糖基轉(zhuǎn)移酶突變蛋白及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變蛋白及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明利用同源比對(duì)以及定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)了一種新的糖基轉(zhuǎn)移酶的突變蛋白，所述的突變蛋白為非天然蛋白，且所述突變蛋白具有糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性，并且所述突變蛋白含有與酶催化活性相關(guān)的以下核心氨基酸：第142位氨基酸為A；第144位氨基酸為H或F；和第339位氨基酸為G；其中，所述氨基酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO.:13所示的序列。實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶中的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行改造后，可以改變?cè)緹o活性或活性較差的酶，或者賦予新的酶活性。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，對(duì)本發(fā)明糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行末端截短后，其表達(dá)量具有明顯的上升。
【專利說明】
糖基轉(zhuǎn)移酶突變蛋白及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶突 變蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 人參皂苷是從人參及其同屬植物（如三七、西洋參等）中分離到的皂苷的總稱，屬 于三萜類皂苷，是人參中的主要有效成份。目前，已經(jīng)從人參中分離出了至少1〇〇種皂苷。 從結(jié)構(gòu)上來看，人參皂苷是皂苷元經(jīng)過糖基化后形成的生物活性小分子。人參皂苷的皂苷 元只有有限的幾種，主要是達(dá)瑪烷型的原人參二醇和原人參三醇，以及齊墩果烷酸。皂苷元 通過糖基化后，可以提高水溶性，并產(chǎn)生出不同的生理活性。原人參三醇在C3, C6和C20位 都有一個(gè)羥基，目前發(fā)現(xiàn)的原人參三醇型皂苷都是在C6和（或C20)的羥基上結(jié)合糖基化， 在C3上結(jié)合糖基的原人參三醇型皂苷尚未見報(bào)道。糖基可以是葡萄糖、鼠李糖、木糖、和阿 拉伯糖。
[0003] 一些原人參三醇型皂苷被證實(shí)具有廣泛的生理功能和藥用價(jià)值：包括抗過敏和抗 炎癥、免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、護(hù)心等功能。人參阜苷F1 (20-0-β -D-glucopyranosyl-20(S)-pr otopanaxatriol)屬于原人參三醇型阜苷，它在人參中的含量也非常低，也屬于稀有人參阜 苷。人參皂苷F1的結(jié)構(gòu)與CK非常接近，也是在皂苷元的C-20位羥基上連有一個(gè)葡萄糖基。 人參皂苷F1也具有獨(dú)特的藥用價(jià)值。它具有抗衰老和抗氧化的功能。人參皂苷Rhl (6-0-β -D-glucopyranosyl_20 (S) -protopanaxatriol)屬于原人參三醇型阜苷，它在人參中的 含量也非常低，也屬于稀有人參皂苷。人參皂苷Rhl的結(jié)構(gòu)與F1非常接近，但是它的糖基 化位點(diǎn)是在C6位上的羥基。人參皂苷Rhl也具有特殊的生理功能，能夠抗過敏和抗炎癥。 人參阜苷 Rgl (6-〇- β - (D-glucopyranosyl) -2〇-〇- β - (D-glucopyranosyl) -protopanaxad i〇l)屬于原人參三醇型皂苷，具有抗疲勞、護(hù)心等功能。
[0004] 稀有人參皂苷的糖基化修飾程度一般都比較低（只含有1-2個(gè)糖基），而豐富皂 苷的糖基化修飾程度更高（由多個(gè)糖基組成的糖鏈）。稀有人參皂苷單體的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法， 是以人參或者三七的總皂苷或者豐富皂苷為原料，依賴化學(xué)、酶和微生物發(fā)酵的水解方法。 由于野生的人參資源已基本耗竭，人參皂苷資源目前來源于人參或三七的人工栽培，而其 人工栽培的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)（一般需要5-7年以上），并且受到地域的限制，還經(jīng)常受到病蟲害 而需要施用大量的農(nóng)藥，所以，人參或三七的人工栽培有嚴(yán)重的連作障礙（人參或三七種 植地需要休耕5-15年以上才能克服連作障礙），所以人參皂苷的產(chǎn)量、品質(zhì)及安全性都面 臨挑戰(zhàn)。
[0005] 合成生物學(xué)的發(fā)展為植物來源的天然產(chǎn)物的異源合成提供了新的機(jī)遇。以酵母 為底盤，通過代謝途徑的組裝和優(yōu)化，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了用廉價(jià)的單糖來發(fā)酵合成青蒿酸或者雙 氫青蒿酸，繼而再通過一步化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)青蒿素，這表明合成生物學(xué)在天然產(chǎn)物的 藥物合成方面具有的巨大潛力。利用酵母底盤細(xì)胞通過合成生物學(xué)方法異源合成稀有人參 皂苷單體，原料為廉價(jià)的單糖，制備過程為安全性可調(diào)控的發(fā)酵過程，避免了任何外來污染 (例如，原料植物人工種植時(shí)使用的農(nóng)藥），因此，通過合成生物學(xué)技術(shù)制備稀有人參皂苷 單體，不僅具有成本優(yōu)勢(shì)，而且，可以保證成品的品質(zhì)與安全性。利用合成生物學(xué)技術(shù)制備 足夠量的各種高純度稀有人參皂苷單體，用于活性測(cè)定及臨床實(shí)驗(yàn)，促進(jìn)稀有人參皂苷的 創(chuàng)新藥物研發(fā)。
[0006] 利用合成生物學(xué)方法來人工合成這些具有藥用活性的三醇型人參皂苷，不僅需要 構(gòu)建合成原人參三醇的代謝途徑，還需要鑒定催化人參皂苷的糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶。糖基 轉(zhuǎn)移酶的功能是將糖基供體（核苷二磷酸糖，例如UDP-葡萄糖）上的糖基轉(zhuǎn)移到不同的糖 基受體上。根據(jù)氨基酸序列的不同，目前糖基轉(zhuǎn)移酶已有94個(gè)家族。目前已測(cè)序的植物基 因組中，發(fā)現(xiàn)了上百種以上不同的糖基轉(zhuǎn)移酶。這些糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基受體包括糖、脂、蛋 白、核酸、抗生素和其它的小分子。
[0007] 因此，本領(lǐng)域需要對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行更多的研究和開發(fā)，通過更多高產(chǎn)的糖基轉(zhuǎn) 移酶，以經(jīng)濟(jì)、高效的方式獲取稀有人參皂苷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種糖基轉(zhuǎn)移酶的突變蛋白，通過采用所述的突變蛋白可以改善其 酶活性或增加其表達(dá)量。
[0009] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種糖基轉(zhuǎn)移酶的突變蛋白，所述的突變蛋白為非天 然蛋白，且所述突變蛋白具有糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性，并且所述突變蛋白含有與酶催化活性 相關(guān)的以下核心氨基酸：
[0010] 第142位氨基酸為A ;
[0011] 第144位氨基酸為Η或F ;和
[0012] 第339位氨基酸為G;
[0013] 其中，所述氨基酸位置編號(hào)基于SEQ ID Ν0. : 13所示的序列。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白除142、144、339位氨基酸外，其余氨基酸與SEQ ID N0. : 13所示的序列相同或基本相同。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的基本相同是至多有50個(gè)（較佳地為1-20個(gè)，更佳地為 1-10個(gè)）氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突 變蛋白仍具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，與SEQ ID N0. : 13所示序列的同源性至少為80%，較佳地至少為 85% -90%，更佳地至少為95%，最佳地至少為98%。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白如SEQ ID N0. : 13、或16所示。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白不是SEQ ID N0. :1、2或4所示的序列。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性包括催化以下一種或多種反應(yīng)：
[0020] (a)將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-20位的羥基；
[0021] (b)將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-6位的羥基。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白如SEQ ID N0. :6、11_12所示，且所述的糖基轉(zhuǎn) 移酶催化活性包括將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-20位以及C-6位 的羥基。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白如SEQ ID N0. :6、8、11_12、16所示，且所述的糖 基轉(zhuǎn)移酶活性包括將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-6位的羥基。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白如SEQ ID N0. :6-7、9_13所示，且所述的糖基轉(zhuǎn) 移酶活性包括將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-20位的羥基。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性包括催化以下一種或多種反應(yīng)：
[0026] (A)
[0027]
[0028] 其中，所述式（I)化合物是原人參三醇（protopanaxatriol)，式（II)化合物為人 參阜苷 F1 (2〇-〇- β -D-glucopyranosy 1-20 (S) -protopanaxatriol)，所述的突變蛋白包括 SEQ ID NO. :6-7,9-13 ；
[0029] (B)
[0030]
[0031] 其中，所述式（I)化合物是原人參三醇（protopanaxatriol)，式（III)化合物為人 參阜苷 Rhl (6-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxatriol);或
[0032]
[0033] 式（II)化合物是人參阜苷 F1 (2〇-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxat riol)，式（IV)化合物是人參阜苷 Rgl (6-〇- β - (D-glucopyranosyl) -2〇-〇- β - (D-glucopy ranosyl)-protopanaxatriol)；
[0034] 所述的突變蛋白包括 SEQ ID NO. :6、8、11-12、16 ;
[0035] (C)
[0036]
[0037] 其中，所述式（I)化合物是原人參三醇（protopanaxatriol)，所述式（II)化合物 是人參阜苷 F1 (2〇-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxatriol)，式（IV)化合物為 人參阜苷 Rgl (6-〇- β - (D-glucopyranosyl) -2〇-〇- β - (D-glucopyranosyl) -protopanaxat riol)，所述的突變蛋白包括SEQ ID NO. :6、11-12 ;
[0038] (D)
[0040] 其中，所述式（I)化合物是原人參三醇（protopanaxatriol)，所述式（II)化合物 是人參阜苷 F1 (2〇-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxatriol)，式（III)化合物 為人參阜苷 Rhl (6-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxatriol)，所述的突變蛋白 包括 SEQ ID NO. :11-12。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖基供體包括核苷二磷酸糖，優(yōu)選地，所述的糖基供體選 自下組：UDP-葡萄糖，ADP-葡萄糖，TDP-葡萄糖，CDP-葡萄糖，⑶P-葡萄糖，UDP-半乳糖 醛酸，ADP-半乳糖醛酸，TDP-半乳糖醛酸，CDP-半乳糖醛酸，GDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳 糖，ADP-半乳糖，TDP-半乳糖，CDP-半乳糖，⑶P-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，ADP-阿拉伯糖， TDP-阿拉伯糖，CDP-阿拉伯糖，⑶P-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖，ADP-鼠李糖，TDP-鼠李糖， CDP-鼠李糖，GDP-鼠李糖，或其他核苷二磷酸己糖或核苷二磷酸戊糖，或其組合。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖基供體包括尿苷二磷酸（UDP)糖，優(yōu)選地，所述的糖基 供體選自下組：UDP-葡萄糖，UDP-半乳糖醛酸，UDP-半乳糖，UDP-阿拉伯糖，UDP-鼠李糖， 或其他尿苷二磷酸己糖或尿苷二磷酸戊糖，或其組合。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，反應(yīng)體系的pH為：pH4. 0-10. 0,優(yōu)選pH為6. 0-8. 5。
[0044] 在另一優(yōu)選例中，反應(yīng)體系的溫度為：10°C _105°C，優(yōu)選25°C -35°C。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白選自：
[0046] (al)SEQ ID N0. :13 所示的序列；或
[0047] (bl)SEQ ID N0. : 13所示的序列經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)（優(yōu)選為1-50個(gè)，較佳地，為1-20 個(gè)，更佳地，為1-10個(gè)，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)）氨基酸的取代、添加和/或缺失后， 并保留糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性的突變蛋白。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述的取代為1-50個(gè)保守氨基酸的取代，為1-20個(gè)，更佳地，為 1-10 個(gè)，如 1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10 個(gè)。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述的缺失為C端1-5個(gè)氨基酸的缺失，較佳地為2-4個(gè)氨基酸 的缺失。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白序列如SEQ ID NO. :6-8所示。
[0051] 在另一優(yōu)選例中，當(dāng)所述突變蛋白的C端缺失1-5個(gè)氨基酸后，其表達(dá)量比SEQ ID N0. : 13所示的蛋白提高了至少50%，更佳地為70%-100%。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的添加為添加標(biāo)簽序列、信號(hào)序列或分泌信號(hào)序列。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白還含有以下一個(gè)或多個(gè)氨基酸：
[0054] 第10位氨基酸為V ;
[0055] 第13位氨基酸為F ;
[0056] 第82位氨基酸為C ;和
[0057] 第186位氨基酸為L(zhǎng)。
[0058] 本發(fā)明第二方面，提供了一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼本發(fā)明第一方面所 述的突變蛋白。
[0059] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID N0. : 19和21所示，分別編碼SEQ ID N0. : 13和16所示的序列。
[0060] 本發(fā)明第三方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發(fā)明第二方面所述的多核 苷酸。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述載體包括表達(dá)載體、穿梭載體、整合載體。
[0062] 本發(fā)明第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第三方面所 述的載體，或其基因組中整合有本發(fā)明第二方面所示的多核苷酸。
[0063] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0064] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞，如大腸桿菌。
[0065] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞為人參細(xì)胞。
[0066] 本發(fā)明第五方面，提供了一種改造糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，包括步驟：
[0067] (i)將所述糖基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID N0. : 13所示的序列進(jìn)行同源性比對(duì)；
[0068] (ii)篩選出步驟（i)中與SEQ ID N0. : 13所示序列同源性至少為80%的序列；較 佳地至少為85% -90 %，更佳地至少為95 %，最佳地至少為98% ;
[0069] (iii)對(duì)步驟（ii)中篩選出的序列進(jìn)行改造，改造后的糖基轉(zhuǎn)移酶含有以下核心 氨基酸：
[0070] 第142位氨基酸為A ;
[0071 ] 第144位氨基酸為Η或F ;和
[0072] 第339位氨基酸為G ;
[0073] 其中，所述氨基酸位置編號(hào)基于SEQ ID Ν0. : 13所示的序列，
[0074] 且所述的核心氨基酸至少有一個(gè)是經(jīng)人為改造的。
[0075] 在另一優(yōu)選例中，所述改造后的糖基轉(zhuǎn)移酶還含有以下核心氨基酸：
[0076] 第10位氨基酸為V ;
[0077] 第13位氨基酸為F ;
[0078] 第82位氨基酸為C ;和/或
[0079] 第186位氨基酸為L(zhǎng) ;
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述改造后的糖基轉(zhuǎn)移酶C末端缺失了 1-5個(gè)氨基酸。
[0081] 本發(fā)明第六方面，提供了本發(fā)明第一方面所述的突變蛋白的用途，所述的突變蛋 白用于催化以下一種或多種反應(yīng)，或被用于制備催化以下一種或多種反應(yīng)的催化制劑：
[0082] (a)將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-20位的羥基；
[0083] (b)將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-6位的羥基。
[0084] 在另一優(yōu)選例中，所述的突變蛋白用于催化下述一種或多種反應(yīng)或被用于制備催 化下述一種或多種反應(yīng)的催化制劑：
[0085] 本發(fā)明第七方面，提供了一種進(jìn)行糖基催化反應(yīng)的方法，包括步驟：在本發(fā)明第一 方面所述突變蛋白的存在下，進(jìn)行糖基化反應(yīng)。
[0086] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖基化反應(yīng)包括在本發(fā)明第一方面所述突變蛋白的存在 下，將糖基供體轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的以下位點(diǎn)上：
[0087] C-20位和/或C-6位，從而形成糖基化的四環(huán)三萜類化合物。
[0088] 在另一優(yōu)選例中，所述的糖基催化反應(yīng)的底物包括達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類化合物、 羊毛脂烷型四環(huán)三萜類化合物、甘遂烷型四環(huán)三萜類化合物、環(huán)阿屯烷（環(huán)阿爾廷烷）型四 環(huán)三萜類化合物、葫蘆烷四環(huán)三萜類化合物、或楝烷型四環(huán)三萜類化合物。
[0089] 本發(fā)明第八方面，提供了一種提高糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量的方法，包括步驟：
[0090] (i)將所述糖基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID N0. : 13所示的序列進(jìn)行同源性比對(duì)；
[0091] (ii)篩選出步驟（i)中與SEQ ID N0. : 13所示序列同源性至少為80%的序列；較 佳地至少為85% -90 %，更佳地至少為95 %，最佳地至少為98% ;
[0092] (iii)對(duì)步驟（ii)中篩選出的序列進(jìn)行C端1-5個(gè)氨基酸的缺失。
[0093] 本發(fā)明第九方面，提供了本發(fā)明第四方面所述宿主細(xì)胞的用途，用于制備糖基轉(zhuǎn) 移酶，或作為催化細(xì)胞、或生產(chǎn)糖基化后的四環(huán)三廠類化合物。
[0094] 本發(fā)明第十方面，提供了一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括步驟：將本發(fā)明第四方 面所述的宿主細(xì)胞再生為植物，其中，所述的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
[0095] 本發(fā)明第十一方面，提供了一種糖基轉(zhuǎn)移酶的突變蛋白，所述的突變蛋白為非天 然蛋白，且所述突變蛋白具有糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性，并且所述突變蛋白含有與酶催化活性 相關(guān)的以下核心氨基酸：
[0096] 第82位氨基酸為C ;和/或
[0097] 第144位氨基酸為F
[0098] 其中，所述氨基酸位置編號(hào)基于SEQ ID N0. :11所示的序列，且所述的糖基轉(zhuǎn)移酶 催化活性包括將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-20位以及C-6位的羥 基。
[0099] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明第十一方面所述的突變蛋白與SEQ ID N0. : 11所示序列 同源性至少為90%，較佳地至少為95%，更佳地至少為98%。
[0100] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明第十一方面所述的突變蛋白除82、和/或144位氨基酸 外，其余氨基酸與SEQ ID N0. : 11所示的序列相同或基本相同。
[0101] 在另一優(yōu)選例中，所述的基本相同是至多有50個(gè)（較佳地為1-20個(gè)，更佳地為 1-10個(gè)）氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突 變蛋白具有將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的c-20位的羥的糖基轉(zhuǎn)移酶 活性。
[0102] 本發(fā)明第十二方面，提供了一種糖基轉(zhuǎn)移酶的突變蛋白，所述的突變蛋白為非天 然蛋白，且所述突變蛋白具有糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性，并且所述突變蛋白含有與酶催化活性 相關(guān)的以下核心氨基酸：
[0103] 第142位氨基酸為A ;
[0104] 第186位氨基酸為L(zhǎng);和
[0105] 第338位氨基酸為G
[0106] 其中，所述氨基酸位置編號(hào)基于SEQ ID N0. :16所示的序列，且所述的糖基轉(zhuǎn)移酶 催化活性包括將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-6位的羥基。
[0107] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明第十二方面所述的突變蛋白與SEQ ID N0. : 16所示序列 同源性至少為90%，較佳地至少為95%，更佳地至少為98%。
[0108] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明第十二方面所述的突變蛋白除142、186、338位氨基酸 外，其余氨基酸與SEQ ID N0. : 16所示的序列相同或基本相同。
[0109] 在另一優(yōu)選例中，所述的基本相同是至多有50個(gè)（較佳地為1-20個(gè)，更佳地為 1-10個(gè)）氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突 變蛋白具有將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-6位的羥的糖基轉(zhuǎn)移酶 活性。
[0110] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0111] 圖1.五個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列比對(duì)。
[0112] 圖2.五個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶體外催化的HPLC圖。l，UGTPgl催化PPT ;2, UGTPglOO催化 PPT ;3, UGTPglOl 催化 PPT ;4, UGTPgl02 催化 PPT ;5, UGTPgl03 催化 PPT ;6, pET28a 空載體作 為 control ;7, UGTPglOl 催化 F1 ;8, UGTPglOl 催化 Rhl。
[0113] 圖3.決定糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPgl和UGTPgl02催化C20-OH糖基化的關(guān)鍵氨基酸 位點(diǎn)。HPLC 圖如下：1，UGTPgl 催化 PPT ;2, UGTPgl02 催化 PPT ;3, UGTPgl-L38F 催化 PPT ;4, UGTPgl-A40S 催化 PPT ;5, UGTPgl-F85L 催化 PPT ;6, UGTPgl-T134I 催化 PPT ;7， UGTPgl-H144Y 催化 PPT ;8, UGTPgl-Q388H 催化 PPT ;9, UGTPgl02-Y144H 催化 PPT。
[0114] 圖4.決定糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPglOO和UGTPgl03催化C6-OH糖基化的關(guān)鍵氨基酸位 點(diǎn)。HPLC 圖如下：1，UGTPglOO 催化PPT ;2，UGTPgl03 催化PPT ;3，UGTPg100 -A142T 催化 PPT ; 4，UGTPg100 -L186S 催化 PPT ;5，UGTPg100 -W205R 催化 PPT ;6，UGTPg100 -G338R 催化 PPT ;7， UGTPgl03-T142A 催化 PPT ;8, UGTPgl03-T142A/S186L 催化 PPT ;9, UGTPgl03-T142A/S186L/ G338R 催化 PPT。
[0115] 圖5.改變UGTPgl底物區(qū)域特異性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。HPLC圖如下：1，UGTPgl 催化 PPT ;2, UGTPglOO 催化 PPT ;3, UGTPgl-A10V 催化 PPT ;4, UGTPgl-I13F 催化 PPT ;5， UGTPgl-H82C 催化 PPT ;6, UGTPgl-H144F 催化 PPT。
[0116] 圖6.截短UGTPgl，UGTPglOO和UGTPglOl的C末端氨基酸增強(qiáng)其在大腸桿菌中的 可溶表達(dá)量。A，野生型UGTs以及C末端截短后的UGTs在大腸桿菌中表達(dá)后細(xì)胞裂解液上 清的168七6?1131〇102,04,05分別表示(：末端截短2,4,5個(gè)氨基酸。8，野生型1^了8以及 C末端截短后的UGTs催化PPT的TLC圖。
【具體實(shí)施方式】
[0117] 通過廣泛而深入的研究，本發(fā)明人通過同源比對(duì)、定點(diǎn)突變等方式確定了糖基轉(zhuǎn) 移酶催化C-6或C-20的羥基糖基化的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶中的關(guān) 鍵位點(diǎn)進(jìn)行改造后，可以改變?cè)緹o活性或活性較差的酶，或者賦予新的酶活性。此外，本 發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，對(duì)本發(fā)明糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行末端截短后，其表達(dá)量具有明顯的上升。在此基礎(chǔ) 上，完成了本發(fā)明。
[0118] 本發(fā)明突變蛋白及其編碼核酸
[0119] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"突變蛋白"、"本發(fā)明突變蛋白"、"本發(fā)明糖基轉(zhuǎn)移酶"均指非天 然存在的糖基轉(zhuǎn)移酶突變蛋白，且所述突變蛋白為SEQ ID N0. : 13 (或SEQ ID N0. : 16)所 示蛋白，或基于SEQ ID N0. : 13 (或SEQ ID N0. : 16)所示蛋白進(jìn)行人工改造的蛋白，其中， 所述的突變蛋白含有與酶催化活性相關(guān)的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一個(gè)是 經(jīng)過人工改造的；并且本發(fā)明突變蛋白具有催化以下一種或多種反應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶活性：
[0120] (a)將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-20位的羥基；
[0121] (b)將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-6位的羥基。
[0122] 如非特別說明，本文所說的人參皂苷和皂苷元，是的C20位S構(gòu)型的人參皂苷和皂 苷元。
[0123] 術(shù)語(yǔ)"核心氨基酸"指的是基于SEQ ID N0. : 13 (或SEQ ID N0. : 16)，且與SEQ ID NO. :13(或 SEQ ID NO. :16)同源性達(dá)至少 80%，如 84%、85%、90%、92%、95%、98% 的序 列中，相應(yīng)位點(diǎn)是本文所述的特定氨基酸，如基于SEQ ID N0. :13所示的序列，核心氨基酸 為：
[0124] 第142位氨基酸為A ;
[0125] 第144位氨基酸為Η或F ;和
[0126] 第339位氨基酸為G，且含有所述核心氨基酸的突變蛋白具有將來自糖基供體的 糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-20位的羥基的催化活性。
[0127] 又如基于SEQ ID Ν0. : 16所示的序列，核心氨基酸為：
[0128] 第142位氨基酸為A ;
[0129] 第186位氨基酸為L(zhǎng) ;和
[0130] 第338位氨基酸為G，且含有所述核心氨基酸的突變蛋白具有將來自糖基供體的 糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)三萜類化合物的C-6位的羥基的催化活性。
[0131] 應(yīng)理解，本發(fā)明突變蛋白中的氨基酸編號(hào)基于SEQ ID N0. : 13 (或SEQ ID N0. : 16) 作出，當(dāng)某一具體突變蛋白與SEQ ID NO. :13(或SEQ ID NO. :16)所示序列的同源性達(dá)到 80%或以上時(shí)，突變蛋白的氨基酸編號(hào)可能會(huì)有相對(duì)于SEQ ID NO. :13(或SEQ ID NO. :16) 的氨基酸編號(hào)的錯(cuò)位，如向氨基酸的N末端或C末端錯(cuò)位1-5位，而采用本領(lǐng)域常規(guī)的序列 比對(duì)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？梢岳斫膺@樣的錯(cuò)位是在合理范圍內(nèi)的，且不應(yīng)當(dāng)由于氨 基酸編號(hào)的錯(cuò)位而使同源性達(dá)80% (如90%、95%、98%)的、具有相同或相似糖基轉(zhuǎn)移酶 活性的突變蛋白不在本發(fā)明突變蛋白的范圍內(nèi)。
[0132] 本發(fā)明突變蛋白是合成蛋白或重組蛋白，即可以是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組 技術(shù)從原核或真核宿主（例如，細(xì)菌、酵母、植物）中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主， 本發(fā)明的突變蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的突變蛋白還可包括或 不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0133] 本發(fā)明還包括所述突變蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)"片段"、 "衍生物"和"類似物"是指基本上保持所述突變蛋白相同的生物學(xué)功能或活性的蛋白。
[0134] 本發(fā)明的突變蛋白片段、衍生物或類似物可以是（i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守 性氨基酸殘基（優(yōu)選保守性氨基酸殘基）被取代的突變蛋白，而這樣的取代的氨基酸殘基 可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán) 的突變蛋白，或（iii)成熟突變蛋白與另一個(gè)化合物（比如延長(zhǎng)突變蛋白半衰期的化合物， 例如聚乙二醇）融合所形成的突變蛋白，或（iv)附加的氨基酸序列融合到此突變蛋白序列 而形成的突變蛋白（如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此突變蛋白的序列或蛋白原序列， 或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白）。根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物和類似物屬于 本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。本發(fā)明中，保守性替換的氨基酸最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基 酸替換而產(chǎn)生。
[0135] 表1
[0136]
[0137] 在本發(fā)明的活性突變蛋白具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，并且能夠催化以下一種或多種反 應(yīng)：
[0138] (A)
[0139]
[0140] 其中，所述式（I)化合物是原人參三醇（protopanaxatriol)，式（II)化合物為人 參阜苷 F1 (2〇-〇- β -D-glucopyranosy 1-20 (S) -protopanaxatriol)，所述的突變蛋白包括 SEQ ID NO. :6-7,9-13 ；
[0141] (B)
[0142]
[0143] 其中，所述式（I)化合物是原人參三醇（protopanaxatriol)，式（III)化合物為人 參阜苷 Rhl (6-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxatriol);或
[0144]
[0145] 式（II)化合物是人參阜苷 F1 (2〇-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxat riol)，式（IV)化合物是人參阜苷 Rgl (6-〇- β - (D-glucopyranosyl) -2〇-〇- β - (D-glucopy ranosyl)-protopanaxatriol)；
[0146] 所述的突變蛋白包括 SEQ ID NO. :6、8、11_12、16 ;
[0147] (C) 「01481
[0149] 其中，所述式（I)化合物是原人參三醇（protopanaxatriol)，所述式（II)化合物 是人參阜苷 F1 (2〇-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxatriol)，式（IV)化合物為 人參阜苷 Rgl (6-〇- β - (D-glucopyranosyl) -2〇-〇- β - (D-glucopyranosyl) -protopanaxat riol)，所述的突變蛋白包括SEQ ID NO. :6、11-12 ;
[0150] (D)
[0151]
[0152] 其中，所述式（I)化合物是原人參三醇（protopanaxatriol)，所述式（II)化合物 是人參阜苷 F1 (2〇-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxatriol)，式（III)化合物 為人參阜苷 Rhl (6-〇- β -D-glucopyranosyl-20 (S) -protopanaxatriol)，所述的突變蛋白 包括 SEQ ID NO. :11-12。
[0153] 通常，除了具有上述核心氨基酸以外，本發(fā)明突變蛋白還可以具有以下一個(gè)或多 個(gè)氨基酸：
[0154] 第10位氨基酸為V;
[0155] 第13位氨基酸為F;
[0156] 第82位氨基酸為C;和
[0157] 第186位氨基酸為L(zhǎng)。
[0158] 優(yōu)選地，所述的突變蛋白如SEQ ID N0. :9-13、16所示，且所述的突變蛋白不是SEQ ID NO. :1_3所示的序列。
[0159] 本發(fā)明突變蛋白還包括將具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的突變蛋白經(jīng)C末端缺失（截短） 后的突變蛋白，例如SEQ ID NO. :6-8所示的序列。
[0160] 應(yīng)理解，本發(fā)明突變蛋白與SEQ ID N0. : 13所示的序列相比，通常具有較高的同源 性（相同性），優(yōu)選地，所述的突變蛋白與SEQ ID N0. : 13所示序列的同源性至少為80%， 較佳地至少為85% -90%，更佳地至少為95%，最佳地至少為98%。
[0161] 此外，還可以對(duì)本發(fā)明突變蛋白進(jìn)行修飾。修飾（通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式包 括：體內(nèi)或體外的突變蛋白的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些 在突變蛋白的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的突變蛋白。這種 修飾可以通過將突變蛋白暴露于進(jìn)行糖基化的酶（如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶） 而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨 酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的突變蛋白。
[0162] 術(shù)語(yǔ)"編碼突變蛋白的多核苷酸"可以是包括編碼本發(fā)明突變蛋白的多核苷酸，也 可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0163] 本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多 肽或突變蛋白的片段、類似物和衍生物。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和 插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多 個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的突變蛋白的功能。
[0164] 本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50%，較佳地至少 70%，更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件（或嚴(yán)緊條件）下 與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，"嚴(yán)格條件"是指：（1)在較低離子 強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如〇. 2XSSC，0. 1% SDS，60°C;或（2)雜交時(shí)加有變性劑， 如50% (v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/0. l%Ficoll，42°C等；或（3)僅在兩條序列之間的 相同性至少在90%以上，更好是95%以上時(shí)才發(fā)生雜交。
[0165] 本發(fā)明的突變蛋白和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地，被純化至均質(zhì)。
[0166] 本發(fā)明多核苷酸全長(zhǎng)序列通?？梢酝ㄟ^PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲 得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè) 計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模 板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次 擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0167] 一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
[0168] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長(zhǎng)度較短時(shí)。通常，通 過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長(zhǎng)的片段。
[0169] 目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到編碼本發(fā)明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載 體）和細(xì)胞中。此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0170] 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的多核苷酸。特別是很 難從文庫(kù)中得到全長(zhǎng)的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法（RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法），用于 PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成?？捎?常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
[0171] 野生型糖基轉(zhuǎn)移酶
[0172] 在本發(fā)明中，自糖基轉(zhuǎn)移酶中篩選出具有C20-OH、C6-OH糖基化活性的系列基因 進(jìn)行研究。其中：
[0173] UGTPglOl基因具有序列表中SEQ ID N0:17的核苷酸序列。自SEQ ID N0:17的 5'端第1-1428位核苷酸為UGTPgl的開放閱讀框，自SEQ ID NO: 17的5'端的第1-3位核 苷酸為UGTPgl基因的起始密碼子ATG，自SEQ ID N0:17的5'端的第1426-1428位核苷酸 為UGTPgl基因的終止密碼子TAA。糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGTPgl編碼一個(gè)含有475個(gè)氨基酸的 蛋白質(zhì)UGTPgl，具有SEQ ID NO: 1的氨基酸殘基序列，用軟件預(yù)測(cè)到該蛋白質(zhì)的理論分子量 大小為53. 4kDa，等電點(diǎn)pi為5. 01。自SEQ ID NO: 1的氨基端的第344位氨基酸至第387 位氨基酸為植物小分子糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶的保守PSPG基序。
[0174] UGTPgl基因具有序列表中SEQ ID N0:18的核苷酸序列。自SEQ ID N0:18的5'端 第 1-1428 位核苷酸為 UGTPgl 的開放閱讀框（Open Reading Frame, 0RF)，自 SEQ ID N0:18 的5'端的第1-3位核苷酸為UGTPgl基因的起始密碼子ATG，自SEQ ID NO: 18的5'端的第 1426-1428位核苷酸為UGTPgl基因的終止密碼子TAA。糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGTPgl編碼一個(gè)含 有475個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)UGTPgl，具有SEQ ID N0:的氨基酸殘基序列，用軟件預(yù)測(cè)到該蛋 白質(zhì)的理論分子量大小為53. 4kDa，等電點(diǎn)pi為5. 14。自SEQ ID N0:2的氨基端的第344 位氨基酸至第387位氨基酸為為植物小分子糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶的保守PSPG(Plant Secondary Product Glycosyltransferase)基序。
[0175] UGTPgl02基因具有序列表中SEQ ID N0:19的核苷酸序列。自SEQ ID N0:19的 5'端第1-1428位核苷酸為UGTPgl的開放閱讀框，自SEQ ID NO: 19的5'端的第1-3位核 苷酸為UGTPgl基因的起始密碼子ATG，自SEQ ID N0:19的5'端的第1426-1428位核苷酸 為UGTPgl基因的終止密碼子TAA。糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGTPgl編碼一個(gè)含有475個(gè)氨基酸的 蛋白質(zhì)UGTPgl，具有SEQ ID N0:3的氨基酸殘基序列，用軟件預(yù)測(cè)到該蛋白質(zhì)的理論分子量 大小為53. 6kDa，等電點(diǎn)pi為5. 08。自SEQ ID N0:3的氨基端的第344位氨基酸至第387 位氨基酸為為植物小分子糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶的保守PSPG基序。
[0176] UGTPglOO基因具有序列表中SEQ ID N0:20的核苷酸序列。自SEQ ID N0:20的 5'端第1-1419位核苷酸為UGTPgl的開放閱讀框，自SEQ ID NO:20的5'端的第1-3位核 苷酸為UGTPgl基因的起始密碼子ATG，自SEQ ID N0:20的5'端的第1417-1419位核苷酸 為UGTPgl基因的終止密碼子TAA。糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGTPgl編碼一個(gè)含有472個(gè)氨基酸的 蛋白質(zhì)UGTPgl，具有SEQ ID N0:4的氨基酸殘基序列，用軟件預(yù)測(cè)到該蛋白質(zhì)的理論分子 量大小為53. lkDa，等電點(diǎn)pi為5. 08。自SEQ ID N0. :4的氨基端的第343位氨基酸至第 386位氨基酸為為植物小分子糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶的保守PSPG基序。
[0177] UGTPgl03基因具有序列表中SEQ ID N0:21的核苷酸序列。自SEQ ID N0:21的 5'端第1-1419位核苷酸為UGTPgl的開放閱讀框，自SEQ ID NO:21的5'端的第1-3位核 苷酸為UGTPgl基因的起始密碼子ATG，自SEQ ID N0:21的5'端的第1417-1419位核苷酸 為UGTPgl基因的終止密碼子TAA。糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGTPgl編碼一個(gè)含有472個(gè)氨基酸的 蛋白質(zhì)UGTPgl，具有SEQ ID N0:5的氨基酸殘基序列，用軟件預(yù)測(cè)到該蛋白質(zhì)的理論分子 量大小為53. 2kDa，等電點(diǎn)pi為5. 23。自SEQ ID N0. : 5的氨基端的第343位氨基酸至第 386位氨基酸為為植物小分子糖基化修飾的糖基轉(zhuǎn)移酶的保守PSPG基序。
[0178] 上述涉及的野生蛋白、本發(fā)明突變蛋白及其衍生蛋白的序列信息如表2所示：
[0179] 表 2
[0180]
[0182] 表達(dá)載體
[0183] 本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或本發(fā)明突變 蛋白編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
[0184] 通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達(dá)或生產(chǎn)重 組的突變蛋白。一般來說有以下步驟：
[0185] (1).用本發(fā)明的編碼本發(fā)明突變蛋白的多核苷酸（或變異體），或用含有該多核 苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；
[0186] (2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細(xì)胞；
[0187] (3).從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)
[0188] 本發(fā)明中，編碼突變蛋白的多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語(yǔ)"重組 表達(dá)載體"指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒 如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以 用。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
[0189] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含本發(fā)明突變蛋白編碼DNA序列和合 適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體 內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合 成。這些啟動(dòng)子的代表性例子有：大腸桿菌的lac或trp啟動(dòng)子；λ噬菌體PL啟動(dòng)子；真 核啟動(dòng)子包括CMV立即早期啟動(dòng)子、HSV胸苷激酶啟動(dòng)子、早期和晚期SV40啟動(dòng)子、反轉(zhuǎn)錄 病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動(dòng)子。 表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。
[0190] 此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的 宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋 白（GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
[0191] 包含上述的適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適 當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)蛋白質(zhì)。
[0192] 宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高 等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有：大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì) 菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母、植物細(xì)胞（如人參細(xì)胞）。
[0193] 本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，如果在載體中插入增強(qiáng)子序列時(shí)將 會(huì)使轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個(gè)堿基對(duì)，作用 于啟動(dòng)子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄?？膳e的例子包括在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的100到270個(gè)堿基 對(duì)的SV40增強(qiáng)子、在復(fù)制起始點(diǎn)晚期一側(cè)的多瘤增強(qiáng)子以及腺病毒增強(qiáng)子等。
[0194] 本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和宿主細(xì)胞。
[0195] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原 核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgC12。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的 方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方 法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
[0196] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo)） 誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0197] 在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復(fù)性處理、用 蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析（凝膠過濾）、 吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的 結(jié)合。
[0198] 本發(fā)明有益效果：
[0199] 經(jīng)大量篩選和改造，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性位點(diǎn)，改造了相關(guān)位點(diǎn)后， 能夠?qū)⒃緵]有催化活性的糖基轉(zhuǎn)移酶改造為具有活性的新蛋白，而對(duì)高度同源性的蛋白 進(jìn)行關(guān)鍵位點(diǎn)改造后可以人為改變其底物專一性。此外，在進(jìn)一步缺失了 C端數(shù)個(gè)氨基酸 后，還能夠有效地提商突變蛋白的表達(dá)量。
[0200] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照 常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數(shù)是重量百分比和重量份數(shù)。
[0201] 實(shí)施例 1.糖基轉(zhuǎn)移酶 UGTPgl、UGTPglOl、UGTPgl02、UGTPglOO 和 UGTPgl03 在大 腸桿菌BL21 (DE3)中的表達(dá)與催化功能鑒定
[0202] 分別合成如SEQ ID N0:22和SEQ ID N0:23核苷酸序列的兩條引物。在合成的 引物SEQIDN0:22和SEQIDN0:23兩端分別設(shè)置BamHI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)，分別以 pMDT-UGTPgl、pMDT-UGTPgl01、pMDT-UGTPgl02、pMDT-UGTPg100 和 pMDT-UGTPgl03 為模板進(jìn) 行 PCR。
[0203] PCR 擴(kuò)增程序：94 °C 2min ;94 °C 15s，58 °C 30s，68 °C 1. 5min，共 35 個(gè)循環(huán)； 68°C 10min，降至10°C。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收后經(jīng)BamHI和Xhol雙酶切， 利用NEB公司的T4DNA連接酶連入同樣經(jīng)BamHI和Xhol雙酶切的pET28a載體（Novagen 公司）中。
[0204] 所獲得的重組質(zhì)粒命名為 pET28a-UGTPgl、pET28a-UGTPgl01、pET28a-UGTPgl02、 pET28a-UGTPg100 和pET28a-UGTPgl03。將這些重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3) (Novagen 公司）中構(gòu)建重組菌 pET28a-UGTPgl-BL2l、pET28a-UGTPgl01-BL 2l、 pET28a-UGTPgl02-BL21、pET28a-UGTPg100 -BL21和 pET28a-UGTPgl03-BL21。
[0205] 分別從平板挑取這5個(gè)重組菌株單克隆接種至含有50 μ g/mL卡那霉素的LB試管 中37°C 200rpm震蕩培養(yǎng)過夜，按1%的比例接種至50mL LB培養(yǎng)基中37°C 200rpm震蕩培 養(yǎng)至0D600為0. 6-0. 8,冰水浴冷卻菌液，加入終濃度為0.1 mM的IPTG，16°C下llOrpm誘導(dǎo) 18h。12000g，離心3min收集菌體，每克濕重菌體加入10mL PBS buffer(pH8. 0)重懸后裂 解菌體，12000g離心20min取上清作為粗酶液。同時(shí)誘導(dǎo)含有pET28a空載體的BL21菌株 pET28a-BL21制備粗酶液作為后續(xù)實(shí)施例的對(duì)照。
[0206] 糖基轉(zhuǎn)移酶催化人參皂苷苷元合成稀有人參皂苷的反應(yīng)體系如下：200 μ L的反 應(yīng)液中包含PBS buffer(pH8. 0)，5mM UDP-葡萄糖，0. 5mM原人參三醇（ΡΡΤ), 1%吐溫-20 和150 μ L粗酶液。40°C水浴條件下反應(yīng)4h，加入等體積的正丁醇終止反應(yīng)并進(jìn)行抽提，取 正丁醇相真空濃縮，產(chǎn)物溶解于甲醇中，HPLC結(jié)果如圖2。
[0207] 結(jié)果顯示UGTPgl催化PPT生成F1，即在C20-OH加上一個(gè)糖基；UGTPglOl催化PPT 的C20-OH糖基化先生F1，再在F1的C6-OH糖基化生成少量Rgl ;UGTPg100 催化PPT生成 Rhl，即在PPT的C6-OH加上一分子葡萄糖；而UGTPgl02和UGTPgl03沒有檢測(cè)到酶活性。
[0208] 實(shí)施例2.決定糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPgl和UGTPgl02催化C20-OH糖基化的關(guān)鍵氨基酸 位點(diǎn)
[0209] 通過SWISS-MODEL對(duì)UGTPgl進(jìn)行蛋白質(zhì)同源建模，并用PyMOL軟件（DeLano Scientific)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的分析。H15和D117是UGTPgl保守的催化活性位點(diǎn)，在這兩個(gè) 位點(diǎn)附近找到了 6個(gè)UGTPgl和UGTPgl02不同的氨基酸位點(diǎn)，即UGTPgl的L38、A40、F85、 T134、H144 和 Q388,分別對(duì)應(yīng)于 UGTPgl02 的 F38、S40、L85、I134、Y144 和 H388。將 UGTPgl 的這6個(gè)氨基酸分別突變?yōu)閁GTPgl02對(duì)應(yīng)的氨基酸，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn)行表 達(dá)，測(cè)定酶活性。
[0210] 合成分別具有序列表中SEQ ID N0:24和SEQ ID N0:25核苷酸序列的兩條引物。 以質(zhì)粒 pET28a_UGTPgl 為模板，利用 Stratagen 公司的 QuickChange II site-directed mutagenesis kit進(jìn)行UGTPgl的L38位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 °C 30s ; 95°C 30s，55°C lmin，68°C 7min，共 16 個(gè)循環(huán)；降至 10 °C。PCR 產(chǎn)物用 Dpnl 酶切，37°C水 浴反應(yīng)2h，取10 μ L轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10感受態(tài)。
[0211] 挑取單克隆并抽提質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證突變位點(diǎn)，所獲得的質(zhì)粒命名為 pET28a-UGTPgl-L38F。將質(zhì)粒 pET28a-UGTPgl-L38F 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 BL21 (DE3)， 構(gòu)建重組菌株pET28a-UGTPgl-L38F-BL21，誘導(dǎo)表達(dá)的步驟同實(shí)施例1。同樣，對(duì) 應(yīng)構(gòu)建 UGTPgl 突變后的重組質(zhì)粒 pET28a-UGTPgl-A40S，pET28a-UGTPgl-F85L， pET28a-UGTPgl-T143I，pET28a-UGTPgl-H144Y 和 pET28a-UGTPgl-Q388H，并構(gòu)建了 重組菌 株 pET28a-UGTPgl-A40S-BL21， pET28a-UGTPgl-F85L-BL21， pET28a-UGTPgl-T143I-BL21， pET28a-UGTPgl-H144Y-BL21 和 pET28a-UGTPgl-Q388H-BL21。定點(diǎn)突變的方法同上（點(diǎn)突 變引物序列分別為SEQ ID NO: 26-SEQ ID N0:35)，誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定的方法同實(shí)施例1。
[0212] 結(jié)果顯示：UGTPgl-L38F，UGTPgl-A40S，UGTPgl-F85L，UGTPgl-T143I 和 UGTPgl-Q388H仍具有催化C20-OH糖基化的酶活性，即催化PPT生成Fl，而UGTPgl-H144Y 沒有檢測(cè)到酶活性（圖3)。結(jié)果表明，H144對(duì)于UGTPgl的催化功能非常重要。
[0213] 合成分別具有序列表中SEQ ID N0:36和SEQ ID N0:37核苷酸序列的兩條引物。 以質(zhì)粒 pET28a_UGTPgl02 為模板，利用 Stratagen 公司的 QuickChange II site-directed mutagenesis kit對(duì)UGTPgl02的Y144位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了 UGTPgl02突變后的重組 質(zhì)粒 pET28a-UGTPgl02-Y144H和重組菌株 pET28a-UGTPgl02-Y144H-BL21。定點(diǎn)突變的方法 同上，誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定的方法同實(shí)施例2。UGTPgl02-Y144H獲得了催化C20-OH糖基化 的功能，即能夠催化PPT生成F1 (圖3)。
[0214] 結(jié)論：UGTPgl和UGTPgl02氨基酸序列的identity高達(dá)95. 4%，而UGTPgl具有 C20-OH糖基轉(zhuǎn)移酶活性，UGTPgl02沒有酶活性，而本實(shí)施例證明，是關(guān)鍵氨基酸的替換導(dǎo) 致UGTPgl02 了催化功能的丟失。
[0215] 實(shí)施例3.決定糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPglOO和UGTPgl03催化C6-OH糖基化的關(guān)鍵氨基 酸位點(diǎn)
[0216] UGTPglOO和UGTPgl03氨基酸序列的identity高達(dá)98. 7%，即兩者之間僅有6 個(gè)氨基酸的差異。通過SWISS-MODEL對(duì)UGTPglOO進(jìn)行蛋白質(zhì)同源建模，并用PyMOL軟件 (DeLano Scientific)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的分析。H15和D117是UGTPglOO保守的催化活性位 點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)附近找到了 2個(gè)UGTPglOO和UGTPgl03不同的氨基酸位點(diǎn)，即UGTPglOO 的A142和L186,分別對(duì)應(yīng)于UGTPgl02的T142和S186。另外兩個(gè)個(gè)氨基酸位點(diǎn)分別位于 C端和N端結(jié)構(gòu)域，在UGTPglOO中為G338和W205,對(duì)應(yīng)于UGTPgl03的R338和R205。將 UGTPglOO的這4個(gè)氨基酸分別突變?yōu)閁GTPgl03對(duì)應(yīng)的氨基酸，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中 進(jìn)行表達(dá)，測(cè)定酶活性。另外，有兩個(gè)氨基酸沒有仔細(xì)研究，因?yàn)樗麄儼被醾?cè)鏈的結(jié)構(gòu)和 性質(zhì)非常相似，相互替換可能對(duì)酶活的影響很小，即UGTPglOO中的V111和1349分別對(duì)應(yīng) 于 UGTPgl03 中的 111 1 和 V349。
[0217] 以質(zhì)粒 pET28a_UGTPg100 為模板，利用 Stratagen 公司的 QuickChange II site-directed mutagenesis kit 對(duì) UGTPglOO 的 A142, L186, W205 和 G338 位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn) 突變，構(gòu)建了 UGTPglOO 突變后的重組質(zhì)粒 pET28a-UGTPg100 -A142T, pET28a-UGTPg100 -Ll 86S, pET28a-UGTPg100 -W205R 和 pET28a-UGTPg100 -G338R(點(diǎn)突變引物序列分別為 SEQ ID N0:38-SEQ ID N0:45),以及重組菌株pET28a-UGTPg100 -A142T-BL21,pET28a-UGTPg100 -Ll 86S-BL21, pET28a-UGTPg100 -W205-BL21 和 pET28a-UGTPg100 -G338R-BL21。定點(diǎn)突變的方 法同上，誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定的方法同實(shí)施例1。
[0218] 結(jié)果如圖 4 所示，UGTPg100 -A142T, UGTPg100 -L186S 和 UGTPg100 -G338R 都失去了 C6-OH糖基轉(zhuǎn)移酶的活性；而UGTPg100 -W205R仍然保留著酶活性。
[0219] 以質(zhì)粒 pET28a_UGTPgl03 為模板，利用 Stratagen 公司的 QuickChange II site-directed mutagenesis kit 對(duì) UGTPglOO 的 T142, S186 和 R338 位分別進(jìn)行定 點(diǎn)突變（點(diǎn)突變引物序列分別為SEQ ID N0:46-SEQ ID勵(lì):47)，構(gòu)建了呢了?8103突 變后的重組質(zhì)粒 pET28a-UGTPgl03-T142A，pET28a-UGTPgl03-S186L 以及重組菌株 pET28a-UGTPgl03-T142A-BL21。定點(diǎn)突變的方法同上，誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定的方法同實(shí)施 例2。如圖4, UGTPgl03-T142A并沒有檢測(cè)到酶活性。
[0220] 以質(zhì)粒 pET28a-UGTPgl03-T142A 為模板，核苷酸序列 SEQ ID N0:48 和 SEQ ID N0:49為引物，利用Stratagen公司的QuickChange II site-directed mutagenesis kit對(duì) pET28a-UGTPgl03-T142A的S186位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建了 UGTPgl03雙突變后的重組質(zhì)粒 pET28a-UGTPgl03-T142A-S 186L,以及重組菌株 pET28a-UGTPgl03-T142A-S186L-BL21。類 似地，構(gòu)建了 UGTPgl03三突變的重組質(zhì)粒pET28a-UGTPgl03-T142A-S186L-R338G,以及重 組菌株pET28a-UGTPgl03-T142A-S186L-R338G-BL21。定點(diǎn)突變的方法同上，誘導(dǎo)表達(dá)和酶 活測(cè)定的方法同實(shí)施例1。
[0221] 結(jié)果如圖4, UGTPgl03-T142A-S186L也沒有催化C6-OH糖基化的功能，而 UGTPgl03-T142A-S186L-R338G獲得了催化C6-OH糖基化的功能，即能夠催化PPT生成Rhl。
[0222] 結(jié)論：UGTPglOO和UGTPgl03氨基酸序列的identity高達(dá)98. 7%，即兩者之間僅 有6個(gè)氨基酸的差異，而UGTPglOO具有C6-OH糖基轉(zhuǎn)移酶活性，UGTPgl03沒有酶活性，說 明關(guān)鍵氨基酸的替換導(dǎo)致UGTPgl03 了催化功能的丟失。
[0223] 實(shí)施例4.決定糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPgl和UGTPglOO底物區(qū)域?qū)Ｒ恍缘年P(guān)鍵氨基酸位 點(diǎn)和區(qū)域
[0224] UGTPgl 和 UGTPglOO 氨基酸序列的 identity 高達(dá) 84. 1 %，而 UGTPgl 具有 C20-OH 糖基轉(zhuǎn)移酶活性，UGTPglOO具有C6-OH糖基轉(zhuǎn)移酶活性，說明關(guān)鍵氨基酸的替換改變了其 底物專一性。通過SWISS-MODEL對(duì)UGTPgl和UGTPglOO進(jìn)行蛋白質(zhì)同源建模，并用PyMOL軟 件（DeLano Scientific)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的分析，如圖。H15和D117是UGTPgl和UGTPglOO 保守的催化活性位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)附近找到了 4個(gè)UGTPgl和UGTPglOO不同的氨基酸位 點(diǎn)，8卩1^了?81的厶10、113、!182和!1144，分別對(duì)應(yīng)于1^了?8100的￥10、？13、082和？144。將 UGTPgl的這4個(gè)氨基酸分別突變?yōu)閁GTPglOO對(duì)應(yīng)的氨基酸，并在大腸桿菌BL21 (DE3)中進(jìn) 行表達(dá)，測(cè)定酶活性。
[0225] 合成分別具有序列表中 SEQ ID N0:52 和 SEQ ID N0:53, SEQ ID N0:54 和 SEQ ID N0:55，SEQ ID N0:56 和 SEQ ID N0:57，SEQ ID N0:58 和 SEQ ID N0:59 核苷酸序 列作為引物。以質(zhì)粒pET28a_UGTPgl為模板，利用Stratagen公司的QuickChange II site-directed mutagenesis kit 對(duì) UGTPgl 的 A10、113、H82 和 H144 位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn) 突變，構(gòu)建了 UGTPgl 突變后的重組質(zhì)粒 pET28a-UGTPgl-A10V、pET28a-UGTPgl-113F、 pET28a-UGTPgl-H82C 和 pET28a-UGTPgl-H144F,以及重組菌株 pET28a-UGTPgl-A10V-BL21、 pET28a-UGTPgl-I13F-BL21、pET28a-UGTPgl-H82C-BL21 和 pET28a-UGTPgl-H144F-BL21。 定點(diǎn)突變的方法同上，誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定的方法同實(shí)施例2。如圖5, UGTPgl-AlOV， UGTPgl-I13F 和 UGTPgl-H82C 的 C20-OH 糖基轉(zhuǎn)移酶的活性降低了；UGTPgl-H82C 和 UGTPgl-H144F獲得了催化C6-OH糖基化的功能，但UGTPgl-H144F催化C6-OH糖基化的活性 很弱。
[0226] 實(shí)施例5.糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPgl，UGTPgl01和UGTPglOO的C末端截短促進(jìn)可溶表達(dá)
[0227] 糖基轉(zhuǎn)移酶UGTPgl，UGTPglOl和UGTPglOO在大腸桿菌中表達(dá)主要以包涵體的形 式存在，可溶表達(dá)量低。在N端截短5個(gè)氨基酸后，UGTPgl，UGTPglOl和UGTPglOO對(duì)于底 物PPT都沒有酶活性。在C端截短5個(gè)氨基酸后，UGTPgl，UGTPglOl和UGTPglOO對(duì)于底物 PPT的酶活力降低，但可溶表達(dá)量卻顯著提高。在C端截短2個(gè)、4個(gè)氨基酸后，結(jié)果發(fā)現(xiàn) UGTPgl和UGTPglOl的可溶表達(dá)量相對(duì)于野生型至少有50%提高（圖6, A)，但酶活力沒有 明顯改變（圖6, B)。雖然在UGTPglOO的C末端截短2個(gè)、4個(gè)氨基酸后，其可溶表達(dá)量相 對(duì)于野生型也至少提高了 50%，但是其酶活力卻顯著降低（圖6)。
[0228] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種糖基轉(zhuǎn)移酶的突變蛋白，其特征在于，所述的突變蛋白為非天然蛋白，且所述突 變蛋白具有糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性，并且所述突變蛋白含有與酶催化活性相關(guān)的W下核必氨 基酸： 第142位氨基酸為A ; 第144位氨基酸為H或F ;和 第339位氨基酸為G ; 其中，所述氨基酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO. : 13所示的序列。2. 如權(quán)利要求1所述的突變蛋白，其特征在于，所述糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性包括催化W 下一種或多種反應(yīng)： (a)將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)H聰類化合物的C-20位的居基； 化）將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)H聰類化合物的C-6位的居基。3. 如權(quán)利要求1或2所述的突變蛋白，其特征在于，所述的糖基轉(zhuǎn)移酶催化活性包括催 化W下一種或多種反應(yīng)： (A)其中，所述式（I)化合物是原人參H醇（protopanaxatriol)，式（II)化合物為人參皂 巧 Fl (20-0-目-D-glucopyranos}d-20 (巧-protopanaxatriol)，所述的突變蛋白包括沈Q ID NO. :6-7.9-13 ； (B)其中，所述式（I)化合物是原人參H醇（protopanaxatriol)，式（III)化合物為人參皂 巧 Rhl(6-0- 0 -D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxatriol)，；或式（II)化合物是人參皂巧 Fl (2〇-〇-目-D-glucopyranos}d-20 (巧-protopanaxatri 〇1)，式（IV)化合物是人參皂巧 Rgl (6-0-目-(D-glucopyranos}d) -20-0-目-值-glucopyra nosyl)-protop曰n曰X曰triol)； 所述的突變蛋白包括沈Q ID NO. :6、8、11-12、16; 腳其甲，所還巧（i)化含物是原人參蘭醉化rotopanaxatrioi)，所還巧（ii)化含物是 人參皂巧 Fl (2〇-〇-目-D-glucopyranos}d-20 (巧-protopanaxatriol)，式（IV)化合物為人 參皂巧 Rgl (6-0- 0 -值-glucopyranosyl) -20-0- 0 -值-glucopyranosyl) -protopanaxatri 〇1)，所述的突變蛋白包括沈Q ID NO. :6、11-12 ; 卿其中，所述式（I)化合物是原人參H醇（protopanaxatriol)，所述式（II)化合物是人 參皂巧 Fl (20-0-目-D-glucopyranos}d-20(巧-protopanaxatriol)，式（III)化合物為人 參皂巧化1 (6-〇-目-D-glucopyranos}d-20 (巧-protopanaxatriol)，所述的突變蛋白包括 沈Q ID NO. :11-12。4. 如權(quán)利要求1所述的蛋白，其特征在于，所述的突變蛋白還含有W下一個(gè)或多個(gè)氨 基酸： 第10位氨基酸為V; 第13位氨基酸為F ; 第82位氨基酸為C ;和 第186位氨基酸為L(zhǎng)。5. -種多核巧酸，其特征在于，所述的多核巧酸編碼權(quán)利要求1-3任一所述的突變蛋 白。6. -種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求5所述的多核巧酸。7. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的載體，或其基因 組中整合有權(quán)利要求5所示的多核巧酸。8. -種改造糖基轉(zhuǎn)移酶的方法，其特征在于，包括步驟： (i) 將所述糖基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO. : 13所示的序列進(jìn)行同源性比對(duì)； (ii) 篩選出步驟（i)中與SEQ ID NO. :13所示序列同源性至少為80%的序列；較佳地 至少為85% -90 %，更佳地至少為95 %，最佳地至少為98% ; (iii)對(duì)步驟（ii)中篩選出的序列進(jìn)行改造，改造后的糖基轉(zhuǎn)移酶含有W下核必氨基 酸： 第142位氨基酸為A ; 第144位氨基酸為H或F ;和 第339位氨基酸為G ; 其中，所述氨基酸位置編號(hào)基于SEQ ID NO. : 13所示的序列， 且所述的核必氨基酸至少有一個(gè)是經(jīng)人為改造的。9. 權(quán)利要求1所述的突變蛋白的用途，其特征在于，所述的突變蛋白用于催化W下一 種或多種反應(yīng)，或被用于制備催化W下一種或多種反應(yīng)的催化制劑： (a)將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)H聰類化合物的C-20位的居基； 化）將來自糖基供體的糖基轉(zhuǎn)移到四環(huán)H聰類化合物的C-6位的居基。10. -種進(jìn)行糖基催化反應(yīng)的方法，其特征在于，包括步驟：在權(quán)利要求1所述突變蛋 白的存在下，進(jìn)行糖基化反應(yīng)。11. 一種提高糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量的方法，其特征在于，包括步驟： (i) 將所述糖基轉(zhuǎn)移酶與SEQ ID NO. : 13所示的序列進(jìn)行同源性比對(duì)； (ii) 篩選出步驟（i)中與SEQ ID NO. : 13所示序列同源性至少為80%的序列；較佳地 至少為85% -90 %，更佳地至少為95 %，最佳地至少為98% ; (iii) 對(duì)步驟（ii)中篩選出的序列進(jìn)行C端1-5個(gè)氨基酸的缺失。12. 權(quán)利要求7所述宿主細(xì)胞的用途，其特征在于，用于制備糖基轉(zhuǎn)移酶，或作為催化 細(xì)胞、或生產(chǎn)糖基化后的四環(huán)H聰類化合物。13. -種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于，包括步驟；將權(quán)利要求7所述的宿主細(xì) 胞再生為植物，其中，所述的宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK105985938SQ201510051992
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年1月30日
【發(fā)明人】周志華, 魏維, 嚴(yán)興, 王平平, 魏勇軍, 楊成帥
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院