抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的融合蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的融合蛋白的制備方法。該方法，包括使蛋白質(zhì)的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)得到所述蛋白質(zhì)的步驟；所述生物為微生物、植物或非人動(dòng)物；所述蛋白質(zhì)為a)或b)或c)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；b)由SEQ ID No.2第51?937位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白。該方法制備的融合蛋白可溶性好，純化簡(jiǎn)易，可作為診斷抗原、制備成單克隆抗體或進(jìn)一步對(duì)蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
【專利說(shuō)明】
抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的融合蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的融合蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium Perfringens)也稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共 患病，該病原是創(chuàng)傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊壞死性腸炎、 牛羊腸毒血癥的主要病原之一，對(duì)畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。產(chǎn)氣莢膜梭菌主要的致 病因素是其分泌的外毒素，種類多達(dá)13種，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根據(jù)產(chǎn)生外毒素 的種類不同，可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為43、(：、04這五個(gè)血清型。目前產(chǎn)氣莢膜梭菌病的免疫 主要通過(guò)傳統(tǒng)的經(jīng)過(guò)滅活的單價(jià)苗、多聯(lián)苗或者類毒素疫苗而實(shí)現(xiàn)，這些傳統(tǒng)疫苗雖然能 夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生一定的保護(hù)性抗體，但是它們存在安全性不高、穩(wěn)定性差、免疫后副反應(yīng)大 等缺點(diǎn)，這些缺點(diǎn)大大限制了其應(yīng)用，研發(fā)一種針對(duì)多種血清型的基因工程亞單位多價(jià)疫 苗因而成為了世界各國(guó)研究者的重點(diǎn)研究目標(biāo)。由于基因工程亞單位多價(jià)疫苗含有產(chǎn)生保 護(hù)性免疫應(yīng)答所必需的有效免疫成分，去除了與免疫無(wú)關(guān)的成分，因而相對(duì)于傳統(tǒng)疫苗而 言安全性、穩(wěn)定性更好，同時(shí)也消除了傳統(tǒng)疫苗成分中的熱原與應(yīng)激原、變應(yīng)原等反應(yīng)原， 很好的解決了傳統(tǒng)疫苗免疫后動(dòng)物出現(xiàn)的副反應(yīng)與炎性刺激反應(yīng)等問(wèn)題。
[0003] 宮旭穎等（宮旭穎等.產(chǎn)氣莢膜梭菌α-β2-ε毒素融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)及 免疫原性研究.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).第37卷第2期2015年2月）利用PCR技術(shù)構(gòu)建了含有α、β和 ε融合基因的重組質(zhì)粒，并且進(jìn)行了 α-β2_ε融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，為進(jìn)一步研制多價(jià)基因工 程亞單位苗提供了基因材料，為解決困擾我國(guó)畜牧業(yè)的動(dòng)物壞死性腸炎和腸毒血癥提供了 一條新的途徑。但是該重組質(zhì)粒表達(dá)出的α_β2-ε融合蛋白為包涵體結(jié)構(gòu)，且α-β2-ε融合蛋 白的表達(dá)量占菌體總蛋白含量的18.4%。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌主要外毒素蛋白的表達(dá)與純化方法相對(duì)復(fù)雜，表達(dá)產(chǎn) 物通常以不溶性的包涵體形式存在，可溶性蛋白表達(dá)的報(bào)道在國(guó)內(nèi)外非常少。因?yàn)榘w 中的表達(dá)產(chǎn)物不具有生物學(xué)活性，因而需要進(jìn)行變性與復(fù)性處理。蛋白的變性與復(fù)性是一 個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，不同蛋白的復(fù)性條件各異，復(fù)性率往往很難提高。這是限制其應(yīng)用的主 要制約因素。采用可溶性表達(dá)方式可很好的克服這一問(wèn)題。如何構(gòu)建可溶性表達(dá)載體并且 優(yōu)化可溶性蛋白的高效表達(dá)方法，是本領(lǐng)域長(zhǎng)期以來(lái)一直研究的熱點(diǎn)課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是如何獲得抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的可溶性蛋 白質(zhì)疫苗。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了制備抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的可溶性蛋白質(zhì) 的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的制備蛋白質(zhì)的方法，包括使蛋白質(zhì)的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá) 得到所述蛋白質(zhì)的步驟;所述生物為微生物、植物或非人動(dòng)物；
[0008] 所述蛋白質(zhì)為a)或b)或c)或d):
[0009] a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0010] b)由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0011] c)在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白；
[0012] d)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)。
[0013] 上述方法中，a)的蛋白質(zhì)名稱為a-P2-e-his，b)的蛋白質(zhì)名稱為a-P2-^SEQ ID No. 2由937個(gè)氨基酸殘基組成。
[0014] 上述方法中，蛋白標(biāo)簽是指利用DNA體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一 種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化等。
[0015] 上述方法中，使所述蛋白質(zhì)的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)包括將所述的蛋白質(zhì)的 編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)所述蛋白質(zhì)的重組微生物，培養(yǎng)所述重組微生物，表達(dá) 得到所述蛋白質(zhì)。
[0016] 上述方法中，所述受體微生物可為C1)_C4)中的任一種：
[0017] C1)原核微生物；
[0018] C2)革蘭氏陰性細(xì)菌；
[0019] C3)埃希氏菌屬細(xì)菌；
[0020] C4)大腸桿菌 BL21(DE3)。
[0021] 上述方法中，所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦?)或2)或3)所示的基因：
[0022] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子(編碼a-02-e-his);
[0023] 2)編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子(編碼α-β2_ε);
[0024] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0025] 其中，SEQ ID No.l由2820個(gè)核苷酸組成，其名稱為cH32-e-hisY基因，編碼氨基酸 序列是SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)a-β2-ε-his。SEQIDNo.l的第151-2814位所示的DNA分子是 α-β2-ε-Υ基因，編碼由SEQ ID如.2第51-937位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)€1-02^。 [0026] 上述方法中，所述重組微生物為將ρΕΤ30 &-α-β2-ε-Υ導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到 的表達(dá)氨基酸序列是SEQ ID No. 2的蛋白質(zhì)的重組微生物，所述重組微生物命名為BL21 (DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y，所述 ρΕΤ30α-α-β2-ε-Υ 為將載體 pET30a( + )的 BamHI 和 Xhol 位點(diǎn)之 間的序列替換為SEQ ID No. 1第151-2814位(編碼α-β2_ε)所示的DNA片段得到的重組載體。 [0027] 上述方法中，所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá)，所述誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo) 13-16小時(shí)或13-24小時(shí)或13小時(shí)或16小時(shí)。
[0028] 上述方法在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 本發(fā)明中，所述產(chǎn)氣莢膜梭菌可為A、B、C、D和E這5種型產(chǎn)氣莢膜梭菌中的任5種、 任4種、任3種、任2種或任1種。
[0030] 本發(fā)明中，所述抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗具體可為上述預(yù)防動(dòng)物產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的 疫苗。
[0031] 在實(shí)際應(yīng)用中，可以將本發(fā)明的所述蛋白質(zhì)或其相關(guān)生物材料作為藥物直接給予 病人、或者與適宜的載體或賦形劑混合后給予病人，以達(dá)到治療產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的目的。 這里的載體材料包括但不限于水溶性載體材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有機(jī)酸等）、 難溶性載體材料(如乙基纖維素、膽固醇硬脂酸酯等）、腸溶性載體材料(如醋酸纖維素酞酸 酯和羧甲乙纖維素等）。其中優(yōu)選的是水溶性載體材料。使用這些材料可以制成多種劑型， 包括但不限于片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質(zhì)體、 透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等?？梢允瞧胀ㄖ苿?、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給 藥系統(tǒng)。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領(lǐng)域公知的各種載體。關(guān)于載體的 例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、 尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等;濕潤(rùn)劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙 醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫 膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐 藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基 纖維素、乙基纖維素等;崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等;吸收促 進(jìn)劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤(rùn)滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸 鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進(jìn)一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包 衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將單位給藥劑型制成丸劑，可以廣泛使用本領(lǐng) 域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可 月旨、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等;粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍 膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷 基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將單位給藥劑型制成栓劑，可以廣泛使用本領(lǐng) 域公知的各種載體。關(guān)于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級(jí)醇、高級(jí)醇的 酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將單位給藥劑型制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉 針劑和混懸劑，可以使用本領(lǐng)域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二醇、 乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等 滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規(guī) 的助溶劑、緩沖劑、pH調(diào)節(jié)劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香 料、矯味劑、甜味劑或其它材料。使用上述劑型可以經(jīng)注射給藥，包括皮下注射、靜脈注射、 肌肉注射和腔內(nèi)注射等;腔道給藥，如經(jīng)直腸和陰道;呼吸道給藥，如經(jīng)鼻腔;粘膜給藥。上 述給藥途徑優(yōu)選的是注射給藥。
[0032] 本發(fā)明將SEQ ID No.l的第151-2814位所示的DNA分子插入pET30a( + )的BamHI和 XhoI位點(diǎn)，得到表達(dá)SEQIDNo.2的重組蛋白α-β2-ε-his的重組表達(dá)載體pET30a-α-β2-ε-Y。將重組表達(dá)載體ρΕΤ30 &-α-β2-ε-Υ導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)獲得了可溶性的目的蛋白α-β 2_e-his。本發(fā)明優(yōu)化了 a-02_e-his的表達(dá)條件，進(jìn)一步提尚了 a-02_e-his的表達(dá)量，用 0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13-16小時(shí)，a-02_e-his的含量達(dá)到菌體總蛋白的65%，表達(dá)的a-02-e-his 92%可溶。a-02_e-hisY免疫動(dòng)物后可使動(dòng)物產(chǎn)生較高的血清抗體水平，并且可 抵抗產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊。a-i32-e-his在抵抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的7天內(nèi)的免疫保護(hù) 率為100%，PBS對(duì)照組小鼠全部死亡;α-β2-ε-1?s在抵抗B型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保 護(hù)率為l〇〇%，PBS對(duì)照組小鼠全部死亡;免疫a-02-e-his在抵抗C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的 免疫保護(hù)率為90%，PBS對(duì)照組小鼠全部死亡;a-02-e-his在抵抗D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí) 的免疫保護(hù)率為1〇〇%，而PBS對(duì)照組小鼠全部死亡。第三次免疫cH32-e-his后7-14天抗體 效價(jià)達(dá)到峰值，最高抗體效價(jià)達(dá)1:128000 c^a-PS-e-hisY可溶性好，純化簡(jiǎn)易，可作為診斷抗 原、制備成單克隆抗體或進(jìn)一步對(duì)蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為各菌株表達(dá)蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0034] 圖中，Μ為Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、 26KD;1、誘導(dǎo)表達(dá)的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y全 菌蛋白液體，3、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y全菌蛋白液體，4、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3 )/ρΕΤ30&-α-β2_ε-Υ 含蛋白上清液，5、誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21 (DE3 )/ρΕΤ30&-α-β2_ε-Υ 含蛋白 沉淀，6、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-W全菌蛋白液體，7、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-P2_e-W 全菌蛋白液體，8、誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W 含蛋白 上清液，9、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-W含蛋白沉淀，10、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET3Oa-pma-02_e-W 全菌蛋白液體，11、誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21(DE3)/pET3Oa-pma-02_e-W 全菌蛋白液體，12、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pmcH32-e-W含蛋白上清液，13、誘導(dǎo)表達(dá) 的 BL21(DE3)/pET30a-pmα-β2-ε-W含蛋白沉淀。
[0035] 圖 2 為Western-blot 圖譜。
[0036]圖中，1、誘導(dǎo)表達(dá)的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-β2-ε-Υ全菌蛋白液體，3、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-Y全菌蛋白液體，4、誘導(dǎo)表 達(dá)的 BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y 含蛋白上清液，5、誘導(dǎo)表達(dá)的 BI^UDESVpETSOa-a-PS-e-Y 含蛋白沉淀， 6、未誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W 全菌蛋白液體， 7、誘導(dǎo)表達(dá) 的 BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W 全菌蛋白液體，8、誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W 含蛋白上清液，9、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_W含蛋白沉淀，10、未誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21 (DE3) /pET3Oa-pma-02_e -W 全菌蛋白液體，11、誘導(dǎo)表達(dá)的 BL21 (DE3) /pET3Oa-pma-02_ ε-W全菌蛋白液體，12、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pma-P2-e-W含蛋白上清液，13、誘導(dǎo) 表達(dá)的 BL21(DE3)/pET30a-pma-P2_e-W 含蛋白沉淀。
[0037]圖3為重組蛋白a-P2_e-his的AKTA純化鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。 [0038]圖4為重組蛋白a-i32-e-his的分子篩純化鑒定與結(jié)構(gòu)初步判定。箭頭所指的為純 化的目的蛋白峰。
[0039]圖5為純化的目的蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0040]其中 1 是 BL21 (DE3)/pET30a-a-P2_e-Y 含蛋白沉淀；2是BL21 (DE3)/pET30a-a-P2_ ε -Y全菌蛋白液體;Μ是Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、 26KD; 3是受體菌全菌蛋白液體;4是BL21 (DE3) /ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ含蛋白上清液;5是鎳柱純 化目的蛋白樣品；6是純化的a-K-e-his蛋白（分子篩純化目的蛋白樣品）。
[00411圖6為摸索BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y不同誘導(dǎo)溫度與時(shí)間點(diǎn)的對(duì)比電泳圖。箭 頭示目的條帶。
[0042]其中 Μ是Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、 26KD;1是37°C誘導(dǎo)lh后的全菌蛋白液體;2是37°C誘導(dǎo)2h的全菌蛋白液體;3是37°C誘導(dǎo)4h 的全菌蛋白液體;4是37 °C誘導(dǎo)5h的全菌蛋白液體;5是16 °C誘導(dǎo)13h的全菌蛋白液體;6是16 °C誘導(dǎo)24h的全菌蛋白液體。箭頭示目的條帶。
[0043] 圖7為BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y不同IPTG濃度條件的對(duì)比電泳圖。箭頭示目的 條帶。
[0044]其中Μ是Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、26KD (5yL); 1是16 °C、0.1 mM誘導(dǎo)后的全菌蛋白液體;2是16 °C、0.3mM誘導(dǎo)后的全菌蛋白液體;3是 16 °C、0.5 mM誘導(dǎo)后的全菌蛋白液體;4是16 °C、0.7 5 mM誘導(dǎo)后的全菌蛋白液體;5是：16 °C、 ImM誘導(dǎo)后的全菌蛋白液體;6是無(wú)誘導(dǎo)劑空白對(duì)照。
[0045] 圖8為BL21 (DE3) /ρΕΤ30&-α-β2_ε -Y不同誘導(dǎo)溫度的對(duì)比電泳圖。
[0046] 其中Μ是Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、26KD (5μυ;1是低溫16°C誘導(dǎo)13h后提取的含蛋白上清液;2是低溫16°C誘導(dǎo)16h后提取的含蛋白 上清液。
【具體實(shí)施方式】
[0047] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為 常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0048] pET30a( + )為 Novagen 公司產(chǎn)品。pET28a( + )為 Novagen 公司產(chǎn)品。
[0049] A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5、C型產(chǎn)氣莢膜梭 菌強(qiáng)毒株C59-4、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11均為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。
[0050] 實(shí)施例1、可溶性表達(dá)a-02-e-his
[0051 ] 1、合成基因
[0052] 本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)了3種融合基因，分別為SEQ ID No.l所示的a-02_e-hisY基因 、SEQ ID No·3所示的a-β2-ε-hisW基因、SEQIDNo·4所示的pma-β2-ε-hisW基因。
[0053] a-β2-ε-hisY基因和a-β2-ε-hisW基因均編碼SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)a-β2-ε-his<3pma _02_e-hisW基因編碼SEQ ID No·5所不的蛋白質(zhì)ρπια_β2_ε-hisW<3a_02 _e-his是將 pma-P2-e-hisW的第52-146位氨基酸殘基、464-492位氨基酸殘基和743-750位氨基酸殘基 缺失得到的蛋白質(zhì)。
[0054]用化學(xué)合成的方法合成出SEQ ID No.l的第151-2814位所示的α-β2-ε_(tái)Υ基因（編 碼SEQ ID No.2的第51-937位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)），SEQ ID No.3的第151-2814位所 示的a-β2-ε-W基因（編碼SEQIDN0.2的第51-937位氨基酸殘基所示的蛋白質(zhì)），SEQID No.4的第151-3210位所示pma-02-e-W基因（編碼SEQ ID No.5的第51-1069位氨基酸殘基所 示的蛋白質(zhì)pma-02-e-W)。
[0055] 2、重組表達(dá)載體和重組菌的構(gòu)建
[0056] 以a - β 2 - ε - Υ基因作為模板，利用上游引物F 1 (序列為5 ' -g g a t c c 8七區(qū)1:1:1:七區(qū)區(qū)區(qū)&。。。區(qū)區(qū)&。&。。區(qū)&。-3'）和下游弓丨物1?1(序列為5'-CTCGAGTCATTTGATGCCCGGTGCTTTGA-3'）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，在 α-β2-ε-Υ 基因的兩端加上 BamHI 位 點(diǎn)（帶下劃線的序列）和XhoI識(shí)別位點(diǎn)（帶下劃線的序列），得到SEQ ID No. 1的第145-2820 位所示的α-β2_ε-Υ基因 PCR產(chǎn)物。
[0057] 以α -β 2- ε -W基因作為模板，利用上游引物F 1和下游引物R2 (序列為5 ' -CTCGAGTCATTTGATACCCGGCGCTTTGA-3'）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，在 a-g2-e-ff 基因的兩端加上 BamHI 和 Xhol識(shí)別位點(diǎn)，得到SEQ ID吣.3的第145-282〇位所示的€[-02-￡-1基因？0?產(chǎn)物。
[0058]以p m α - β 2 - ε - W基因作為模板，利用上游引物F 3 (序列為5'_ ggatccatgaaacgcaaaatctgcaaagcc-3 '）和下游引物R2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在pma-02_e-W基因的 兩端加上BamHI和Xhol識(shí)別位點(diǎn)，得到SEQ ID如.4的第145-3216位所示的?111€[-02-￡-1基因 PCR產(chǎn)物。
[0059] 將上述α-β2_ε-Υ基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段（α-β2_ε-Υ基 因）；同時(shí)用BamHI和Xho頂每切載體pET30a(+)，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收 的載體大片段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將其 均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。單菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒用 BamHI和Xhol進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果表明是用SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的α-β2_ε-Υ基因替換pET30a( + )的BamHI和Xhol識(shí)別位點(diǎn)間的 片段，保持pET30( + )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ。 ρΕΤ30α-α-β2-ε-Υ含有帶His標(biāo)簽的a-02_e-hisY基因，a-02_e-hisY基因的核苷酸序列是 SEQ ID No.l，編碼SEQ ID No.2所示的蛋白質(zhì)a-β2-ε-his。將含有pET30a-a-β2-ε-Y的重組 大腸桿菌命名為 BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y。
[0060] 將上述a-02-e-W基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段（α-β2-ε-Ι基 因）；同時(shí)用BamHI和Xho頂每切載體pET30a(+)，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收 的載體大片段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將其 均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。單菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒用 BamHI和Xhol進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果表明是用SEQ ID No.3的第151-2814位所示的α-β2-ε-W基因替換pET30a( + )的BamHI和XhoI識(shí)別位點(diǎn)間的 片段，保持pET30a( + )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為pET3Oa-a-02-e-W。 pET3Oa-a-02_e-W含有Hi s標(biāo)簽融合蛋白α-β2_ε -hi sW基因，α-β2_ε -h i sW基因的核苷酸序列 是SEQIDNo.3，編碼SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)a-β2-ε-his。將含有pET30a-a-β2-ε-W的重 組大腸桿菌命名為 BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-W。
[0061 ] 將上述pma-02-e-W基因 PCR產(chǎn)物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段(ρπια-β2-ε-Ι 基因）；同時(shí)用BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回 收的載體大片段連接，得到目的質(zhì)粒。將目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。將 其均勻涂布于含卡那霉素的LB平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。單菌落振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒用 BamHI和Xhol進(jìn)行雙酶切鑒定，將酶切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果表明是用SEQ ID No.4的第151-3210位所示的pmα-β2-ε-W基因替換pET30a( + )的BamHI和XhoI識(shí)別位點(diǎn)間 的片段，保持pET30( + )的其它序列不變得到的重組表達(dá)載體，命名為pET3Oa-pma-02-e-W。 pET3Oa-pma-02_e-W 含有帶 His 標(biāo)簽的 pma-02_e-hisW 基因，pma-02_e-hisW 基因的核苷酸序 列是SEQ ID Νο·4,編碼SEQ ID Νο·5所示的蛋白質(zhì)pma-02-e-hisW。將含有pET30a-pma-P2-ε-W 的重組大腸桿菌命名為 BL21(DE3)/pET3Oa-pma-02_e-W。
[0062] 3、蛋白表達(dá)形式的分析與鑒定
[0063]將BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e-Y、BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W、BL21(DE3)/ pET3Oa-pma-02-e-W和大腸桿菌BL21 (DE3)(簡(jiǎn)稱受體菌)這四個(gè)菌株分別單獨(dú)接種于含50μ g/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μ g/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600 值（以含SOμg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，取出1 mL菌液作為未誘 導(dǎo)表達(dá)的菌液(對(duì)照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。上 述四株菌的誘導(dǎo)表達(dá)均是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。
[0064]取未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液和誘導(dǎo)表達(dá)菌液用于蛋白表達(dá)形式分析。具體步驟為，取lm L菌液置于1.5m L離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min離心30min，棄掉上清液，收 集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體 沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋 白液體于4°C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液)和 沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重懸洗滌沉淀。向全菌蛋白液體、 含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸 水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析，并且結(jié) 合蛋白灰度分析軟件初步分析蛋白含量。將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)印于NC膜，以抗His標(biāo)簽的羊抗 鼠抗體為結(jié)合抗體DAB顯色，進(jìn)行Western-blot鑒定。將上述全菌蛋白液體和含蛋白上清液 用0.22μπι濾膜過(guò)濾后上樣至預(yù)先用溶液1(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶 劑是水，PH8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機(jī)器上，分別用10個(gè)柱體積的溶液1 與10個(gè)柱體積的溶液2(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶劑是水， PH8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用溶液3(溶質(zhì)及其濃 度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶劑是水，pH8.0的溶液)沖洗鎳柱掛在鎳柱上 的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳柱純化目的蛋 白樣品。
[0065] 將鎳柱純化的目的蛋白樣品用GE公司生產(chǎn)的SuperdeX200凝膠柱通過(guò)分子篩進(jìn)一 步純化。流動(dòng)相使用溶液1。通過(guò)分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，收集洗 脫峰，得到分子篩純化的目的蛋白樣品，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(ND2000)對(duì) 得到的分子篩純化的目的蛋白樣品中蛋白（即可溶性目的蛋白）的含量進(jìn)行定量分析。并用 NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(ND2000)測(cè)定全菌蛋白液體中的蛋白質(zhì)含量，得到菌體總 蛋白含量。將含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(ND2000)測(cè)定 含蛋白沉淀中的蛋白質(zhì)的含量。
[0066] 結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y的全菌蛋白液體、含蛋白上清 液和含蛋白沉淀中均含有大小為105kD的目的蛋白cH32-e-his，未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液體中不含有大小為105kD的目的蛋白a-P2-e-his;誘導(dǎo)表達(dá) 的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y的全菌蛋白液體中的目的蛋白a-P2-e-his占菌體總蛋白 (全菌總蛋白）的65%，誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y的含蛋白上清液中的目的 蛋白cH32-e-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e-Y的全菌蛋白液體中目的蛋白a-f32-e-his的92%，該92%的目的蛋白a-P2_e-his為可溶性蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-P2-e-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ ρΕΤ30&-α-β2-ε-Υ的全菌蛋白液體中目的蛋白a-P2-e-his的8%，該8%的目的蛋白α-β2_ε-his為不溶性包涵體蛋白；說(shuō)明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_Y的目的蛋白α-β2_ ε-his占菌體總蛋白的65%，BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-Y表達(dá)的目的蛋白a-P2_e-his中 92%為可溶性蛋白，8%為不溶性包涵體蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-P2_e-W的 全菌蛋白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小為105kD的目的蛋白α-β2-ε-1?s， 未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-W的全菌蛋白液體中不含有大小為105kD的目的 蛋白a-P2-e-his;誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_W的全菌蛋白液體中的目的蛋白 a-P2_e-his占菌體總蛋白的65%，誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W的含蛋白上清 液中的目的蛋白a-K-e-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2-e_W的全菌蛋白液體中 目的蛋白a-f32_e-his的8%，該8%的目的蛋白a-P2_e-his為可溶性蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-a-P2-e_W的含蛋白沉淀中的目的蛋白a-P2-e-his占誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ pET30a-a-P2_e-W的全菌蛋白液體中目的蛋白a-P2_e-his的92%，該92%的目的蛋白α-β2_ ε-his為不溶性包涵體蛋白；說(shuō)明誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W的目的蛋白α-β 2-e-his占菌體總蛋白的65%，BL21(DE3)/pET30a-a-P2_e-W表達(dá)的目的蛋白a-P2_e-his中 8%為可溶性蛋白，92%為不溶性包涵體蛋白。未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET30a-pma-P2-e-W的全菌蛋白液體和誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-pma-P2-e-W的全菌蛋白液體、含蛋白上 清液和含蛋白沉淀中均不含有大小為120KD的目的蛋白pma-P2-e-his;說(shuō)明BL21(DE3)/ ρΕΤ30α-ρπια-β2-ε-W沒(méi)有表達(dá)目的蛋白ρπια-β2-ε-his。誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌BL21 (DE3)的全 菌蛋白液體不含有大小為105kD的目的蛋白cH32-e-his;說(shuō)明大腸桿菌BL21(DE3)沒(méi)有表達(dá) 目的蛋白a-i32-e-his。菌落形成單位(CFU)數(shù)量相同的誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET30a-a-P 2-ε-Υ和誘導(dǎo)表達(dá)的BL21 (DE3)/pET3Oa-a-02-e-W表達(dá)的菌體總蛋白質(zhì)量相同（圖1和圖2)。
[0067] 4、a-02_e-his 的純化
[0068] 將BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB 液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到〇. 6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該誘導(dǎo)表達(dá)用0.75mM的IPTG在16 °C誘導(dǎo)13h。取IPTG誘導(dǎo)表達(dá)13h后的菌液收集菌體沉淀。加入PBS重懸沉淀，8000rpm/min離 心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘 稠，于4°C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，收集上清液(命名為含蛋白上清液），棄沉淀。 將含蛋白上清液用〇. 22μπι濾膜過(guò)濾后上樣至預(yù)先用溶液1 (溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、 150mM NaCl，溶劑是水，pH8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機(jī)器上，分別用10個(gè) 柱體積的溶液1與10個(gè)柱體積的溶液2(溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪 唑，溶劑是水，PH8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機(jī)器上監(jiān)測(cè)蛋白峰。用溶液3 (溶質(zhì)及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶劑是水，pH8.0的溶液)沖洗鎳 柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳 柱純化的a-K-e-his蛋白（鎳柱純化目的蛋白樣品）（圖3)。
[0069] 將鎳柱純化的a-02_e-his蛋白用GE公司生產(chǎn)的Superdex200凝膠柱通過(guò)分子篩進(jìn) 一步純化。流動(dòng)相使用溶液1。通過(guò)分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，α_β2-ε-his蛋白的結(jié)構(gòu)為單體與二聚體共存結(jié)構(gòu)。收集單體與二聚體結(jié)構(gòu)的洗脫峰，得到分子篩 純化的a-K-e-his蛋白（分子篩純化目的蛋白樣品），使用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì) (ND2000)對(duì)得到的蛋白的純度進(jìn)行定量分析。
[0070]將分子篩純化的a-i32-e-his蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析其氨基酸序列，結(jié)果表明α-β2-ε-his的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
[0071] 將BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y和大腸桿菌BL21(DE3)(簡(jiǎn)稱受體菌)這兩個(gè)菌株 分別單獨(dú)接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至 卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器 200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)， 加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。上述兩株菌的誘導(dǎo)表達(dá)均是用 0 · 75mM的IPTG在16 °C誘導(dǎo)13小時(shí)。
[0072] 取IPTG誘導(dǎo)表達(dá)13h后的菌液用于蛋白表達(dá)形式分析。具體步驟為，取lm L誘導(dǎo)后 的重組菌液置于1.5m L離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/min離心30min，棄掉上清 液，收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好 的菌體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將 全菌蛋白液體于4 °C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上 清液)和沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重懸洗滌沉淀。向全菌蛋 白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入10yL 5XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻 后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分 析。同時(shí)將上述鎳柱純化目的蛋白樣品和上述純化的a-i32-e-his蛋白（分子篩純化目的蛋 白樣品）進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
[0073] 結(jié)果表明BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y表達(dá)的目的蛋白a-02-e-his以可溶性的形 式存在于細(xì)菌破碎菌體的上清液中，可溶性蛋白目的條帶表達(dá)明顯，上清液中雜質(zhì)較少。通 過(guò)對(duì)AKTA機(jī)器純化洗脫條件的優(yōu)化，可以得到純度更好的可溶性目的蛋白條帶，進(jìn)一步通 過(guò)分子篩的純化后，可以除去蛋白樣品中的含有的大量咪唑（圖5)，并且首次發(fā)現(xiàn)了該融合 重組蛋白的結(jié)構(gòu)為單體與二聚體共存結(jié)構(gòu)。通過(guò)分子篩的純化后的可溶性蛋白可以作為診 斷抗原、制備成單克隆抗體或進(jìn)一步對(duì)蛋白功能與構(gòu)象關(guān)系進(jìn)行研究。
[0074]另外，按照上述方法，將pET28a( + )的限制性內(nèi)切酶Nhel和Notl位點(diǎn)之間的序列替 換為SEQ ID No.l第151-2814位所示的α-β2-ε_(tái)Υ基因，保持pET28a( + )的其它序列不變，得 到含有α-β2_ε-Υ基因的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體命名為ρΕΤ28&-α-β2_ε-Υ。將 ρΕΤ28&-α-β2-ε-Υ轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將得到的重組大腸桿菌命名為BL21 (DE3)/pET28a-a-02_e-Y。將 BL21(DE3)/pET28a-a-02_e-Y 接種于含 50μg/ml 卡那霉素的 LB 液體培養(yǎng)基(在LB液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基） 中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至OD600值（以含50μg/ml卡那 霉素的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照）達(dá)到0.6時(shí)，取出1 mL菌液作為未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液（對(duì) 照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。該誘導(dǎo)表達(dá)是用 0.7 5mM的IPTG在16 °C誘導(dǎo)13小時(shí)。取誘導(dǎo)表達(dá)的菌液和未誘導(dǎo)表達(dá)的菌液按照上述方法進(jìn) 行蛋白表達(dá)形式分析。結(jié)果表明，未誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-a-P2-e_Y全菌蛋白液 體、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-a-β2-ε-Y全菌蛋白液體、誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/ ρΕΤ28&-α-β2_ε-Υ含蛋白上清液和誘導(dǎo)表達(dá)的BL21(DE3)/pET28a-a-P2_e-Y含蛋白沉淀中 均沒(méi)有目的蛋白的表達(dá)?？梢?jiàn)，雖然采用同一種外源目的基因（α-β2-ε_(tái)Υ基因），在不同的 BL21(DE3)表達(dá)載體-pET28a( + )和pET30a( + )中，外源目的基因的表達(dá)情況相差很大，將α-β 2-ε-Υ基因通過(guò)pET30a( + )導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)可獲得α-β2_ε-Υ基因的高效可溶性表 達(dá)，將α-β2_ε-Υ基因通過(guò)pET28a( + )導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中，α-β2_ε-Υ基因卻沒(méi)有表達(dá)。
[0075] 實(shí)施例2、α-β2_ε -hi s的動(dòng)物免疫保護(hù)性試驗(yàn)
[0076] 1、抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的制備
[0077] 將實(shí)施例1中分子篩純化的a-02-e-his蛋白用無(wú)菌PBS溶解，得到cH32-e-his濃度 為1000yg/mL的a-02-e-his溶液，用于免疫。將a-02-e-his溶液與弗氏佐劑按1:1等體積混 合，乳化制備油乳劑疫苗，將其命名為首免疫苗。將a-i32-e-his溶液與不完全弗氏佐劑按1: 1等體積混合，乳化制備油乳劑疫苗，將其命名為二免疫苗。
[0078]取出從中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所購(gòu)買到的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10、B型產(chǎn)氣莢 膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C59-4、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11。在超 凈工作臺(tái)中，用75 %酒精棉球仔細(xì)擦拭保存菌種的安瓿瓶外壁，然后用砂輪在安瓶的上三 分之一處做一劃痕，再用干燥的無(wú)菌紗布包裹安瓶將其掰開(kāi)。吸取400yL厭氧肉肝湯液體培 養(yǎng)基反復(fù)吹打安瓶中的菌種，使凍干菌種溶解菌懸液。按照1:100的比例將菌懸液接種到含 有牛肉膏的厭氧肉肝湯的試管中，并在試管上層加蓋l-2cm的液體石蠟隔絕空氣。將接好菌 的試管放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，置37°C恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16-24h后，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。復(fù)蘇 后的菌種經(jīng)過(guò)涂片、染色、鏡檢，確認(rèn)無(wú)誤后傳1-2代后使用，并將一部分菌種用30%的甘油 鹽水-80°C冰箱保存。
[0079] 2、A型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗(yàn)
[0080] 按照如下方法測(cè)試a-K-e-his對(duì)A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10的抗性試驗(yàn)：
[0081] 將30只體重在18-22g的雌性昆明小鼠，隨機(jī)分成2組(攻毒劑量組20只，并設(shè)10只 小鼠的PBS對(duì)照組）。攻毒劑量組，首次免疫、第二次免疫與第三次免疫均采用皮下注射的方 法進(jìn)行免疫，首次免疫用首免疫苗，第二次免疫與第三次免疫用二免疫苗，每次免疫劑量均 為0.2mL/只（a-02-e-his免疫劑量為100yg/只）；PBS對(duì)照組中的每只小鼠首次免疫、第二次 免疫與第三次免疫，皮下注射〇. 2mL PBS。首次免疫之前，先對(duì)小鼠進(jìn)行一次割尾采血，分離 血清，用作陰性對(duì)照血清。首次免疫后，間隔14d進(jìn)行第二次免疫，二免后14d進(jìn)行第三次免 疫。第三次免疫兩周后每只攻毒劑量組小鼠和每只PBS對(duì)照組小鼠腹腔注射1.5 X 109cfu的 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。自一免后開(kāi)始，每組小鼠每周米血一次，每 組采5只，分離血清，于-80°C冰箱保存，用于檢測(cè)抗體。采用間接ELISA檢測(cè)免疫動(dòng)物抗體水 平，具體方法如下：
[0082] 1)包被:將實(shí)施例1中分子篩純化的a-02_e-his蛋白用0.05mol/L p Η 9.0的碳酸 鹽包被緩沖液進(jìn)行稀釋，然后按l〇〇yL/孔逐一加入ELISA板中，將加好的ELISA板置4°C冰箱 中過(guò)夜；
[0083] 2)洗滌:從4°C冰箱中取出ELISA板，棄去板孔內(nèi)的液體，并在濾紙上拍干，向每孔 加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次。
[0084] 3)封閉：向ELISA板的每個(gè)孔中加入100yL含有5%脫脂乳的PBST溶液，放入37°C溫 箱孵育lh;
[0085] 4)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次；
[0086] 5)加待檢血清:將待檢血清按比例用滅菌ros進(jìn)行稀釋，每孔加100yL，同時(shí)設(shè)陰性 對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照孔，放入37°C溫箱孵育lh;
[0087] 6)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗版，重復(fù)4次；
[0088] 7)酶標(biāo)二抗結(jié)合:將HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗用含有5 %脫脂乳的PBS封閉緩沖液按 1:20 000-1:40000濃度稀釋后，分別向每孔加入lOOyL，放入37°C溫箱孵育lh;
[0089] 8)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機(jī)中進(jìn)行洗板，重復(fù)4次；
[0090] 9)顯色反應(yīng):將新鮮配制的TMB顯色液按lOOyL/孔加入到ELISA板的各個(gè)孔中，放 入37°C溫箱避光顯色15min;
[0091] 10)終止反應(yīng)：向按照50μLν孔加入2mol/L的濃H2S〇4終止液，放入37°C溫箱反應(yīng) 5min，終止顯色；
[0092] 11)讀數(shù):將終止顯色的ELI SA板放酶標(biāo)儀中檢測(cè)0D45Q的值。
[0093] 12)判定檢測(cè)結(jié)果：用確定好的陰陽(yáng)性臨界值來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果。陽(yáng)性臨界值=陰性 樣本的OD450平均值+3S(S為標(biāo)準(zhǔn)方差）。待檢血清的效價(jià)為待檢血清的0D值2陽(yáng)性臨界值時(shí) 所對(duì)應(yīng)的血清稀釋度。
[0094] 3、B型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗(yàn)
[0095]除了將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10替換為B型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C58-5，攻 毒劑量調(diào)整為2 X 109cfu外，其它操作完全相同。
[0096] 4、C型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗(yàn)
[0097]除了將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10替換為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C59-4，攻 毒劑量調(diào)整為1.5 X 108cfu外，其它操作完全相同。
[0098] 5、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻毒試驗(yàn)
[0099] 除了將A型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C57-10替換為D型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒株C60-11，攻 毒劑量調(diào)整為1.8 X 109cfu外，其它操作完全相同。
[0100] 攻毒劑量組和PBS對(duì)照組實(shí)驗(yàn)小鼠在三免二周后，分別使用各型產(chǎn)氣莢膜梭菌 1MLD 100的劑量對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，并于一周內(nèi)觀察和記錄小鼠發(fā)病死亡情況。攻毒結(jié)果表 明，攻毒劑量組(免疫a-i32-e-his)對(duì)各型產(chǎn)氣莢膜梭菌的攻擊均具有一定的免疫保護(hù)效 果。攻毒劑量組(免疫a-i32-e-hi s)在抵抗A型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的7天內(nèi)的免疫保護(hù)率為 100%(20只全部存活），1^5對(duì)照組小鼠全部死亡;攻毒劑量組(免疫€^2- ￡-11&)在抵抗8型 產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為100% (20只全部存活），roS對(duì)照組小鼠全部死亡;攻 毒劑量組(免疫〇-敗-￡-11^)在抵抗(：型產(chǎn)氣莢膜梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為90%(18只存 活，2只死亡），PBS對(duì)照組小鼠全部死亡;攻毒劑量組(免疫a-i32- e-his)在抵抗D型產(chǎn)氣莢膜 梭菌攻擊時(shí)的免疫保護(hù)率為100 % (20只全部存活），而ros對(duì)照組小鼠全部死亡。將純化后 的a-K-e-his作為診斷抗原包被酶標(biāo)板檢測(cè)檢測(cè)小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗體，發(fā) 現(xiàn)a-02- e-his作為診斷抗原建立的檢測(cè)方法均具有非常好的靈敏性與特異性。分別檢測(cè)各 實(shí)驗(yàn)組中小鼠初免后0-6周的血清中抗體效價(jià)水平，結(jié)果表明α-β2-ε-1? s融合毒素蛋白免 疫組抗體效價(jià)有明顯升高，在二免后抗體效價(jià)快速上升，三免后7-14天抗體效價(jià)達(dá)到峰值， 最高抗體效價(jià)達(dá)1:128000。
[0101]實(shí)施例3、a-02-e-his誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 [0102] 1、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間的優(yōu)化
[0103] 將BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB 液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分別進(jìn)行下述6種誘 導(dǎo)表達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)1小時(shí)。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM 的IPTG在37°C誘導(dǎo)2小時(shí)。第三種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)4小時(shí)。第四種誘 導(dǎo)表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在37°C誘導(dǎo)5小時(shí)。第五種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘 導(dǎo)13小時(shí)。第六種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)24小時(shí)。
[0104] 取lm L誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5m L離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/ min離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。向全菌蛋白液體中加入l〇yL 5XSDS-PAGE loading Buffer，充 分混勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電 泳分析。結(jié)果表明BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y在誘導(dǎo)溫度為37°C，誘導(dǎo)時(shí)間在l_4h的條件 下，a-K-e-his蛋白表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，5h誘導(dǎo)條件下蛋白表達(dá)量有所下降。但是 隨著誘導(dǎo)溫度的降低，a-K-e-his表達(dá)量也有所增加，當(dāng)誘導(dǎo)溫度降低至16°C，時(shí)間為誘導(dǎo) 13h時(shí)，a-P2-e-his表達(dá)量達(dá)到最高，目的蛋白a-P2-e-his占全菌總蛋白的65%。繼續(xù)培養(yǎng) 至24h，α-β2_ε-his的表達(dá)量略有下降，因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證BL21 (DE3)/ρΕΤ30α-α-β2-ε-Y的 最佳誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間為13_24h(圖6)。
[0105] 2、IPTG濃度的優(yōu)化
[0106] 將BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB 液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分別進(jìn)行下述6種誘 導(dǎo)表達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用O.lmM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.3mM 的IPTG在16 °C誘導(dǎo)13小時(shí)。第三種誘導(dǎo)表達(dá)是用0.5mM的IPTG在16 °C誘導(dǎo)13小時(shí)。第四種誘 導(dǎo)表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。第五種誘導(dǎo)表達(dá)是用ImM的IPTG在16°C誘導(dǎo) 13小時(shí)。第六種誘導(dǎo)表達(dá)是用OmM的IPTG在16 °C誘導(dǎo)13小時(shí)。
[0107] 取lm L誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5m L離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/ min離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋白液體于4 °C離心機(jī)中16000rpm/min離心30min，收集上 清液(命名為含蛋白上清液），向含蛋白上清液中加入l〇yL 5XSDS-PAGE loading Buffer， 充分混勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE 電泳分析。結(jié)果表明a-f32_e-his在不同濃度的IPTG誘導(dǎo)下，表達(dá)量也有所不同。a-02_e-his 表達(dá)量與加入IPTG濃度在0.1-0.75mM之間呈遞增關(guān)系。當(dāng)IPTG誘導(dǎo)濃度為ImM時(shí)，蛋白表達(dá) 量有所減少，這可能與IPTG本身的毒性有關(guān)。因此選擇IPTG濃度0.75mM為最佳誘導(dǎo)濃度（圖 7)。
[0108] 3、誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化
[0109] 將BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基(在LB 液體培養(yǎng)基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養(yǎng)基）中，37°C，采用 Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養(yǎng)至0D6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基為空白對(duì)照)達(dá)到0.6時(shí)，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)分別進(jìn)行下述2種誘 導(dǎo)表達(dá)。第一種誘導(dǎo)表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13小時(shí)。第二種誘導(dǎo)表達(dá)是用 0 · 75mM的IPTG在16 °C誘導(dǎo)16小時(shí)。
[0110] 取lm L誘導(dǎo)后的重組菌液置于1.5m L離心管中，做好標(biāo)記，4°C條件下8000rpm/ min離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。
[0111] 向全菌蛋白液體中加入10yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸水 浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機(jī)瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析。
[0112] 結(jié)果表明BL21(DE3)/pET3Oa-a-02-e-Y在誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間在13h與16h 的條件下，目的蛋白a-02-e-his表達(dá)量變化不大，此時(shí)表達(dá)的蛋白幾乎均為可溶性蛋白，沉 淀中的不溶性包涵體蛋白幾乎沒(méi)有表達(dá)。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間在13h與16h的條件 下表達(dá)的可溶性目的蛋白純度較高，表達(dá)量接近。因此，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)一步確定了重組 菌的最佳誘導(dǎo)溫度為16°C，誘導(dǎo)時(shí)間為13-16h(圖8)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 制備蛋白質(zhì)的方法，包括使蛋白質(zhì)的編碼基因在生物中進(jìn)行表達(dá)得到所述蛋白質(zhì)的 步驟;所述生物為微生物、植物或非人動(dòng)物； 所述蛋白質(zhì)為a)或b)或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； b) 由SEQ ID No.2第51-937位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； c) 在a)或b)所示的蛋白質(zhì)的羧基端或/和氨基端融合蛋白標(biāo)簽得到的融合蛋白； d) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白質(zhì)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述使蛋白質(zhì)的編碼基因在生物中進(jìn)行表 達(dá)包括將權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)胧荏w微生物，得到表達(dá)權(quán)利要求1所述蛋 白質(zhì)的重組微生物，培養(yǎng)所述重組微生物，表達(dá)得到權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述受體微生物為原核微生物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述原核微生物為革蘭氏陰性細(xì)菌。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述革蘭氏陰性細(xì)菌為埃希氏菌屬細(xì)菌。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：所述埃希氏菌屬細(xì)菌為大腸桿菌BL21 (DE3)〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述蛋白質(zhì)的編碼基因?yàn)槿缦?) 或2)或3)所示的基因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-2814位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的DNA 分子。8. 根據(jù)權(quán)利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于:所述重組微生物為將pET30a-a-i3 2-ε-Y導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)得到的表達(dá)氨基酸序列是SEQIDN 0.2的蛋白質(zhì)的重組微生 物，所述重組微生物命名為BL21(DE3)/pET3Oa-a-02_e-Y，所述ρΕΤ30α-α-β2-ε-Υ為將載體 pET30a( + )的BamHI和Xhol位點(diǎn)之間的序列替換為SEQ ID No.l第151-2814位所示的DNA片 段得到的重組載體。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于:所述表達(dá)為誘導(dǎo)表達(dá);所述誘導(dǎo) 表達(dá)是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導(dǎo)13-16小時(shí)或13-24小時(shí)或13小時(shí)或16小時(shí)。10. 權(quán)利要求1-9中任一所述的方法在制備抗產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K19/00GK106008719SQ201610302606
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月9日
【發(fā)明人】宋曉暉, 孫雨, 翟新驗(yàn), 董浩
【申請(qǐng)人】中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心