一種混合菌生物傳感器檢測污染物生物毒性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種混合菌生物傳感器檢測污染物生物毒性的方法，包括如下步驟：1)制備微生物菌液，其包括酵母菌液、大腸桿菌菌液和枯草芽孢桿菌菌液；2)將所述微生物菌液與混合溶膠混合均勻后涂覆于柔性薄膜上，制得微生物薄膜；3)將所述微生物薄膜組裝到電極上，即制得混合菌生物傳感器；4)檢測待測樣品；5)評價待測樣本的生物毒性。所述混合菌生物傳感器，可用于評價重金屬、酚和/或農藥的單一毒性及聯合毒性。檢測具有便捷快速的特點，同時可以避免單一菌種對有毒物質敏感性具有差異的限制。不僅提高水體復合污染體系綜合毒性分析的靈敏度，而且能反映污染物毒性的真實情況。
【專利說明】
一種混合菌生物傳感器檢測污染物生物毒性的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物毒性檢測領域，具體地涉及由真菌、革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性 菌組成的混合菌作為受試微生物制備成的混合菌生物傳感器，對環(huán)境污染物進行生物毒性 檢測。
【背景技術】
[0002] 隨著工農業(yè)生產的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，人工合成化學物質的種類及 用量急劇增加，農藥、化肥、重金屬、工業(yè)廢水和生活垃圾等大量排入環(huán)境，對環(huán)境造成了嚴 重污染。因此檢測環(huán)境中污染物的生物毒性在判斷環(huán)境的生物安全程度、環(huán)境治理和農業(yè) 種植安全方面都有著重要的作用。
[0003] 現在存在利用單一微生物檢測環(huán)境污染物生物毒性的方法，然而利用單一微生物 細胞進行生物毒性檢測時，易受到微生物種類的影響，因為不同種類的微生物對污染物毒 性的敏感性不同，所以基于單一菌株的毒性評價具有不能客觀反映污染物真實毒性作用的 局限性。另外，現有的活性污泥法評價生物毒性有一定局限性，因為不同地點、不同時間采 集的活性污泥菌群組成差異較大，使得毒性檢測結果沒有對比性。
[0004] 另外，在自然環(huán)境中，污染不僅由一種物質導致，存在兩種或多種化學物質時，不 同物質之間的生物毒性會產生協(xié)同作用，即會引起與各物質單獨作用時完全不同的毒性反 應。迄今為止，大多數生物毒性檢測都是針對單一污染物的實驗，現行的水質標準也是根據 單一金屬的毒性試驗確定的，不能有效地反映出多種有毒物質的協(xié)同毒性效應。因此研究 兩種或多種化學品的聯合毒性效應逐漸成為環(huán)境毒理學研究的重要方向，它能為環(huán)境標準 的制定和生態(tài)風險評價提供更可靠的依據。
[0005] 因此，需要提供一種檢測環(huán)境污染物的方法，其能夠檢測環(huán)境污染物的生物毒性， 同時可避免單一微生物對毒性物質的敏感程度的局限性，還能客觀反映多種毒性物質的毒 性協(xié)同作用。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的在于提供一種混合菌生物傳感器檢測污染物生物毒性的方法， 包括如下步驟：
[0007] 1)制備微生物菌液，其包括酵母菌液、大腸桿菌菌液和枯草芽孢桿菌菌液；
[0008] 2)將所述微生物菌液與混合溶膠混合后涂覆于柔性薄膜上，制得微生物薄膜；
[0009] 3)將所述微生物薄膜組裝到電極上，即制得混合菌生物傳感器；
[0010] 4)檢測待測樣品；
[0011] 5)評價待測樣本的生物毒性。
[0012] 其中制備微生物菌液的方法為：
[0013] 1)將微生物接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期；
[0014] 2)收集菌體，獲得菌體沉淀；
[0015] 3)洗滌菌體沉淀；
[0016] 4)用分散液分散菌體沉淀，制成微生物分散液；
[0017] 5)按比例混合不同種類的微生物分散液，制成微生物菌液。
[0018] 上述方法中，培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基為本領域所公知的適于微生物生長的培養(yǎng)基， 例如大腸桿菌接種的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基、S0B培養(yǎng)基或S0C培養(yǎng)基等，優(yōu)選LB培養(yǎng)基；所 述枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或LBG培養(yǎng)基，優(yōu)選為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng) 基；所述酵母菌的培養(yǎng)基為YH)培養(yǎng)基、YPED培養(yǎng)基或YPEG培養(yǎng)基等，優(yōu)選YPED培養(yǎng)基。
[0019] 進一步地，微生物的培養(yǎng)條件也是本領域公知的，包括但不限于，大腸桿菌的培養(yǎng) 條件為37°C于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16-24h ;枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件為37°C于牛肉膏蛋白胨 培養(yǎng)基培養(yǎng)16-24小時；酵母菌的培養(yǎng)條件為30°C于YPED培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-30小時。
[0020] 在上述方法中，優(yōu)選地，用離心法收集培養(yǎng)的菌體，以獲得菌體沉淀。
[0021] 菌體沉淀的洗滌可采用常規(guī)的緩沖液，以去除菌體培養(yǎng)中可能影響后續(xù)測試結果 的物質。如磷酸緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、HEPEs緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液或氯化鈉溶液。 優(yōu)選地，所述洗滌溶液為0. 85%的氯化鈉溶液、PBS溶液、TBS溶液或TBE溶液。
[0022] 優(yōu)選地，所述分散液為水溶液、氯化鈉溶液或培養(yǎng)基，優(yōu)選為氯化鈉溶液，更優(yōu)選 為0. 85%的氯化鈉溶液。
[0023] 微生物菌液中大腸桿菌：枯草芽孢桿菌：酵母菌為1-3:1-3:1 ;優(yōu)選地，大腸桿菌： 枯草芽孢桿菌：酵母菌為2:2:1。
[0024] 所述混合溶膠為聚乙烯醇（PVA)溶膠、聚乙烯醇-4-乙基吡啶接枝聚合物溶膠、聚 乙烯醇-硫酸鈉溶膠或聚乙烯醇-海藻酸鹽混合溶膠，優(yōu)選為聚乙烯醇-海藻酸鹽混合溶 膠。
[0025] 所述柔性薄膜為聚氨基甲酸酯薄膜、聚二甲基硅氧烷薄膜、聚氯乙烯薄膜或聚對 苯二甲酸乙二醇酯薄膜，優(yōu)選為聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜。
[0026] 所述電極為鉑電極、玻碳電極、金剛石電極，優(yōu)選為鉑電極。
[0027] 所述混合菌生物傳感器可置于4°C保存，保存時間為2-6小時。
[0028] 所述待測樣本檢測的方法包括如下步驟：
[0029] 1)加入呼吸介質；
[0030] 2)施加電壓，并檢測電流。
[0031] 3)加入苯醌溶液，并檢測電流，獲得第一電流強度；
[0032] 4)加入待測樣本；
[0033] 5)檢測電流，獲得第二電流強度；
[0034] 所述呼吸介質包括乳酸鈉、琥珀酸、葡萄糖和氯化鈉，優(yōu)選為10mM乳酸鈉、10mM琥 珀酸鈉、10mM葡萄糖和0. 85%氯化鈉。
[0035] 所施加的電壓為 0· 2V-0. 7V (vs. Ag/AgCl)，優(yōu)選為 0· 3V (vs. Ag/AgCl)。
[0036] 所述苯醌溶液最終濃度為0.1 mM-ImM，優(yōu)選為0. 4mM。
[0037] 用抑制率評價待測樣本的生物毒性，抑制率的計算公式如下：
[0038] 抑制率（％ ) = (l-iyiD X100%
[0039] 其中，L是第一電流強度，I 2是第二電流強度。
[0040] 通過檢測不同濃度的待測樣本可得到相應的抑制率，以待測樣本的濃度對抑制率 進行曲線擬合，抑制率為50%時的待測樣本的濃度定義為該待測樣本的IC50。并將IC50 計為被測物質的1個毒性單位（TU)。
[0041] 本發(fā)明檢測原理見圖1。
[0042] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0043] 本發(fā)明以混合菌液作為受試微生物，制備混合菌生物傳感器，可用于評價重金屬、 酚和/或農藥的單一毒性及聯合毒性。檢測具有便捷快速的特點，同時可以避免單一菌種 對毒物敏感性具有差異的限制。不僅提高水體復合污染體系綜合毒性分析的靈敏度，而且 能反映污染物毒性的真實情況。
【附圖說明】
[0044] 下面結合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0045] 圖1示出基于混合菌生物傳感器檢測有毒物質生物毒性的基本原理圖。
[0046] 圖2示出混合菌生物傳感器檢測Cu2+生物毒性的結果。
[0047] 圖3示出混合菌生物傳感器檢測Cd2+生物毒性的結果。
[0048] 圖4示出混合菌生物傳感器檢測DCP生物毒性的結果。
[0049] 圖5示出混合菌生物傳感器檢測乙酰甲胺磷生物毒性的結果。
[0050] 圖6示出混合菌生物傳感器檢測莠滅凈生物毒性的結果。
[0051] 圖7示出混合菌生物傳感器檢測實際廢水生物毒性的結果。
【具體實施方式】
[0052] 為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結合優(yōu)選實施例和附圖對本發(fā)明做進一步的說 明。附圖中相似的部件以相同的附圖標記進行表示。本領域技術人員應當理解，下面所具 體描述的內容是說明性的而非限制性的，不應以此限制本發(fā)明的保護范圍。
[0053] 實施例1
[0054] 培養(yǎng)基的配制：
[0055] 釀酒酵母的培養(yǎng)基（YEPD)配制方法如下：取lg酵母膏和2g蛋白胨溶于90ml超 純水中，取lg葡萄糖溶于l〇ml超純水中，于120°C高壓滅菌鍋中分別滅菌20min，自然冷卻 后混合即可使用。
[0056] 大腸桿菌的培養(yǎng)基（LB)配制方法如下：取0.5g牛肉膏、lg蛋白胨和0.5g氯化鈉 溶于100mL超純水中，調節(jié)pH至7. 0-7. 4,于高壓蒸汽滅菌中120°C滅菌20min，自然冷卻后 即可使用。
[0057] 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配置如下：取lg蛋白胨、0. 3g牛肉提取物和0. 5g氯化鈉 溶于100mL超純水中，調節(jié)pH至7. 0，于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，自然冷卻。
[0058] 微生物的培養(yǎng)：
[0059] 向YPED培養(yǎng)基中接種釀酒酵母（S288C)，在30 °C恒溫水浴培養(yǎng)24h，搖床速度 200rpm ；
[0060] 向LB培養(yǎng)基接種大腸桿菌（ATCC 25922)，培養(yǎng)條件為37°C恒溫水浴培養(yǎng)16h，搖 床速度180rpm ;
[0061] 向枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)中接種枯草芽孢桿菌（菌號：1. 1086)，培養(yǎng)條件是條件為 37°C恒溫水浴培養(yǎng)24h，搖床速度180rpm ;
[0062] 即將菌體培養(yǎng)至對數生長期。
[0063] 菌體收集
[0064] 酵母菌的收集：將培養(yǎng)所得的酵母菌離心分離，轉速為lOOOOrpm，離心10min，用 PBS將離心所得的菌體沉淀清洗兩次，然后將清洗后的菌體沉淀重新懸浮在PBS中，得到一 定濃度的菌液待用；
[0065] 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的收集：
[0066] 第一次離心分離所采用的轉速是6000印111，時間為61]^11。隨后用0.85%氯化鈉溶 液將菌體沉淀清洗兩次，兩次清洗采用的轉速是5000rpm，時間為5min。最后將清洗后得到 菌體沉淀分散到0. 85 %氯化鈉溶液中，得到菌體分散液。
[0067] 菌液混合：
[0068] 將三種菌體混合配制成混合菌液，混合比例為大腸桿菌：枯草芽孢桿菌：酵母菌 =2:2:1〇
[0069] 生物薄膜的制備：
[0070] 取 100 μ 1 10 % (w/v) PVA 溶膠（皂化值 98 %，聚合度 2400)，10 μ 1 的 1. 0M 硫酸 鈉，40 μ 1 0. 8 % (w/v)海藻酸鈉和50 μ 1混合菌懸浮液混合均勻，將所得到的混合液旋涂 于聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜上，將涂覆有混合菌的聚對苯二甲酸乙二醇酯膜浸入到2% (w/v) CaCl#，在20-25°C條件下保持15-20min，干燥后即得到一次性使用的微生物薄膜， 放入4 C冰箱中冷減待用。
[0071] 生物毒性的檢測方法：
[0072] 在室溫條件下，將生物膜固定在鉑電極表面，組裝成混合菌生物傳感器，向混合菌 生物傳感器中加入l〇ml pH = 7. 0的呼吸基質，所述呼吸介質含有10mM乳酸鈉、10mM琥珀 酸鈉、10禮葡萄糖和0.85%氯化鈉，施加0.3￥(^^8/^8(：1)的電壓，采用計時電流法對電 流大小進行實時的監(jiān)測；待體系穩(wěn)定5min后加入100 μ 1苯醌溶液，其中苯醌的最終濃度 為0.4mM，待電流信號穩(wěn)定，記錄第一電流值（1上然后加入毒物，檢測并記錄第二電流值 (1 2)。利用抑制率計算生物毒性，且根據IC50來判斷生物毒性的強弱。將IC50計為被測 物質的1個毒性單位（TU)。
[0073] 聯合生物毒性的檢測方法：
[0074] 將毒性單位相同的兩種毒物按1:1混合制成混合樣本，按照所述生物毒性的 檢測方法檢測該混合樣本的抑制率，并繪制濃度-抑制率曲線，獲得該混合樣本的實測 Ι〇50(Κ50^)。通過比較預期IC50值（IC50exp)和實測值Κ50(Κ50^)的大小來判斷聯 合毒性的類型。其中預期IC50exp的計算方法為：將兩種單一毒物的IC50值相加。當 1〇50^>扣50_就說明兩種毒物的生物毒性具有拮抗作用；預期IC50 ΜΡ〈Κ50^說明兩種毒 物的生物毒性具有協(xié)同作用；IC50exp= ，說明兩種毒物的生物毒性具有相加作用。拮 抗作用是聯合生物毒性小于各化學物質單獨作用于機體時產生的生物毒性的總和，即是某 一化學物質能夠減弱另一化學物質的生物毒性；協(xié)同作用則是聯合生物毒性遠遠超過各化 學物質單獨作用于機體時產生的生物毒性的總和；相加作用是指多種環(huán)境化學物質同時作 用于機體所產生的聯合生物毒性是各化學物質單獨作用于機體時產生的生物毒性的總和。
[0075] 實施例1 :檢測Cu2+的生物毒性
[0076] 制備10、15、20、25、30mg/L的Cu2+溶液，檢測不同濃度的Cu 2+的生物毒性并根據公 式計算其抑制率，得到濃度-抑制率曲線。計算得到Cu2+的IC50。結果見表1和圖2。
[0077] 實施例2 :檢測Cd2+的生物毒性
[0078] 制備10、15、20、25、30mg/L的Cd2+溶液，檢測不同濃度的Cd 2+的生物毒性并根據公 式計算其抑制率，得到濃度-抑制率曲線。計算得到Cd2+的IC50。結果見表1和圖3。
[0079] 實施例3 :檢測3, 5-二氯苯酚（DCP)的生物毒性
[0080] 制備10、15、20、25、30mg/L (濃度）的3, 5-二氯苯酸，按照實施例1的方法檢測不 同濃度的3, 5-二氯苯酚（DCP)的生物毒性，并根據公式計算其抑制率，得到濃度-抑制率 曲線。計算得到DCP的IC50。結果見表1和圖4。
[0081] 實施例4 :檢測乙酰甲胺磷的生物毒性
[0082] 制備10、20、30、40、5011^/1(濃度）的農藥殺蟲劑乙酰甲胺磷，按照實施例1的方 法檢測不同濃度的乙酰甲胺磷的生物毒性，并根據公式計算其抑制率，得到濃度-抑制率 曲線。計算得到乙酰甲胺磷的IC50。結果見表1和圖5。
[0083] 實施例5 :檢測除草劑莠滅凈的生物毒性
[0084] 制備10、15、20、30、4〇11^/1(濃度）的除草劑莠滅凈，按照實施例1的方法檢測不 同濃度的莠滅凈的生物毒性，并根據公式計算其抑制率，得到濃度-抑制率曲線。計算得到 Cd2+的IC50。計算得到莠滅凈的IC50。結果見表1和圖6。
[0085] 表1:單一毒物的IC50值
[0086]
[0087] 實施例6 :對實際廢水的生物毒性檢測
[0088] 對垃圾填埋場廢水、電鍍廢水和實驗室有機廢水的生物毒性進行檢測，檢測方法 同以上實施例1，其抑制率分別為39. 83%，48. 15%和51. 77%，結果見圖7。
[0089] 實施例7 :檢測Cu2+和Cd 2+的聯合生物毒性
[0090] 將毒性單位相同的Cu2+和Cd 2+按1:1混合制成Cu 2+-Cd2+混合樣本，所選取的濃度 梯度為20% TU、40% TU、60% TU、80% TU、100% TU、120% TU，按照聯合生物毒性的檢測方 法檢測該混合樣本的抑制率，并繪制濃度-抑制率曲線，獲得Cu2+-Cd 2+混合樣本的IC50 _， 并且對比扣50_和IC50 exp的大小，確定Cu 2+和Cd 2+的聯合毒性類型。結果見表2。
[0091] 實施例8 :檢測Cu2+和DCP的聯合生物毒性
[0092] 按照實施例7的方法制備Cu2+_DCP混合樣本，按照聯合生物毒性的檢測方法檢測 該混合樣本的抑制率，并繪制濃度-抑制率曲線，獲得Cu 2+_DCP混合樣本的Κ50??；3，并且對 比扣50_和IC50 exp的大小，確定Cu 2+和DCP的聯合毒性類型。結果見表2。
[0093] 實施例9 :檢測乙酰甲胺磷和DCP的聯合生物毒性
[0094] 按照實施例7的方法制備乙酰甲胺磷-DCP混合樣本，按照聯合生物毒性的檢測方 法檢測該混合樣本的抑制率，并繪制濃度-抑制率曲線，獲得乙酰甲胺磷-DCP混合樣本的 1〇50如，并且對比扣50_和IC50 exp的大小，確定乙酰甲胺磷和DCP的聯合毒性類型。結果 見表2。
[0095] 實施例10 :檢測乙酰甲胺磷和Cu2+的聯合生物毒性
[0096] 按照實施例7的方法制備乙酰甲胺磷-Cu2+混合樣本，按照聯合生物毒性的檢測方 法檢測該混合樣本的抑制率，并繪制濃度-抑制率曲線，獲得乙酰甲胺磷_Cu 2+混合樣本的 1〇50如，并且對比扣50_和IC50 exp的大小，確定乙酰甲胺磷和Cu 2+的聯合毒性類型。結果 見表2。
[0097] 實施例11 :檢測乙酰甲胺磷和莠滅凈的聯合生物毒性
[0098] 按照實施例7的方法制備乙酰甲胺磷-莠滅凈混合樣本，按照聯合生物毒性的檢 測方法檢測該混合樣本的抑制率，并繪制濃度-抑制率曲線，獲得乙酰甲胺磷-莠滅凈混合 樣本的Κ50 ?。?，并且對比扣50^和IC50exp的大小，確定乙酰甲胺磷和莠滅凈的聯合毒性類 型。結果見表2。
[0099] 表2混合毒物的毒性檢測及其作用類型
[0100]
[0101] 實施例12 :單一菌和混合菌生物傳感器檢測生物毒性的對比
[0102] 利用單一大腸桿菌、單一枯草芽孢桿菌和單一釀酒酵母菌制備單菌種生物傳感 器，并分別對l〇mg/L的DCP，10mg/L的Cu 2+和25mg/L的莠滅凈的生物毒性進行檢測。將實 驗結果分別與實施例3、實施例1和實施例5的結果進行對比，結果見表3。
[0103] 單菌種生物傳感器的制備方法與混合菌生物傳感器的制備方法基本相同，不同之 處僅在于，單菌種生物傳感器只含有一種菌體，即含有大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌中 的一種，而混合菌生物傳感器含有三種菌，即大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌。另外 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的菌體培養(yǎng)、菌體收集、菌體分散液的制備同實施例1。測 試結果如表3。由下表可知，單菌種生物傳感器的檢測靈敏度無論是對有機毒物DCP、重金 屬離子Cu 2+還是有機農藥莠滅凈均不如混合菌生物傳感器。
[0104] 表3:混合菌
[0105]
[0106] 顯然，本發(fā)明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對 本發(fā)明的實施方式的限定，對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可 以做出其它不同形式的變化或變動，這里無法對所有的實施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā) 明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之列。
【主權項】
1. 一種混合菌生物傳感器檢測污染物生物毒性的方法，其特征在于，包括如下步驟： 1) 制備微生物菌液，其包括酵母菌液、大腸桿菌菌液和枯草芽孢桿菌菌液； 2) 將所述微生物菌液與混合溶膠混合均勻后涂覆于柔性薄膜上，制得微生物薄膜； 3) 將所述微生物薄膜組裝到電極上，即制得混合菌生物傳感器； 4) 檢測待測樣品； 5) 評價待測樣本的生物毒性。2. 根據權利要求1所述的檢測污染物生物毒性的方法，其特征在于，制備微生物菌液 的方法為： 1) 將微生物接種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數生長期； 2) 收集菌體，獲得菌體沉淀； 3) 洗滌菌體沉淀； 4) 用分散液分散菌體沉淀，制成微生物分散液； 5) 按比例混合不同種類的微生物分散液，制成微生物菌液。3. 根據權利要求1所述的檢測污染物生物毒性的方法，其特征在于，大腸桿菌：枯草芽 孢桿菌：酵母菌為1-3:1-3:1。4. 根據權利要求1所述的檢測污染物生物毒性的方法，其特征在于，大腸桿菌：枯草芽 孢桿菌：酵母菌為2:2:1。5. 根據權利要求1所述的混合菌生物傳感器方法，其特征在于，混合溶膠為聚乙烯醇 溶膠、聚乙烯醇-4-乙基吡啶接枝聚合物溶膠、聚乙烯醇-硫酸鈉溶膠或聚乙烯醇-海藻酸 鹽混合溶膠。6. 根據權利要求1所述的檢測污染物生物毒性的方法，其特征在于，所述柔性薄膜為 聚氨基甲酸酯薄膜、聚二甲基硅氧烷薄膜、聚氯乙烯薄膜或聚對苯二甲酸乙二醇酯薄膜。7. 根據權利要求1所述的檢測污染物生物毒性的方法，其特征在于，所述待測樣本檢 測方法包括如下步驟： 1) 加入呼吸介質； 2) 施加電壓，并檢測電流； 3) 加入苯醌溶液，并檢測電流，獲得第一電流強度； 4) 加入待測樣本； 5) 檢測電流，獲得第二電流強度。8. 根據權利要求1所述的檢測污染物生物毒性的方法，其特征在于，用抑制率評價待 測樣本的生物毒性，所述抑制率的計算公式如下： 抑制率（％ ) = (1-12/%) X100% 其中，Ii是第一電流強度，12是第二電流強度。
【文檔編號】C12R1/865GK105986000SQ201510058337
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月4日
【發(fā)明人】只金芳, 高冠岳, 錢俊
【申請人】中國科學院理化技術研究所