驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半萜二聚體類化合物及制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半萜二聚體類化合物及制備方法和用途，該化合物的為斑鳩菊大苦素二聚體 I，斑鳩菊大苦素二聚體 J和斑鳩菊大苦素二聚體 K，采用將粉粹的驅(qū)蟲斑鳩菊種子，用石油醚滲漉脫脂得到總提取物，然后用石油醚/乙酸乙酯，氯仿/甲醇，甲醇/水分別梯度洗脫，再用半制備高效液相色譜儀反復(fù)進(jìn)行純化，經(jīng)過(guò)波譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析表明從驅(qū)蟲斑鳩菊種子中分離得到三個(gè)新的倍半萜二聚體類化合物斑鳩菊大苦素二聚體 I,J和K。經(jīng)體外抗腫瘤活性研究表明，所提供的化合物對(duì)人肺癌細(xì)胞A?549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT?15和人前列腺癌細(xì)胞PC?3具有較明顯的細(xì)胞毒活性，可應(yīng)用于天然的低毒抗腫瘤藥物，從而為研制抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物。
【專利說(shuō)明】
驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半萜二聚體類化合物及制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一類從維藥驅(qū)蟲斑鳩菊種子中分離純化得到的具 有抗腫瘤活性的倍半萜二聚體類新化合物斑鳩菊大苦素二聚體I，J和K及其制備方法和用 途。
【背景技術(shù)】：
[0002] 驅(qū)蟲斑鳩菊(Vernonia anthelmintica(L. )willd.)為一年生高大草本，莖直立， 高達(dá)60厘米。此種據(jù)文獻(xiàn)記載只見于巴基斯坦、印度、斯里蘭卡、尼泊爾、阿富汗、馬來(lái)西亞 等國(guó)，在中國(guó)分布于云南西部，在新疆南部的阿克蘇、和田有栽培?！吨腥A人民共和國(guó)衛(wèi)生部 藥品標(biāo)注維吾爾藥分冊(cè)》中記載，本品屬于三級(jí)干熱，主要功能與主治為清除異常粘液質(zhì)、 驅(qū)蟲、消腫、散寒止痛。常用于濕寒性胃痛及肝病，白癜風(fēng)等。
[0003] 有關(guān)驅(qū)蟲斑鳩菊的化學(xué)成分研究主要集中在種子油部分以及提取物，除去油之后 部分的化學(xué)成分研究并不多。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，從驅(qū)蟲斑鳩菊中分離得到的脂肪酸及 其酯類除外的化合物類型主要包括倍半萜內(nèi)酯類、黃酮類、三萜類、留體類、咖啡?；鼘?酸類等。
[0004] 迄今對(duì)驅(qū)蟲斑鳩菊的倍半萜類成分研究不多，總共分離得到8個(gè)，從驅(qū)蟲斑鳩菊種 子分離得到的4個(gè)倍半萜類均為欖香內(nèi)酯類，其中兩個(gè)是劉永強(qiáng)等分離得到的罕見的欖香 內(nèi)酯類二聚體斑鳩菊大苦素二聚體A和斑鳩菊大苦素二聚體B，這兩個(gè)二聚體類化合物對(duì)急 性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60有很強(qiáng)的抑制活性。另外兩個(gè)是欖香內(nèi)酯類的倍半萜，分別為 Asaka，Y等分離得到的斑鳩菊醇(Vernodalol)和吳劍飛等首次從驅(qū)蟲斑鳩菊中分離得到的 斑鳩菊大苦素(Vernodalin) aZhang Li等從驅(qū)蟲斑鳩菊的地上部分分離得到了2個(gè)新的愈 創(chuàng)木烷型倍半萜類化合物（11?，41?，55,61?，71?，85)-8，15-二羥基愈創(chuàng)木烷-10(14)，11(13)-二烯 12,6-內(nèi)酯和（11?，41?，53,61?，71?，83，113)-8，15-二羥基愈創(chuàng)木烷-10(14)-烯-6，12-內(nèi) 酯以及已知欖香內(nèi)酯類倍半萜(45,51?，61?，71?，85，101?，115)-11，13-二羥基斑鳩菊內(nèi)酯。
[0005] 目前，國(guó)內(nèi)外抗腫瘤藥物主要為化學(xué)合成藥物，雖然具有一定療效，但對(duì)腫瘤的遠(yuǎn) 期效果較差，并且毒副作用較大;與之相比，中草藥治療腫瘤體現(xiàn)多方面的優(yōu)勢(shì)，以其療效 獨(dú)特、毒副作用小、開發(fā)潛能巨大而引起廣泛關(guān)注。從中藥及天然藥物資源中尋找和發(fā)現(xiàn)高 效、低毒、結(jié)構(gòu)獨(dú)特的抗腫瘤藥物成為一條有效的途徑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，從天然分離得到的通 過(guò)酶促狄爾斯-阿爾德(Diels-Alder)反應(yīng)形成的倍半萜二聚體類化合物有幾百個(gè)，表現(xiàn)出 較為廣泛的生物活性，其中尤以抗腫瘤活性為研究熱點(diǎn)，該類化合物也表現(xiàn)出較好的抗腫 瘤活性。
[0006] 本發(fā)明目的在于，從維藥驅(qū)蟲斑鳩菊種子中尋找具有抗腫瘤活性的物質(zhì)，為研制 抗腫瘤藥物提供新的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)我國(guó)民族藥用資源提供科學(xué)依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于，提供一種驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半萜二聚體類化合物及制備方法 和用途，該方法首先將粉粹的驅(qū)蟲斑鳩菊種子，用石油醚滲漉脫脂得到總提取物，然后用石 油醚/乙酸乙酯，氯仿/甲醇，甲醇/水分別梯度洗脫，再用半制備高效液相色譜儀反復(fù)進(jìn)行 純化，經(jīng)過(guò)波譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析表明從驅(qū)蟲斑鳩菊種子中分離得到三個(gè)新的倍半萜二聚體 類化合物斑鳩菊大苦素二聚體I(vernodalidimer I)，斑鳩菊大苦素二聚體J <>61'110(1311(1；[11161'】)和斑鳩菊大苦素二聚體1((>61'110(1311(1；[11161'10。將得到的化合物斑鳩 菊大苦素二聚體I，J和K經(jīng)體外抗腫瘤活性研究表明，所提供的三個(gè)倍半萜二聚體化合物對(duì) 人肺癌細(xì)胞A-549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15和人前列腺癌細(xì)胞PC-3具有較明顯的細(xì)胞毒活性， 可以應(yīng)用于開發(fā)來(lái)自天然的低毒抗腫瘤藥物，從而為研制抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合 物。
[0008] 本發(fā)明所述的一種驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半萜二聚體類化合物，該化合物結(jié)構(gòu)式為：
[0009]
[0010] 其中：結(jié)構(gòu)式1為斑鳩菊大苦素二聚體I，結(jié)構(gòu)式2為斑鳩菊大苦素二聚體J，結(jié)構(gòu)式 3為斑鳩菊大苦素二聚體K。
[0011] 所述的驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半萜二聚體類化合物的制備方法，按下列步驟進(jìn)行：
[0012] a、將粉粹的驅(qū)蟲斑鳩菊種子，用10倍量石油醚滲漉脫脂，藥渣晾干，用10倍量體積 比1:1:1的石油醚:乙醚：甲醇滲漉提取，提取液減壓回收溶劑，得到總提取物；
[0013] b、將步驟a得到的提取物，上硅膠柱，按體積比為100:0，100:10，100:40，100:70， 100:100，50:100，0:100的石油醚：乙酸乙酯依次梯度洗脫，薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的 流份，得到流份A-J;
[0014] c、取步驟b中的流份F，上硅膠柱，按體積比為100 :0，100: 2，100: 5，100 :10，100 : 50,100:100的氯仿：甲醇，依次梯度洗脫，薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的流份，得到流份 F1-F6；
[0015] d、取步驟c中的流份F2,上flash快速制備系統(tǒng)，用反向C18色譜柱，按體積濃度為 40 %，55 %，70 %，85 %的甲醇:水進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，根據(jù)紫外吸收色譜圖進(jìn)行 合并，得到流份F21-F26;
[0016] e、取步驟d F24中的體積濃度為60 %-80 %的甲醇:水洗脫部位，用凝膠柱色譜，以 甲醇為洗脫劑洗脫，用薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的流份；
[0017] f、取步驟e中分子量較大且薄層色譜上有明顯灰色斑點(diǎn)的部位，即第二個(gè)流份，用 半制備高效液相色譜儀反復(fù)進(jìn)行純化，高效液相色譜純化條件為25 % -40 %乙腈:水，流速 2.5-3ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，按色譜圖收集，真空干燥后，經(jīng)高分辨質(zhì)譜以及一維和二維 核磁鑒定，得到化合物斑鳩菊大苦素二聚體I，斑鳩菊大苦素二聚體J和斑鳩菊大苦素二聚 體K 〇
[0018] 步驟d中反向C18色譜柱收集體積濃度為60 % -80 %的甲醇:水部位。
[0019] 所述的驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半萜二聚體類化合物在制備抗腫瘤人肺癌細(xì)胞A-549、 人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15和人前列腺癌細(xì)胞PC-3活性中的用途。
[0020] 通過(guò)本發(fā)明所述方法獲得的化合物斑鳩菊大苦素二聚體I，斑鳩菊大苦素二聚體J 和斑鳩菊大苦素二聚體K，按常規(guī)經(jīng)核磁共振(NMR)、高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS)、電子圓二色 譜(ECD)、紅外（IR)等多種現(xiàn)代光譜技術(shù)，以及計(jì)算電子圓二色譜鑒定，斑鳩菊大苦素二聚 體I，J和K為倍半萜二聚體類新化合物。
[0021] 通過(guò)本發(fā)明所述方法獲得的化合物斑鳩菊大苦素二聚體I、斑鳩菊大苦素二聚體J 和斑鳩菊大苦素二聚體K，經(jīng)體外抗腫瘤活性試驗(yàn)表明，化合物斑鳩菊大苦素二聚體I，J和K 對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15、人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人肺癌細(xì)胞A549均具有細(xì)胞毒活性，可用于 制備抗腫瘤藥物。
[0022]本發(fā)明為研制新的抗腫瘤藥物提供了新的先導(dǎo)化合物，為開發(fā)利用維藥資源具有 重要意義。
【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體I的結(jié)構(gòu)；
[0024]圖2為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體J的結(jié)構(gòu)；
[0025] 圖3為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體K的結(jié)構(gòu)；
[0026] 圖4為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體I的高分辨質(zhì)譜圖。
[0027] 圖5為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體I的核磁共振氫譜。
[0028] 圖6為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體I的核磁共振碳譜。
[0029] 圖7為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體I的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算圓二色譜圖。
[0030] 圖8為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體J的高分辨質(zhì)譜圖。
[0031 ]圖9為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體J的核磁共振氫譜。
[0032] 圖10為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體J的核磁共振碳譜。
[0033] 圖11為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體J的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算ECD圖譜。
[0034]圖12為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體K的高分辨質(zhì)譜圖。
[0035] 圖13為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體K的核磁共振氫譜。
[0036] 圖14為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體K的核磁共振碳譜。
[0037] 圖15為本發(fā)明中斑鳩菊大苦素二聚體K的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算圓二色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)描述，但并不僅限于所給出的實(shí)施例。
[0039] 實(shí)施例1.制備化合物斑鳩菊大苦素二聚體I、斑鳩菊大苦素二聚體J和斑鳩菊大苦 素二聚體K:
[0040] 制備驅(qū)蟲斑鳩菊提取物浸膏：
[0041] a、將粉粹的驅(qū)蟲斑鳩菊種子15Kg，用10倍量石油醚150L滲漉脫脂，藥渣晾干，再用 10倍量體積比1: 1:1的石油醚：乙醚：甲醇150L滲漉提取，提取液減壓回收溶劑，得到總提取 物浸膏457g;
[0042] 分離純化：
[0043] b、將步驟a得到的浸膏，用氯仿：甲醇混合溶劑溶解，與500g硅膠（100-200目）拌 樣，上硅膠柱，按體積比為 100:0，100:10，100:40，100:70，100:100，50:100，0:100 的石油 醚:乙酸乙酯依次梯度洗脫，薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的流份，得到流份A-J;
[0044] c、取步驟b中的流份F( 132.6g)與135g硅膠（100-200目）拌樣，上硅膠柱，按體積比 為100:0，100: 2，100: 5，100:10，100:50，100:100的氯仿：甲醇，依次梯度洗脫，薄層色譜檢 識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的流份，得到流份F1-F6;
[0045] d、取步驟c中的流份F2，上flash快速制備系統(tǒng)，用反向Cis色譜柱，按體積比為 40 %，55 %，70 %，85 %的甲醇:水進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，根據(jù)紫外吸收色譜圖進(jìn)行 合并，得到流份F21-F26;
[0046] e、取步驟d F24中的60%_80%甲醇：水洗脫部位，用凝膠（sephadex LH-20)柱色 譜，以甲醇為洗脫劑洗脫，用薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的流份；
[0047] f、取步驟e中分子量較大且薄層色譜上有明顯灰色斑點(diǎn)的部位，即第二個(gè)流份，用 半制備高效液相色譜儀反復(fù)進(jìn)行純化，高效液相色譜純化條件為25 % -40 %乙腈:水，流速 2.5-3ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，按色譜圖收集，真空干燥后，經(jīng)高分辨質(zhì)譜以及一維和二維 核磁鑒定，得到化合物斑鳩菊大苦素二聚體I(2.5mg)、斑鳩菊大苦素二聚體J(1.9mg)和斑 鳩菊大苦素二聚體K(9. Omg)。
[0048]結(jié)構(gòu)鑒定
[0049] 按常規(guī)經(jīng)核磁共振(匪R)、高分辨質(zhì)譜（HR-ESI-MS)、電子圓二色譜（E⑶）、紅外 (IR)等多種現(xiàn)代光譜技術(shù)，以及運(yùn)用計(jì)算圓二色譜確定斑鳩菊大苦素二聚體I，J和K的化學(xué) 結(jié)構(gòu)及立體構(gòu)型，其中斑鳩菊大苦素二聚體I的立體構(gòu)型為SSjSJSJRJOSJlRjYj' 5,7/1?，8 /1?，10/1?;斑鳩菊大苦素二聚體了的立體構(gòu)型為55,65,75,81?，105，111?，5 /5,6/5,7/ 尺，8/1?，10/1?;斑鳩菊大苦素二聚體1(的立體構(gòu)型為53,63,71?，81?，103,5 /1?，6/1?，7/3,8/1?，10/ R，17，S。
[0050]斑鳩菊大苦素二聚體Ι:[α]〖° =+32. 7 (c〇. 〇5，甲醇)6UV(甲醇)λΜ nm(l〇ge) = 202(2.56)<JR(KBr)umax cm-^3447,2951,1717,1628,1441,1159,1051( + )^451-]^給 出m/z 739.2954[M+H] +，（計(jì)算值為C39H47〇i4 739.2966)，確定分子式為C39H46〇i4。經(jīng)過(guò)核磁 共振氫譜Gh-nmr)、核磁共振碳譜( 13C-NMR)、質(zhì)子相關(guān)譜(4-? COSY)、梯度場(chǎng)異核單量子 相關(guān)譜(gHSQC)、異核多鍵相關(guān)(HMBC)和二維核奧弗豪澤效應(yīng)譜(N0ESY)的綜合解析，確定 斑鳩菊大苦素二聚體I的結(jié)構(gòu)，為一種新的化合物。核磁共振氫譜(氘代氯仿，600MHz)和核 磁共振碳譜(氘代氯仿，150MHz)數(shù)據(jù)見表1。
[0051 ]表1斑鳩菊大苦素二聚體I的核磁共振數(shù)據(jù)
[0052]
[0053]
[0054]
[0055] 其中d:表示二重峰，s:表示單峰，br s:表示寬單峰，m:表示多重峰。
[0056] 斑鳩菊大苦素二聚體J:U]i°二+645 (C0.Q8，甲醇)。叭（甲醇)λΜ nm(l〇ge) =202(3.31)。1以0〇〇· cm-^3447(羥基），1717和 1647(酯羰基），1636(雙鍵）。（+ )·-ESI-MS給出[M+H] +峰m/z : 739 · 2958，（計(jì)算值為C39H47〇i4 739 · 2965)，確定分子式為 C39H46〇i4。經(jīng)過(guò)核磁共振氫譜Gh-nmr)、核磁共振碳譜(13C-NMR)、質(zhì)子相關(guān)譜(4-?⑶SY)、 梯度場(chǎng)異核單量子相關(guān)譜(gHSQC)、異核多鍵相關(guān)(HMBC)和二維核奧弗豪澤效應(yīng)譜(N0ESY) 的綜合解析，確定斑鳩菊大苦素二聚體J的結(jié)構(gòu)，為一種新的化合物核磁共振氫譜(氘代氯 仿，600MHz)和核磁共振碳譜(氘代氯仿，150MHz)數(shù)據(jù)見表2。
[0057] 表2斑鳩菊大苦素二聚體J的核磁共振數(shù)據(jù)
[0058]
[0059]
[0060] 其中d:表示二重峰，s:表示單峰，br s:表示寬單峰，m:表示多重峰。
[0061] 斑鳩菊大苦素二聚體K:[a]f = +45. 5 (c 0.23，甲醇hUV(甲醇)λ"Μ nm(l〇g〇 =201(2.98)。（ + 迮51-]\^給出111/2 771[]\1+!1]+，793[]\1+恥]+，提示分子量為770。（ + )服451-]^ 給出[M+H]+峰m/z : 771 · 2866，（計(jì)算值為C39H47〇i6 771 · 2864)，確定分子式為C39H46〇i6。IR (KBr)提示有羥基(3435cm-酯羰基（1718cm-雙鍵（1625cm-4等基團(tuán)。經(jīng)過(guò)核磁共振氫 譜(h-NMR)、核磁共振碳譜( 13C-NMR)、質(zhì)子相關(guān)譜(4-? COSY)、梯度場(chǎng)異核單量子相關(guān)譜 (gHSQC)、異核多鍵相關(guān)(HMBC)和二維核奧弗豪澤效應(yīng)譜(N0ESY)的綜合解析，確定斑鳩菊 大苦素二聚體K的結(jié)構(gòu)，為一種新的化合物。核磁共振氫譜(氘代氯仿，600MHz)和核磁共振 碳譜(氘代氯仿，150MHz)數(shù)據(jù)見表3。
[0062] 表3斑鳩菊大苦素二聚體K的核磁共振數(shù)據(jù)
[0063]
[0064]
[0065] 共〒cl:衣不一里iu幸，s:衣不平iu幸，or s:衣不瓦平iu幸，m:衣不多里iu幸。
[0066] 實(shí)施例2體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)：
[0067] 實(shí)驗(yàn)方法:將本發(fā)明獲得的化合物斑鳩菊大苦素二聚體I、斑鳩菊大苦素二聚體J 和斑鳩菊大苦素二聚體K進(jìn)行體外腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性試驗(yàn)，試驗(yàn)方法采用常規(guī)的噻唑 藍(lán)(MTT)法；
[0068] 腫瘤細(xì)胞株:HCT-15(人結(jié)腸癌細(xì)胞）；PC-3(人前列腺癌細(xì)胞）；A549(人肺癌細(xì) 胞），由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供；
[0069] 實(shí)驗(yàn)試劑、耗材和儀器:噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMS0)，購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司； DMEM/F12培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)買于美國(guó)Gibco公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，購(gòu) 買于美國(guó)Hyclone公司；
[0070]實(shí)驗(yàn)用藥:化合物斑鳩菊大苦素二聚體I、斑鳩菊大苦素二聚體J和斑鳩菊大苦素 二聚體K，由實(shí)施例1制備，配成濃度為10mM的二甲基亞砜溶液，臨用前稀釋；
[0071] 細(xì)胞培養(yǎng):A549和PC-3細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，HCT-15細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI -1640培養(yǎng)基中，按照常規(guī)培養(yǎng)，四種細(xì)胞培養(yǎng)基中分別加入10%的胎牛血清(FBS)和1個(gè)單 位的抗生素混合物（1 X l〇5U/L的青霉素和100mg/L的鏈霉素），并置于溫度37°C、5%二氧化 碳/95 %空氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天；
[0072] 細(xì)胞毒活性測(cè)試:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺癌細(xì)胞A-549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15和 人前列腺癌細(xì)胞PC-3均以5X 103個(gè)/孔的密度分別接種于96孔微量培養(yǎng)板內(nèi)，置于溫度37 °C、5 %二氧化碳和95 %濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，吸出原培養(yǎng)基，加入不同體積 濃度梯度（1，10，25，50，75，100μΜ)的樣品溶液，體積為lOOyL/孔，對(duì)每個(gè)細(xì)胞株、每個(gè)濃度 均設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，另設(shè)無(wú)細(xì)胞調(diào)零孔、有細(xì)胞不含藥物對(duì)照組及陽(yáng)性藥物對(duì)照孔，在溫度37 °C、5 % C02條件下培養(yǎng)48小時(shí)后，每個(gè)孔中分別加10yL的噻唑藍(lán)（5mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 小時(shí);棄上清液，每個(gè)孔加入150yL二甲基亞砜，在搖床上搖10分鐘，待結(jié)晶溶解后，在570nm 波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度(0D)值。然后計(jì)算藥物對(duì)不同癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率以及半數(shù)抑 制量IC5〇值。
[0073] 按下列公式計(jì)算不同濃度樣品對(duì)細(xì)胞的抑制率：
[0074]
[0075] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:斑鳩菊大苦素二聚體I，J和K以及陽(yáng)性對(duì)照藥阿霉素的試驗(yàn)結(jié)果見表4。 [0076]表4.斑鳩菊大苦素二聚體I，J和K以及阿霉素對(duì)腫瘤細(xì)胞的1(： 50值
[0077]
[0078] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：化合物斑鳩菊大苦素二聚體I、斑鳩菊大苦素二聚體J和斑鳩菊大 苦素二聚體K對(duì)人肺癌細(xì)胞A-549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15、人前列腺癌細(xì)胞PC-3具有較明顯 的細(xì)胞毒活性，因此可以用于制備抗腫瘤藥物或作為抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半祗二聚體類化合物，其特征在于該化合物結(jié)構(gòu)式為：其中：結(jié)構(gòu)式1為斑鳩菊大苦素二聚體I，結(jié)構(gòu)式2為斑鳩菊大苦素二聚體J，結(jié)構(gòu)式3為 斑鳩菊大苦素二聚體K。2. -種如權(quán)利要求1所述的驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半祗二聚體類化合物的制備方法，其特 征在于按下列步驟進(jìn)行： a、 將粉粹的驅(qū)蟲斑鳩菊種子，用10倍量石油酸滲漉脫脂，藥渣驚干，用10倍量體積比1: 1:1的石油酸:乙酸：甲醇滲漉提取，提取液減壓回收溶劑，得到總提取物； b、 將步驟a得到的提取物，上硅膠柱，按體積比為100:0，100:10，100:40，100 :70，100: 100，50:100，0:100的石油酸：乙酸乙醋依次梯度洗脫，薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的流 份，得到流份A-J; C、取步驟b中的流份F，上硅膠柱，按體積比為100 :0，100 : 2，100 : 5，100 :10，100 : 50， 100:100的氯仿：甲醇，依次梯度洗脫，薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的流份，得到流份F1- F6； d、 取步驟C中的流份F2，上f lash快速制備系統(tǒng)，用反向Ci8色譜柱，按體積濃度為40%， 55% ,70% ,85%的甲醇:水進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，根據(jù)紫外吸收色譜圖進(jìn)行合并， 得到流份F21-F26; e、 取步驟d F24中的體積濃度為60% -80 %甲醇:水洗脫部位，用凝膠柱色譜，W甲醇為 洗脫劑洗脫，用薄層色譜檢識(shí)，合并相同斑點(diǎn)的流份； f、 取步驟e中分子量較大且薄層色譜上有明顯灰色斑點(diǎn)的部位，即第二個(gè)流份，用半制 備高效液相色譜儀反復(fù)進(jìn)行純化，高效液相色譜純化條件為25%-40%乙臘:水，流速2.5- 3ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210加1，按色譜圖收集，真空干燥后，經(jīng)高分辨質(zhì)譜W及一維和二維核磁 鑒定，得到化合物斑鳩菊大苦素二聚體I、斑鳩菊大苦素二聚體J和斑鳩菊大苦素二聚體K。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟d中反向Ci8色譜柱收集體積濃度為 60 % -80 %的甲醇:水部位。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的驅(qū)蟲斑鳩菊中的倍半祗二聚體類化合物在制備抗腫瘤人肺癌 細(xì)胞A-549、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15和人前列腺癌細(xì)胞PC-3活性中的用途。
【文檔編號(hào)】A61K31/366GK106083882SQ201610387850
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月4日 公開號(hào)201610387850.0, CN 106083882 A, CN 106083882A, CN 201610387850, CN-A-106083882, CN106083882 A, CN106083882A, CN201610387850, CN201610387850.0
【發(fā)明人】阿吉艾克拜爾·艾薩, 阿不拉江·圖拉克
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所