專利名稱：布魯氏菌檢測用雜交瘤細胞株17c8及其產(chǎn)生的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以布魯氏菌全菌為抗原免疫小鼠獲得的雜交瘤細胞株17C8及其產(chǎn)生的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
布魯氏菌病是一種由布魯氏菌引起的人畜共患病。布魯氏菌能引起哺乳動物的流產(chǎn)、不孕、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等，同時由于它容易形成氣溶膠，具有很高的傳染性，所以還被用作生物戰(zhàn)劑。傳統(tǒng)的布魯氏菌檢測采用血清學(xué)的方法，主要包括玫瑰花環(huán)試驗、試管凝集試驗 (SAT)、虎紅平板凝集試驗(RBPT)、補體結(jié)合試驗(CFT)、抗人球蛋白試驗(C00MB’ S)，以及能夠標準化的ELISA方法等。血清學(xué)方法的不足之處在于它的敏感性較低，而且與霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏、EHEC、沙門氏菌、福氏志賀菌等容易發(fā)生交叉反應(yīng)。因此，制備布魯氏菌高親和力的單克隆抗體，且制備的抗體能夠識別各個種型的布魯氏菌，將為布魯氏菌病診斷方法的研究奠定很好的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于布魯氏菌檢測的雜交瘤細胞株及其產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明所提供的以布魯氏菌全菌為抗原免疫小鼠獲得的雜交瘤細胞株，名稱為 17C8，細胞株17C8已于2011年6月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4971。由雜交瘤細胞株17C8產(chǎn)生的單克隆抗體命名為17C8anti，來源于小鼠屬小鼠 (Mus musculus)，也屬于本發(fā)明的保護范圍。17C8 CGMCC No. 4971產(chǎn)生的單克隆抗體與所有布魯氏菌毒株(如M4A、16M、臨床株S95(與16M為同種菌)等)以及疫苗株(如52工195、10411等)均能夠產(chǎn)生特異性免
疫反應(yīng)。本發(fā)明的另外一個目的是提供一種制備上述單克隆抗體的方法。具體來講，本發(fā)明單克隆抗體的制備方法，可包括以下步驟1)用布魯氏菌全菌抗原作為免疫原免疫動物；2)分離免疫動物的脾細胞，將其與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞；3)篩選并培養(yǎng)雜交瘤細胞；4)從細胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離并純化出單克隆抗體。在上述單克隆抗體的制備方法中，步驟1)中的布魯氏菌全菌抗原可為活菌或滅活菌，優(yōu)選為活菌抗原，濃度為lX108-lX109CFU/mL;用于制備單克隆抗體的免疫動物可為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、驢、馬等哺乳動物，優(yōu)選為小鼠。步驟2~)中當被免疫動物的血清抗體水平達到峰值時，可分離動物的脾細胞并制備成單細胞懸液。必要時，可使用免疫吸附方法篩選脾細胞，并在適當?shù)娜诤蟿?如聚乙二醇)的誘導(dǎo)下與骨髓瘤細胞(優(yōu)選為小鼠骨髓瘤細胞SP2/0)融合以形成雜交瘤。步驟3)中可以在選擇性培養(yǎng)基(如HAT培養(yǎng)基)中培養(yǎng)以篩選融合的雜交瘤細胞，并進一步可使用流式細胞術(shù)、Western印跡法、免疫沉淀法等方法鑒定所需的陽性抗性細胞株。步驟4)中可于體外(如在組織培養(yǎng)瓶或多孔纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠腹水)培養(yǎng)所選擇的分泌區(qū)分布魯氏菌毒株和疫苗株的單克隆抗體的雜交瘤，并從細胞培養(yǎng)液或小鼠腹水液中收集和純化出單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一種檢測布魯氏菌的試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測布魯氏菌的試劑盒，包含有雜交瘤細胞株17C8 CGMCC No. 4971產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明提供了以布魯氏菌全菌為抗原免疫小鼠獲得的雜交瘤細胞株17C8 CGMCC No. 4971及其產(chǎn)生的單克隆抗體。實驗證明，雜交瘤細胞株17C8 CGMCC No. 4971產(chǎn)生的單克隆抗體與所有布魯氏菌菌株(毒株和疫苗株)均能夠反應(yīng)，與其它菌株不反應(yīng)，特異性較高，因而可用于布魯氏菌的檢測中。根據(jù)本發(fā)明單抗株的特征，可以建立檢測布魯氏菌抗原和血清的方法，應(yīng)用前景廣闊。生物材料說明本發(fā)明雜交瘤細胞株，名稱為17C8，為單克隆細胞株，該細胞株已于2011年6月 16日保藏于位于中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 4971。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。


圖1為小鼠三次免疫后的血清抗體效價趨勢2為三次亞克隆后挑選細胞上清ELISA檢測結(jié)果圖3A-圖3C為擴大培養(yǎng)各代雜交瘤細胞抗體效價檢測結(jié)果
具體實施例方式實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例1、雜交瘤細胞株17C8 CGMCC No. 4971及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得1、菌株培養(yǎng)取-80°C保存菌種-布魯氏菌強毒株Brucella melitensis 16M(簡稱16M，購自生物制品檢定所)，按1 100比例接種于TSB培養(yǎng)基(購自生物梅里埃公司)中，37°C、 200rpm振蕩培養(yǎng)48h。用接種環(huán)挑取少量，在TSA平板(購自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)上劃線分純，37°C培養(yǎng)7 后，挑取單個菌落接種5mL TSB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)48h。按1 100比例轉(zhuǎn)接到200mL TSB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)中期。在菌液中加入終濃度為4% (體積百分濃度)甲醛溶液，室溫作用IOmin滅活細菌。將滅活的16M菌液6000rpm離心lOmin，收集菌體，然后用PBS稀釋至1 X 108CFU/mL,和活菌1 X 109CFU/mL 一起作為全菌免疫抗原。2、動物免疫整個免疫過程將小鼠(SPF級，Balb/c小鼠，雌性，6_8周齡，體重18_22g，購于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心)分為兩組(每組4只)進行，A組為滅活全菌抗原免疫組，B 組為活菌免疫組。取全菌抗原(活菌1 X 109CFU/mL或滅活菌1 X 108CFU/mL)與弗式完全佐劑(購自Sigma公司)按1 1比例混合，乳化抗原直至達到油包水狀態(tài)。采取皮下注射方式免疫，每只0. 2mL。分別于初次免疫后第四周和第六周用弗式不完全佐劑(購自Sigma 公司)按同樣方法分別對小鼠進行第二次免疫和第三次免疫。每次免疫一周后，由小鼠尾靜脈取血50 μ 1測定抗體效價。選擇血清效價高的小鼠脾臟進行細胞融合實驗。融合前3 天，取效價較高的小鼠以腹腔注射方式，注射1. 5 X 108CFU/mL全菌抗原0. 5mL，作為加強免疫一次。3、抗體效價測定取免疫小鼠和健康小鼠尾靜脈血50 μ 1，室溫靜置lh，4°C放置ai，3000rpm離心 lOmin，收集血清，4°C保存?zhèn)溆?。采用間接ELISA方法對上述收集血清進行抗體效價測定。 檢測血清或腹水效價時，對血清或腹水用PBS做倍比(依次稀釋800倍、1600倍、3200倍、 6400倍)稀釋，ΙΟΟμΙ/孔，以正常小鼠血清為陰性對照。用同樣方法檢測細胞上清的效價，無菌條件下取細胞上清，100 μ 1/孔加樣到包被好的酶標板中，同時，每板分別選取無細胞生長的兩孔為陰性對照。另外，酶聯(lián)板兩孔加入陽性血清作為陽性對照。以450nm單波長測定各孔OD值，以空白孔調(diào)零。以O(shè)D > 0. 2作為判定陽性，以與陰性對照孔OD值比值 (P/N)大于2. 1為限，判定為效價臨界值。三次免疫后血清抗體效價測定結(jié)果如表1-表3和圖1所示，可以看出隨著免疫次數(shù)的增加，小鼠血清的效價明顯升高，并且布魯氏菌活菌免疫組免疫后的抗體效價優(yōu)于滅活全菌抗原免疫組。因此，下一步細胞融合中選擇了活菌全抗原免疫后效價最高的B組 4號小鼠作為細胞融合對象。表1第一次免疫后效價(1 800,1 1600,1 3200,1 6400為稀釋比例)
權(quán)利要求
1.以布魯氏菌全菌為抗原免疫小鼠獲得的雜交瘤細胞株17C8CGMCC No. 4971。
2.由權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株17C8CGMCC No. 4971產(chǎn)生的單克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其特征在于與所有布魯氏菌毒株以及布魯氏菌疫苗株均能夠產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其特征在于所述布魯氏菌毒株為M4A、臨床株 S95和16M,所述疫苗株為S2、S19、M5和104M。
5.一種制備權(quán)利要2-4任一項所述單克隆抗體的方法，包括以下步驟1)用布魯氏菌全菌抗原作為免疫原免疫動物；2)分離免疫動物的脾細胞，將其與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞；3)篩選并培養(yǎng)雜交瘤細胞；4)從細胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離并純化出單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述步驟1)中的布魯氏菌全菌抗原為活菌或滅活菌，優(yōu)選為活菌抗原，濃度為IX IO8-I X 109CFU/mL;用于制備單克隆抗體的免疫動物為小鼠、大鼠、兔、山羊、綿羊、豬、驢、馬等哺乳動物，優(yōu)選為小鼠。
7.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細胞株17C8CGMCC No. 4971在布魯氏菌檢測中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2-4任一項所述的單克隆抗體在布魯氏菌檢測中的應(yīng)用。
9.一種檢測布魯氏菌的試劑盒，包含有權(quán)利要求2-4任一項所述的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了以布魯氏菌全菌為抗原免疫小鼠獲得的雜交瘤細胞株17C8 CGMCC No.4971及其產(chǎn)生的單克隆抗體。所述單克隆抗體的制備方法包括以下步驟1)用布魯氏菌全菌抗原作為免疫原免疫動物；2)分離免疫動物的脾細胞，將其與骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞；3)篩選并培養(yǎng)雜交瘤細胞；4)從細胞培養(yǎng)液或接種雜交瘤細胞的動物的腹水液中分離并純化出單克隆抗體。實驗證明，雜交瘤細胞株17C8CGMCC No.4971產(chǎn)生的單克隆抗體與所有布魯氏菌菌株(毒株和疫苗株)均能夠反應(yīng)，特異性較高，因而可用于布魯氏菌的檢測中。根據(jù)本發(fā)明單抗株的特性，可以建立檢測布魯氏菌抗原和血清的方法，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號G01N33/577GK102391993SQ20111036329
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者于爽, 杜昕穎, 汪舟佳, 王玉飛, 苑錫銅, 袁靜, 陳澤良, 黃留玉 申請人:中國人民解放軍疾病預(yù)防控制所