一種靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法，其中靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明熒光探針分子水溶性良好，具有較小的毒性。其單光子激發(fā)波長(zhǎng)為540nm，雙光子激發(fā)波長(zhǎng)為800nm，均可以靶向細(xì)胞核仁，可以用于活體細(xì)胞的顯微成像。
【專利說明】
一種靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及 其合成方法 一、
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物熒光探針及其合成方法，具體地說是一種靶向細(xì)胞核仁的噻 吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，隨著人們生活質(zhì)量的提高，健康問題成了人們?cè)絹碓疥P(guān)注的主題?；瘜W(xué)家 希望合成一些生物相容性的發(fā)光小分子，以此作為熒光探針，在細(xì)胞、組織或活體中實(shí)現(xiàn)對(duì) 疾病的可追蹤性、可視性和可治療性。
[0003] 小分子熒光探針因分子量小、合成方法簡(jiǎn)單、溶解性好等優(yōu)點(diǎn)，有關(guān)的研發(fā)與應(yīng)用 探索工作廣受關(guān)注。
[0004] 相關(guān)資料顯示，核仁是細(xì)胞核內(nèi)生產(chǎn)核糖體的場(chǎng)所，所有真核生物的核糖體RNA (rRNA)的轉(zhuǎn)錄都是在核仁中完成，其過程是由rDNA轉(zhuǎn)錄成rRNA，rRNA與來自細(xì)胞質(zhì)的蛋白 質(zhì)結(jié)合，進(jìn)而加工、改造成核糖體的前體，輸送到細(xì)胞質(zhì)。細(xì)胞核仁組成成分復(fù)雜，包括 rDNA，rRNA和核糖核蛋白等。核仁是rRNA基因存儲(chǔ)、rRNA合成加工以及核糖體亞單位的裝配 場(chǎng)所。而DNA是基因的基本單元，因此，核仁及其功能的研究具有非常重要的意義。
[0005] 隨著生物顯影材料的發(fā)展，雙光子熒光探針引起了人們的廣泛關(guān)注。雙光子顯微 成像的激發(fā)波長(zhǎng)較長(zhǎng)，具有較低激發(fā)能量和較強(qiáng)的穿透性，而且光損傷較小。顯然，制備激 發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)，毒性較小，生物相容性較好的小分子熒光探針，定能促進(jìn)細(xì)胞顯影成像技術(shù)的 發(fā)展。
[0006]
【申請(qǐng)人】對(duì)本申請(qǐng)的主題進(jìn)行了如下的文獻(xiàn)檢索：
[0007] 1、 http://scholar.glgoo.org/網(wǎng)檢索結(jié)果：（2016/4/28)
[0008]
[0009]
[0010] 2、中國(guó)知網(wǎng)檢索結(jié)果：
[0011] 檢索方式一：
[0012] 篇名-靶向細(xì)胞核仁的吡啶鹽生物顯影材料及其合成方法:無相關(guān)文獻(xiàn)。
[0013] 篇名-靶向細(xì)胞核仁的小分子噻吩基吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法:無相關(guān) 文獻(xiàn)。
[0014] 篇名-靶向細(xì)胞核仁的小分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方 法:無相關(guān)文獻(xiàn)。
[0015] 檢索方式二：
[0016] 全文-靶向細(xì)胞核仁的六氟磷酸吡啶鹽:8篇相關(guān)文獻(xiàn)，但均與靶向細(xì)胞核仁的小 分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法無關(guān)。
[0017] 全文-靶向細(xì)胞核仁的小分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方 法:29篇相關(guān)文獻(xiàn)，但均與靶向細(xì)胞核仁的小分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及 其合成方法無關(guān)。 三、
【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 本發(fā)明旨在提供一種靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其 合成方法，所要解決的技術(shù)問題是遴選合適的分子結(jié)構(gòu)使其可以作為靶向細(xì)胞核仁的熒光 探針。
[0019] 本發(fā)明基于吡啶為母體，引入乙烯、富電子的噻吩環(huán)構(gòu)筑大的共輒體系，借助六氟 磷酸根調(diào)節(jié)化合物的結(jié)晶性，設(shè)計(jì)合成了水溶性好的陽離子型有機(jī)小分子熒光探針，期望 其在生物顯影方面有所應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明熒光探針分子水溶性良好，具有較小的毒性。其單光子激發(fā)波長(zhǎng)為540nm， 雙光子激發(fā)波長(zhǎng)為800nm，均可以靶向細(xì)胞核仁，可以用于活體細(xì)胞的顯微成像。
[0021] 本發(fā)明靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針，其結(jié)構(gòu)式為：
[0022]
[0023]本發(fā)明靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針的合成方法，包括如 下步驟：
[0024] 1、4_甲基-N-甲基吡啶碘鹽Μ的合成
[0025] 50mL圓底燒瓶中加入43.2g(0.3moL)碘甲烷，稱取18.6g(0.2moL)4-甲基吡啶，用 10mL乙醇稀釋，通過恒壓漏斗緩慢滴入燒瓶，滴完后，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)40分鐘，移去恒壓漏斗， 45°C下繼續(xù)攪拌10分鐘，冷卻、得白色晶體，過濾，并用少量乙醇洗滌，干燥后得白色晶狀物 即為4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽M。
[0026] 2、目標(biāo)分子P1的合成
[0027] 250mL 圓底燒瓶中加入 4.76g(183.27g/mol，0.026mol)4-N，N-二乙基噻吩甲醛、 6.11g(235.07g/mol，0.026mol)4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽Μ和50mL甲醇，攪拌溶解，滴加5滴 催化劑哌啶，70°C下攪拌回流反應(yīng)10小時(shí)，得紫紅色溶液；向所述紫紅色溶液中滴加20mL六 氟磷酸銀(252.83g/mol，0.026mol)的甲醇溶液，攪拌回流反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液 中加入100mL無水甲醇，熱抽濾出碘化銀沉淀，濾液旋出部分甲醇，靜置，冷卻，有藍(lán)紫色沉 淀析出，抽濾，乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，為藍(lán)紫色棒狀晶體。
[0028]本發(fā)明合成路線如下：
[0029]
[0030]與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：
[0031] 1、本發(fā)明合成的小分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽P1是一類光學(xué)性質(zhì)優(yōu)良、生物相容 性好的生物顯影材料；
[0032] 2、本發(fā)明合成的目標(biāo)產(chǎn)物原料易得、成本低、合成步驟簡(jiǎn)單、毒性小、溶解性好，使 其商業(yè)化成為可能；
[0033] 3、本發(fā)明合成的目標(biāo)產(chǎn)物可以作為單光子熒光探針，其激發(fā)波長(zhǎng)在540nm，發(fā)射波 長(zhǎng)在近紅外波段。單光子激發(fā)能量比常用核仁染料Syt〇9低，即對(duì)細(xì)胞的損傷較小。較常用 商染的激發(fā)波長(zhǎng)488nm的能量低，對(duì)細(xì)胞損傷??；
[0034] 4、本發(fā)明合成的目標(biāo)產(chǎn)物還可以作為雙光子熒光探針，其激發(fā)波長(zhǎng)在800nm處的 近紅外區(qū)，具有更低的激發(fā)能量、更強(qiáng)的穿透性、對(duì)細(xì)胞的光損傷更小等特點(diǎn)，而常用商染 無雙光子熒光；
[0035] 5、本發(fā)明合成的目標(biāo)產(chǎn)物，可以作為一種靶向細(xì)胞核仁的熒光探針。與常用商染 相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)，因此，具有較強(qiáng)的商業(yè)價(jià)值，有可能成為商業(yè)化核仁染料。 四、
【附圖說明】
[0036]圖1是目標(biāo)分子P1的單晶結(jié)構(gòu)圖（為了清晰，刪除了分子中的所有氫原子）<XCDC號(hào) 為1060367,說明目標(biāo)分子是尚未見報(bào)道的新化合物。
[0037]圖2 (左)是不同濃度的P1在PBS緩沖溶液(pH=7.4)中的紫外-可見吸收光譜，測(cè)試 的濃度分別為2,4,6,8，10,20,30,40，\10^1〇1/1，左圖說明隨著？1濃度的增加，最大吸光 度值逐漸增大；圖2(右)是濃度與對(duì)應(yīng)的最大吸光度作圖，從右圖中可以看出，目標(biāo)分子的 濃度與對(duì)應(yīng)的最大吸光度值呈線性關(guān)系，說明其水溶性良好。
[0038]圖3是目標(biāo)分子P1的細(xì)胞毒性測(cè)試結(jié)果。分別用不同濃度的P1溶液培養(yǎng)人類肝癌 細(xì)胞(HepG2ce 11) 24小時(shí)。通過酶標(biāo)儀，測(cè)試了不同濃度下的P1對(duì)Η印G2細(xì)胞的毒性大小，結(jié) 果表明，當(dāng)Ρ1的濃度達(dá)到60Μ時(shí)，細(xì)胞的存活率仍接近90%，說明目標(biāo)分子Ρ1的毒性較小，適 宜作為熒光探針應(yīng)用于生物體。
[0039]圖4是目標(biāo)分子Ρ1的細(xì)胞共聚焦顯影成像研究結(jié)果。將20Μ的Ρ1與HepG2細(xì)胞共培 養(yǎng)30分鐘，用PBS緩沖溶液洗滌3次。通過共聚焦顯微成像，得到單、雙光子熒光圖、明場(chǎng)圖、 疊加圖和三維圖。從圖中看出，P1可以穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入HepG2細(xì)胞的核仁區(qū)域，并發(fā)出較強(qiáng) 的熒光。說明P1可以作為細(xì)胞核仁的單雙光子熒光探針。
[0040]圖5是目標(biāo)分子P1與常用核仁商染Syt〇9的單光子熒光共定位分析研究結(jié)果。從圖 中可以清楚地看出，P1可以穿過HepG2細(xì)胞膜，并能很好地進(jìn)行細(xì)胞核仁著色。通過計(jì)算，P1 與Syto9的共定位相關(guān)系數(shù)(Overlap Coefficient)!?值為0.8397。說明目標(biāo)分子P1可以革巴 向定位活細(xì)胞的核仁區(qū)域。 五、
【具體實(shí)施方式】
[0041 ] 1、4_甲基-N-甲基吡啶碘鹽Μ的合成
[0042] 50mL圓底燒瓶中加入43.2g(0.3moL)碘甲烷，稱取18.6g(0.2moL)4-甲基吡啶，用 10mL乙醇稀釋，通過恒壓漏斗緩慢滴入燒瓶，滴完后，常溫?cái)嚢璺磻?yīng)40分鐘，移去恒壓漏斗， 45°C下繼續(xù)攪拌10分鐘，冷卻、得白色晶體，過濾，并用少量乙醇洗滌，干燥后得白色晶狀物 即為4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽M。
[0043] 2、目標(biāo)分子P1的合成
[0044] 250mL 圓底燒瓶中加入 4.76g(183.27g/mol，0.026mol)4-N，N-二乙基噻吩甲醛、 6.11g(235.07g/mol，0.026mol)4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽Μ和50mL甲醇，攪拌溶解，滴加5滴 催化劑哌啶，70°C下攪拌回流反應(yīng)10小時(shí)，得紫紅色溶液；向所述紫紅色溶液中滴加20mL六 氟磷酸銀(252.83g/mol，0.026mol)的甲醇溶液，攪拌回流反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后向反應(yīng)液 中加入lOOmL無水甲醇，熱抽濾出碘化銀沉淀，濾液旋出部分甲醇，靜置，冷卻，有藍(lán)紫色沉 淀析出，抽濾，乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，為藍(lán)紫色棒狀晶體。
[0045] ^-NMRCDMSO-de^OOMHz) ,5(ppm) :8.81 (s,lH),844(d,2H) ,8.03(m,2H) ,7.26(d, 1H)，6.42(d，lH) ,6.10(d，lH)，4.06(s，3H)，3.43(m，4H)，1.21(m，6H) .13C-匪R(100MHz, DMS〇-d6)，δ (ppm):162.23,153.05,143.37,137.97,135.73,127.94,122.63,120.44， 112.18,47.11,45.70,21.24.IR(KBr,cm _1)selected bands:2976(w),1646(m),1587(s), 1538(s),1518(m),1480(s),1441(s),1396(m),1358(m),1283(s),1244(s),1221(m),1188 (s),1128(m),1057(s),1039(m),998(m),935(m),834(s),760(m),662(w),560(s),533(w) ,MALDI-T0F:m/z, cal:273.14,found:273.25(M+) 〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針，其特征在于其結(jié)構(gòu)式 為.2. -種權(quán)利要求1所述的靶向細(xì)胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針的制備 方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽M的合成 50mL圓底燒瓶中加入43.2g碘甲烷，稱取18.6g 4-甲基吡啶并用IOmL乙醇稀釋，通過恒 壓漏斗滴入燒瓶，滴完后常溫?cái)嚢璺磻?yīng)40分鐘，移去恒壓漏斗，45°C下繼續(xù)攪拌10分鐘，冷 卻、得白色晶體，過濾，用乙醇洗滌，干燥后得白色晶狀物即為4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽M; (2) 目標(biāo)分子Pl的合成 25〇1^圓底燒瓶中加入4.768 4，少-二乙基噻吩甲醛、6.1184-甲基，-甲基吡啶碘鹽 M和50mL甲醇，攪拌溶解，滴加5滴催化劑哌啶，70 °C下攪拌回流反應(yīng)10小時(shí)，得紫紅色溶液； 向所述紫紅色溶液中滴加〇. 〇26mol六氟磷酸銀的甲醇溶液，攪拌回流反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束 后向反應(yīng)液中加入無水甲醇，熱抽濾出碘化銀沉淀，濾液旋出部分甲醇，靜置，冷卻，有藍(lán)紫 色沉淀析出，抽濾，乙醇重結(jié)晶，得目標(biāo)產(chǎn)物，為藍(lán)紫色棒狀晶體。
【文檔編號(hào)】C09K11/06GK106008486SQ201610389375
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】田肖和, 張國(guó)翠, 柳詩潤(rùn), 潘輝, 周虹屏, 李勝利, 李飛, 吳杰穎, 田玉鵬
【申請(qǐng)人】安徽大學(xué)