專利名稱：一種利用微生物降解苯并(a)芘的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及ー種利用微生物進行有害物質(zhì)的降解技木，特別涉及ー種用微生物降解苯并(a)芘的方法。
背景技術(shù)：
苯并(a)芘(以下縮寫成BaP)是世界公認的強致癌性多環(huán)芳烴污染物，這是因為其自身具有五環(huán)結(jié)構(gòu)，因此能積累在生物體中，導致生物染色體發(fā)生畸變，無序合成DNA，進而威脅到人類健康。BaP在環(huán)境中分布很廣。人們通過呼吸、飲水和進食等途徑都可能攝取到BaP。世界保健署和國際癌研究署曾將BaP定為2A類物質(zhì)；美國環(huán)保局已將其列入優(yōu)先控制有毒有機污染物的黑名単。由于BaP的次生代謝產(chǎn)物通常具有更強的毒性，因此利用 微生物實現(xiàn)BaP的有效降解一直是國內(nèi)外的研究熱點，但一直未能取得突破性進展。時至今日BaP對土壤污染問題已成為限制中國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大障礙之一。沈陽、蘭州和廣州等許多地區(qū)的土壌及地下水因BaP所造成的污染，已經(jīng)導致居民癌癥的發(fā)病和死亡率遠高于無此類污染的其他地區(qū)。20世紀80年代初，謝重閣等的測定結(jié)果表明，沈撫灌渠渣油BaP含量高達29 30mg · kg—1。ー些多環(huán)芳烴污染區(qū)附近的土壌BaP含量更是高達28 82mg · kg'因此，尋求一種降解BaP的方法，減輕當前由其所至嚴重污染的狀況已經(jīng)迫在眉睫。目前國內(nèi)許多BaP污染土壤的修復還主要圍繞“降解率”進行研究。從環(huán)境毒性的角度來看，僅用BaP的高降解率來衡量其所造成的環(huán)境污染的修復程度是不全面而且不準確的。因為未能快速降解的中間產(chǎn)物如醌、醇、酚等未開環(huán)中間產(chǎn)物仍然含有類似BaP的“三致”結(jié)構(gòu)一一 “K”區(qū)和“灣”區(qū)，而含有此“雙區(qū)”的多環(huán)芳烴化合物仍然和環(huán)境毒性相關(guān)聯(lián)，進而可以說BaP的有毒污染并未得到徹底消除。據(jù)Cerniglia等報道，BaP的致癌作用主要是其代謝產(chǎn)物與細胞大分子DNA相互作用所導致。因此，高降解率只是去除BaP的第一歩，而其次生代謝產(chǎn)物就像“邪惡黑客” 一樣繼續(xù)侵害人們健康的肌體，誘發(fā)致命的惡性腫瘤發(fā)生。努力探索BaP降解過程中的累積產(chǎn)物及其環(huán)境毒性，成為當今環(huán)境科學工作者的重要任務之一。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供ー種用微生物降解BaP的方法。本方法以BaP為目標污染物，運用經(jīng)篩選馴化的真菌黑曲霉，通過調(diào)控降解的共代謝底物、酸度、污染物濃度、真菌加入量等技術(shù)參數(shù)實施對BaP污染廢水的修復過程與機理，并應用于原位修復，實現(xiàn)良性生態(tài)循環(huán)，在經(jīng)濟效益、社會效益和環(huán)境效益等方面挑戰(zhàn)過去BaP的降解難題，實現(xiàn)對有毒物質(zhì)BaP的無毒無害無污染降解目標，達到有效降解BaP的目的。發(fā)明原理多環(huán)芳烴分子中具有致癌活性的物質(zhì)大都含有菲環(huán)結(jié)構(gòu)。對BaP分子來說，在相當于菲的4，5_鍵位(又稱中菲鍵)能形成致癌中心，即“K區(qū)”，因此具有強致癌性，致畸性和致遺傳毒性，嚴重威脅著人體的健康和安全，同時對土壌也有較強的污染作用。因此，本項發(fā)明的研究者采用具有降解作用的微生物對BaP分子進行強效降解，同時注重解決降解過程中可能遇到的各種極端環(huán)境條件對微生物的影響，比如高污染濃度、高酸度、堿性條件下，所用菌是否耐受，污染物質(zhì)的吸附效果與降解率的實際數(shù)值等。經(jīng)過反復試驗，從而達到了較為理想的效果。

發(fā)明內(nèi)容
為了達到上述的發(fā)明的目的，根據(jù)前述的原理及實驗方案進行反復試驗，通過如下技術(shù)方案，使得發(fā)明目的得以實現(xiàn)。(I)篩選降解菌種。利用現(xiàn)有菌庫中的真菌、細菌各十株進行篩選和馴化，最后各選出1-2株進行降解實驗。(2)代謝產(chǎn)物獲得。利用ニ氯甲烷提取產(chǎn)物，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，過硅膠小柱，常溫下利用氮氣N2吹干，甲醇定容，用HPLC定性和定量，用制備色譜分離樣品得到少量各代謝產(chǎn)物的純品。 (3)微生物降解途徑的確定。對各中間代謝產(chǎn)物進行核磁譜分析，確定各產(chǎn)物的具體分子結(jié)構(gòu)，最后對代謝產(chǎn)物的毒性和各種特性進行分析，從而最終確定出了微生物降解BaP的有效方法。新發(fā)明的BaP降解方法是(I)菌種選擇與馴化。確定了真菌黑曲霉為BaP的降解菌，為了提高真菌黑曲霉對BaP的降解率，對真菌黑曲霉進行馴化，具體的方式是在培養(yǎng)液中接入該菌種，然后按照一般的馴化方式階梯性加入一定濃度的目標污染物BaP，2個月后馴化基本完成。(2)菌種保存培養(yǎng)。選擇試管斜面保存作為菌種的保存方式。其中試管中的固體培養(yǎng)基為土豆培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分按每升所含物質(zhì)的重量并以克為單位(g/L)為土豆200g ;蔗糖20g，瓊脂20g ;蒸餾水IOOOmL.經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后，在試管斜面中接入真菌黑曲霉，使之起到活化和留種作用，將接入菌種的試管放入搖床，控制搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，在28°C 30°C溫度下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。(3)真菌黑曲霉種子培養(yǎng)。將種子培養(yǎng)液高壓滅菌后，將固體培養(yǎng)基培養(yǎng)出的菌種接入種子培養(yǎng)液并置入搖床中進ー步繁育擴大，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，在27°C 29°C下培養(yǎng)12 18h。然后即可按比例接入到被BaP污染的廢水中進行降解處理。其中真菌黑曲霉的種子培養(yǎng)液成分，按每升營養(yǎng)液所含物質(zhì)重量以克為単位(g/L)為:NH4N03，1 ;MgS04*7H20，
O.2 ；CaCl2 · 2H20,0. 01 ；FeS04 · 7H20,0. 01 ；KH2PO4,0. 4 ；Na2HP04 · 12H20,0. 6 ；MnS04,0 . 02 ;葡萄糖,0. 5。(4) BaP進行降解處理。利用篩選馴化出比較好的真菌黑曲霉，對污水中的污染物BaP進行降解，其條件是BaP的濃度為< 150mg/L ;真菌黑曲霉種子液的加入量按重量百分數(shù)計為污水重量的10%;ρΗ值為5. 0-7. 5 ;共代謝底物是琥珀酸鈉，濃度低于BaP濃度的一半；降解適宜溫度范圍為18-32°C，最佳溫度是28で。發(fā)明的優(yōu)點與效果微生物降解法具有原材料來源豐富、成本低廉、吸附速度快、吸附量大等優(yōu)點。本項發(fā)明是以微生物為實驗的中心材料，以生活中的BaP為目標污染物，所完成的發(fā)明方法具有如下優(yōu)點
(I)實驗時結(jié)合BaP在其降解過程中的溫度、pH、以及微生物自身的數(shù)量等影響因素的變化，利用微生物自身的有利條件，在菌類投放量為5% -15%的情況下可以收到較為理想的降解效果，其中10%時收到的效果最佳。(2)經(jīng)對其代謝產(chǎn)物的詳細分析(主要的降解代謝產(chǎn)物為BPl，6_quinone和3-0HBP)和計算表明，該方法對BaP的降解率可達到70 %，而且所有代謝產(chǎn)物在自然條件下均已成為無毒無害物質(zhì)，有效地降低了 BaP的毒性，同時建立和豐富了 BaP的微生物降解途徑。(3)此項發(fā)明的成功應用，在實際環(huán)境條件下，將為BaP污染廢水的治理與修復提供經(jīng)濟可靠的先進處理方法。實現(xiàn)保護環(huán)境，改善生態(tài)的良性生態(tài)循環(huán)。不但實現(xiàn)社會效益和環(huán)境效益的最大化，也可獲得可觀的經(jīng)濟效益。實施方式
通過本項發(fā)明方法對于BaP污染廢水進行處理，處理時地溫度為28 V，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為150r/min，真菌黑曲霉的投加量為污水總重量的10%，降解時間為5d，經(jīng)取樣化驗，BaP去除率已經(jīng)達到了 80%以上。處理后廢水達到的具體指標為pH = 6. 0-7. O ;生化需氧量B0D5 ( 30mg/L ;化學需氧量(重鉻酸鉀法)COD ( 90mg/L ;揮發(fā)酚< O. lmg/L ;氮(NH3形式存在)(2. 5mg/L ；SS (固體懸浮物)(20mg/L ;總汞< O. 03mg/L ;總鉛< O. 008mg/L ;總鎘< O. 01mg/L。表明用上述微生物對BaP復合污染廢水進行治理是完全可行的。
權(quán)利要求
1.ー種降解苯并(a)芘用微生物的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法選擇真菌黑曲霉為苯并(a)芘的降解菌，經(jīng)過2個月的苯并(a)芘降解馴化后，選擇試管斜面固體培養(yǎng)基保存馴化后的真菌黑曲霉菌種，將接入菌種的試管放入搖床，控制搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，在28°C 30°C溫度下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，然后將試管斜面固體培養(yǎng)基保存的真菌黑曲霉菌種接入種子培養(yǎng)液中并置入搖床內(nèi)進ー步繁育擴大，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，在27°C 29°C下培養(yǎng)12 18h。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所說的降解苯并(a)芘用微生物的培養(yǎng)方法，其特征在于方法中所使用的試管內(nèi)的固體培養(yǎng)基為土豆培養(yǎng)基，培養(yǎng)基成分按每升所含物質(zhì)的重量并以克為單位(g/L)為:土豆200g ;鹿糖20g，瓊脂20g ;蒸懼水IOOOmLo
3.根據(jù)權(quán)利要求I所說的降解苯并(a)芘用微生物的培養(yǎng)方法，其特征在于方法中所使用的種子培養(yǎng)液成分，按每升營養(yǎng)液所含物質(zhì)重量以克為単位(g/L)為=NH4NO3,1 ;MgSO4 · 7Η20，0· 2 ；CaCl2 · 2Η20，0· 01 ；FeSO4 · 7Η20，0· 01 ;ΚΗ2Ρ04，0· 4 ；Na2HPO4 · 12Η20，0· 6 ；MnSO4,0. 02 ;葡萄糖，O. 5。
4.ー種利用微生物降解苯并(a)芘的方法，其特征在于利用篩選馴化好的真菌黑曲霉對污水中的污染物苯并(a)芘進行降解，其條件是苯并(a)芘的濃度為< 150mg/L ;真菌黑曲霉種子液的加入量按重量百分數(shù)計為污水重量的10% ;pH值為5. 0-7. 5 ;共代謝底物是琥珀酸鈉，濃度低于苯并(a)芘濃度的一半；降解溫度范圍為18-32°C。
全文摘要
一種降解苯并(a)芘用微生物的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法選擇真菌黑曲霉為苯并(a)芘的降解菌，經(jīng)馴化后，選擇試管斜面固體培養(yǎng)基和營養(yǎng)液保存馴化后的真菌黑曲霉菌種。利用真菌黑曲霉對污水中的污染物苯并(a)芘進行降解，真菌黑曲霉種子液的加入量為污水重量的10％；pH值為5.0-7.5；降解溫度范圍為18-32℃，經(jīng)處理后苯并(a)芘的去除率可達到80％以上，收到了較為理想的效果。
文檔編號C02F3/34GK102690758SQ20111007199
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者安宇, 席賽男, 常美佳 申請人:安宇, 席賽男, 常美佳