā)光源對生物樣品的損傷并具有較深的組織 穿透深度。另外，其具有長壽命的磷光發(fā)射能夠在生物成像方面利用時間門有效地消除背 景熒光以達到提高圖像信噪比的目的，并且該配合物有著優(yōu)秀的抗光漂白性能，在成像上 可以實現(xiàn)對細胞組織較長時間有效的觀測。本發(fā)明的磷光銥配合物可應(yīng)用于溶酶體標記， 生物成像，具有簡單的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及良好的生物相容性，是很好的溶酶體靶向磷光探針。
【附圖說明】
[0017] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的作進一步說明。
[0018] 圖1.實施例3中銥配合物Ir-alky 1 (7)的甲苯溶液（10-5M)的紫外-可見吸收光譜； [0019 ]圖2.實施例3中銥配合物Ir-alky 1 (7)的甲苯溶液(10-5M)的發(fā)射光譜；
[0020] 圖3.實施例4中銥配合物Ir-alkyl(7)在Hela細胞中的MTT細胞毒性實驗；
[0021] 圖4.實施例5中銥配合物Ir-alkyl(7)與商業(yè)溶酶體染料的在A549細胞中的共染 成像；
[0022]圖5.實施例5中銥配合物Ir_alkyl(7)與商業(yè)溶酶體染料的在Hela細胞中的共染 成像；
[0023]圖6.實施例5中銥配合物Ir_alkyl(7)與商業(yè)溶酶體染料的在HepG2細胞中的共染 成像；
[0024]圖7.實施例6中銥配合物Ir_alkyl(7)與商業(yè)溶酶體染料的在Hela細胞中的抗光 漂白性實驗；
[0025]圖8.實施例7中銥配合物Ir_alkyl(7)與商業(yè)溶酶體染料的在Hela細胞中的PLIM (a)和時間門成像(b~f)。
【具體實施方式】
[0026] 下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實例。
[0027] 實施例1:含烷基鏈的輔助配體的制備
[0029] 化合物2的制備：取20ml甲醇加入50ml單口瓶中，加入50mg金屬Na，室溫下攪拌直 至Na完全反應(yīng)溶解，室溫下將化合物1 (24_〇1)與甲醇鈉溶液攪拌反應(yīng)22小時，然后向反應(yīng) 液中加入氯化銨(26mmol)反應(yīng)6小時，反應(yīng)結(jié)束后過濾掉未反應(yīng)的氯化銨，將濾液旋干去除 甲醇溶劑，得到淺黃色粉末，之后用乙醚洗滌三次，除去未反應(yīng)的化合物1，再用乙醇-乙醚 的混合溶劑重結(jié)晶，得到白色固體化合物2產(chǎn)率：83 %。NMR(400MHz，DMSO) S = 9.69(s， 4H)，8.85-8.73(m，lH)，8.45(d，J = 8.0Hz，lH)，8.14(td，J = 7.8，1.7Hz，lH)，7.85-7.71(m, lH)〇13C NMR(101MHz,DMS0)8=162.67,150.33,144.37,138.76,129.01,124.00〇 [0030]表1.合成化合物2的反應(yīng)原料用量與產(chǎn)物的產(chǎn)量和產(chǎn)率
[0032]化合物3的制備:將化合物2 (6mmo 1)與乙酰乙酸乙酯(6mmo 1)在乙醇鈉催化條件下 加熱回流24小時，旋干除掉溶劑后將固體溶于適量去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至4-5,水中會有 大量白色固體析出，過濾得該白色固體，并用水和乙醚洗滌三次，得到白色固體化合物3。產(chǎn) 率：55% </H MlR(400MHz，DMS0)S = ll .89(s，lH)，8.69(d，J = 4.4Hz，lH)，8.25(d，J = 7.9Hz,lH) ,8.00(td,J = 7.8,1.2Hz,lH) ,7.60(dd,J = 6.9,5.1Hz,lH),6.25(s,lH) ,2.26 (s，3H)〇
[0033]表2.合成化合物3的原料用量與產(chǎn)物的產(chǎn)量和產(chǎn)率
[0035] 化合物4的制備:將化合物3 (1.5mmo 1)、溴己燒(6. Ommo 1)與K2CO3 (5.25mmo 1)溶于 丙酮(6ml)后在氮氣氛圍中60°C回流攪拌過夜，再將反應(yīng)液用水和二氯甲烷萃取三次除去 殘留的的1( 20)3,收集有機相，用無水Na2S04干燥后旋蒸除去有機溶劑，將得到的油狀混合物 用層析柱提純，得到黃色油狀液體化合物4。產(chǎn)率25%。4 Mffi(400MHz，DMS0-d6)S(ppm): 8.72(ddd，J=1.2,2.0,4.8Hz，lH)，8.33(dt，J = 0.8,8.0Hz，lH)，7.95(td，J=l .6,7.6Hz， 1H)，7.51(ddd，J=1.2,4.8,7.6Hz，lH)，6.81(s，lH)，4.42(t，J = 6.4Hz，2H)，2.46(s，3H)， 1.78-1.71(m,2H),l.45-1.37(m,2H),l.33-1,29(m,4H),0.86(t,J=7.2Hz,3H)〇
[0036] 表3.合成化合物4的反應(yīng)原料用量與產(chǎn)物的產(chǎn)量和產(chǎn)率
[0037]
[0038]實施例2:含烷基鏈銥配合物Ir_alkyl(7)的制備
[0040] 化合物Ir-a 1 ky 1 (7)的制備:將化合物4 (0.22mmo 1)和銥二氯橋(0. lmmo 1)在二氯 甲烷(3mL)與甲醇（lmL)的混合溶劑中，在氮氣氛圍下55°C回流攪拌過夜，反應(yīng)完成后待反 應(yīng)溶液溫度降至室溫，再向其中加入KPF 6(2.2mmo 1)繼續(xù)攪拌2小時，之后旋蒸除掉有機溶 劑，并將得到的固體用層析柱提純，得到紅色粉末狀固體Ir_alkyl(7)。產(chǎn)率23%。4匪R (400MHz，DMS0-d6)S(ppm):8.45(d，J=7.6Hz，lH)，8.12-8.08(m，3H)，8.01-7.68(m，9H)， 7.36-7.31(m,2H),7.15-7.14(m,lH),7.08-6.98(m,10H),6.94-6.85(m,4H),6.82-6.79(m, 4H),6.76-6.70(m,5H),6.50(ddd ,J = 2.0,4.0,8.4Hz,2H),5.84(d ,J = 2.0Hz,lH),5.53(d, J=2.4Hz,lH),4.46-4.34(m,2H),1.97(s,3H),1.65-1.58(m,2H),1.22-1.21(m,6H),0.83 (t ,J = 7.2Hz,3H)〇
[0041] 表4.合成Ir_alkyl(7)的反應(yīng)原料用量與產(chǎn)物的產(chǎn)量和產(chǎn)率
[0043] 其他六種不同主配體的銥的配合物[
Ir-alkyl (1-6)]的合成方法與實例一致，得 到不同的銥的配合物只需在合成配合物的那個反應(yīng)中用不同主配體的銥二氯橋替換即可。 [0044]實施例3:銥配合物Ir-alkyl (7)的吸收和發(fā)射光譜測試
[0045]本發(fā)明采用的光譜測試濃度為10虛，測試溶劑為甲苯溶液，測發(fā)射光譜時，激發(fā)波 長為405nm。
[0046] Ir-alky 1 (7)的吸收與發(fā)射光譜如圖1和圖2所示。分析圖1和圖2可以得出，配合物 在紫外區(qū)250-380nm以及可見藍光區(qū)400-500nm均表現(xiàn)出了較強的吸收，特別是該配合物能 夠被可見光激發(fā)，因此在做細胞成像實驗時能夠大大減少激發(fā)光源對細胞的損傷。測量其 發(fā)射光譜時，先用氧氣與氮氣體積比不同的氣流往溶液中鼓氣10分鐘然后進行測試。由結(jié) 果可知其發(fā)射較寬，發(fā)射峰位于600nm，長波長的發(fā)射光使得在生物組織中的較大的穿透深 度，使之更適用于生物成像，并且隨著溶液中氧含量的減少，發(fā)射光的強度逐漸增強，證明 該配合物能夠應(yīng)用于乏氧檢測的領(lǐng)域。
[0047] 實施例4:銥配合物Ir-alky 1 (7)的MTT細胞毒性實驗
[0048] 將消化后的細胞接種在96孔板中，每孔的接種密度為104個/孔，在37°C，5%0)2的 條件下培養(yǎng)24小時。之后吸除不新鮮的培養(yǎng)液，再用不同濃度Ir-alkyl(7)(l、5、10、25、50y M)的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞24小時。然后再在每孔加入10yL MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4小 時。最后吸除培養(yǎng)液，每孔加入150yL二甲基亞砜，搖床震蕩10分鐘后使用酶標儀測試 0D570〇
[0049] MTT細胞毒性實驗結(jié)果如圖3所示，在配合物的濃度增至50yM時，培養(yǎng)24小時后，細 胞存活率依然大于80%，證明該配合物具有較低的細胞毒性，可用于細胞成像。
[0050] 實施例5:銥配合物Ir-alkyl(7)與商業(yè)溶酶體染料LysoGreen對活細胞溶酶體的 共染實驗
[00511本測試采用的細胞分別為A549細胞、HepG2細胞和Hela細胞。將消化后的細胞接種 在培養(yǎng)皿中，在37°C，5%⑶2的條件下培養(yǎng)24小時使之貼壁。用roS溶液洗去不新鮮的細胞 培養(yǎng)液后用Ir-alkyl (7) (5yM)的細胞培養(yǎng)液孵育細胞12小時。之后用含有LysoGreen (200nM)的細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10分鐘后進行成像測試。
[0052] 配合物Ir-alkyl (7)與商業(yè)溶酶體染料LysoGreen的在A549細胞、HepG2細胞和 Hela細胞中共染成像圖如圖4、圖5和圖6所示。LysoGreen由488nm藍光激發(fā)，收集500-540nm 綠光發(fā)射，Ir-alky 1 (7)由488nm藍紫光激發(fā)，收集580-640nm紅光發(fā)射。將溶酶體染料的發(fā) 射區(qū)域與配合物Ir_alkyl(7)的發(fā)射區(qū)域向疊加，發(fā)現(xiàn)二者重合度高。由計算可得，在三種 細胞中的共染系數(shù)分別為〇.93、0.82和0.91，證明本發(fā)明的配合物1^11^1(7)能夠靶向活 細胞溶酶體，可用于活細胞溶酶體標記。
[0053] 實施例6:銥配合物Ir-alkyl (7)與商業(yè)溶酶體染料LysoGreen在Hela細胞中的抗 光漂白性試驗；
[0054]本測試采用的細胞Hela細胞。將消化后的細胞接種在培養(yǎng)皿中，在37°C，5%C02的 條件下培養(yǎng)24小時使之貼壁。用PBS溶液洗去不新鮮的細胞培養(yǎng)液后分成兩組，一組細胞用 含有Ir-alkyl (7) (5yM)的細胞培養(yǎng)液孵育細胞12小時，另一組細胞用含有LysoGreen (200nM)的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)10分鐘，然后進行抗光漂白測試。
[0055] LysoGreen由488nm藍光激發(fā)，收集500-540nm綠光發(fā)射，Ir-alkyl(7)由488nm藍紫 光激發(fā)，收集580-640nm紅光發(fā)射。先收集光漂白前的共聚焦圖像，再在兩組細胞中分別選 定特定區(qū)域用強激光照射一秒鐘進行光漂白，之后收集共聚焦圖像。對比兩者光漂白前后 的圖像可知，點1位置在光漂白前后的發(fā)光強度變化遠小于點2位置的發(fā)光強度變化，由此 可證明Ir-alkyl (7)的抗光漂白性優(yōu)于商業(yè)溶酶體染料LysoGreen的性能。
[0056] 實施例7:銥配合物Ir_alkyl(7)在Hela細胞中的PLIM和時間門成像。
[0057]本測試采用的細胞為Hela細胞。將消化后的細胞接種在培養(yǎng)皿中，在37°C，5%C02 的條件下培養(yǎng)24小時使之貼壁。用roS溶液洗去不新鮮的細胞培養(yǎng)液后用Ir-alkyl(7)(5y M)的細胞培養(yǎng)液孵育細胞12小時。然后用PBS溶液清洗三次后進行成像測試。
[0058] Ir-alkyl(7)由405nm藍紫光激發(fā)。由生成的PLIM圖像（圖8(a))圖可知，在細胞內(nèi) 配合物靶向的溶酶體區(qū)域發(fā)光壽命體現(xiàn)了磷光發(fā)射長壽命特點。在時間門成像實驗中，分 別收集了延遲〇ns、20ns、50ns、100ns和200ns的信號，可以看到在扣除了背景熒光干擾之 后，細胞成像保持著良好的信噪比和分辨率（圖8(b~f))。證明Ir_alkyl(7)在生物成像方 面有很好的適用性。
[0059]以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)無需創(chuàng) 造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員 依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由本發(fā)明權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物，包括C~N配體、金屬中屯、w及含有烷基鏈 的輔助配體，其特征在于:該銀配合物具有如下結(jié)構(gòu)式：2. -種如權(quán)利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的制備方法，其特征 在于:該方法的合成路線如下：具體步驟:室溫下將化合物1與甲醇鋼溶液攬拌反應(yīng)22小時，然后向反應(yīng)液中加入氯化 錠反應(yīng)6小時，反應(yīng)結(jié)束后過濾掉未反應(yīng)的氯化錠，將濾液旋干去除甲醇溶劑，得到淺黃色 粉末，之后用乙酸洗涂Ξ次，除去未反應(yīng)的化合物1，再用乙醇-乙酸的混合溶劑重結(jié)晶，得 到白色固體化合物2;再將化合物2與乙酷乙酸乙醋在乙醇鋼催化條件下加熱回流24小時， 旋干除掉溶劑后將固體溶于適量去離子水中，調(diào)節(jié)pH值至4-5,水中會有大量白色固體析 出，過濾得該白色固體，并用水和乙酸洗涂Ξ次，得到白色固體化合物3;將化合物3、漠己燒 與K2C03溶于丙酬后在氮氣氛圍中60°C回流攬拌過夜，再將反應(yīng)液用水和二氯甲燒萃取Ξ次 除去殘留的的K2C03，收集有機相，用無水Na2S〇4干燥后旋蒸除去有機溶劑，將得到的油狀混 合物用層析柱提純，得到黃色油狀液體化合物4;最后將化合物4和銀二氯橋在二氯甲燒與 甲醇的混合溶劑中，在氮氣氛圍下55°C回流攬拌過夜，反應(yīng)完成后待反應(yīng)溶液溫度降至室 溫，再向其中加入KPF6繼續(xù)攬拌2小時，之后旋蒸除掉有機溶劑，并將得到的固體用層析柱 提純，得到紅色粉末狀固體Ir-alkyl(l-7)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的應(yīng)用，其特征在于:該 憐光銀配合物應(yīng)用于活細胞溶酶體的標記。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的應(yīng)用，其特征在于:該 憐光銀配合物應(yīng)用于細胞成像領(lǐng)域。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的應(yīng)用，其特征在于:該 憐光銀配合物應(yīng)用于生物標記領(lǐng)域。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的應(yīng)用，其特征在于:該 憐光銀配合物應(yīng)用于乏氧檢測領(lǐng)域。
【文檔編號】C12N5/00GK105968143SQ201610293907
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】趙強, 黃維, 張璋, 劉淑娟, 許文娟, 呂雯
【申請人】南京郵電大學(xué)