鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種改良的鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)（AssistedReproductiveTechnologies,ART）質(zhì)量的方法和試劑盒。利用小鼠胚胎發(fā)育各期細(xì)胞數(shù)和囊胚表達(dá)UTF1陽性細(xì)胞數(shù)兩項指標(biāo)作為鼠胚試驗（MouseEmbryoAssay,MEA）中檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法，屬于細(xì)胞學(xué)、生物【技術(shù)領(lǐng)域】。在目前國際常用的標(biāo)準(zhǔn)MEA的基礎(chǔ)上，增加了兩個標(biāo)準(zhǔn)：（1）每12小時胚胎發(fā)育期胚胎所含細(xì)胞的總數(shù)；（2）囊胚表達(dá)UTF1陽性細(xì)胞數(shù)和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)CDX2的細(xì)胞數(shù)及其兩者占囊胚總細(xì)胞數(shù)的比例。通過比較體外培養(yǎng)發(fā)育的胚胎和體內(nèi)同期胚胎的以上兩個標(biāo)準(zhǔn)，為檢測輔助生殖技術(shù)的質(zhì)量控制包括優(yōu)化體外培養(yǎng)條件及優(yōu)化胚胎培養(yǎng)液提供了更敏感和有效的手段，為改善輔助生殖技術(shù)提供了參考標(biāo)準(zhǔn)。
【專利說明】鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生殖生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說涉及一種改良的鼠胎試驗檢測輔助生殖 技術(shù)質(zhì)量的方法。
[0002]

【背景技術(shù)】
[0003] 目前體外受精后植入前胚胎最關(guān)鍵的制約因素是，人類尚未發(fā)現(xiàn)一種無損傷方法 以確定胚胎的質(zhì)量，以保證移植的胚胎具有最高的質(zhì)量。因此存在著明顯的人為的不確定 因素影響了輔助生殖技術(shù)的發(fā)展。
[0004] 由于輔助生殖技術(shù)的特殊性，各種條件的研究包括胚胎培養(yǎng)液不可能直接通過人 類胚胎來完成，而是通過小鼠和兔為模型。因此目前小鼠胚胎試驗（Mouse embryo assay, MEA)作為檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的常規(guī)手段。MEA是采用小鼠胚胎體外常規(guī)培養(yǎng)體系，在 從受精卵到囊胚的培養(yǎng)過程中，根據(jù)待檢產(chǎn)品的功能和特性，在相應(yīng)培養(yǎng)環(huán)節(jié)使用待檢液 體類產(chǎn)品或者器具類產(chǎn)品的浸提液，通過觀察早期胚胎從受精卵到囊胚的發(fā)育情況來評價 待檢產(chǎn)品對胚胎發(fā)育的潛在毒性。而常用的MEA的基本指標(biāo)是囊胚的生成率，也可能包括 了多個胚胎發(fā)育時間段的發(fā)育情況如8-細(xì)胞生成率，囊胚細(xì)胞數(shù)。然后這些指標(biāo)已不能完 全符合輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)的要求。例如，小鼠受精卵在低氧濃度（5%)的條件下培養(yǎng) 能獲得更好的胚胎發(fā)育力[l]Jin2014)。然而，小鼠受精卵在5%和20%氧濃度的條件下培 養(yǎng)96小時都能獲得相同的囊胚生成率。這種傳統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)也不能鑒別不同培養(yǎng)條件，培養(yǎng)液 種類，器械耗材，操作流程等因素對輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的影響。因此，需要進一步改良完善 MEA以保證輔助生殖技術(shù)的成功和質(zhì)量。
[0005] 參考文獻[1] Xing L Jin and Chris 0, Neil. Systematic analysis of the factors that adversely affect the rate of cell accumulation in mouse embryos during their culture in vitro. Reproductive Biology and Endocrinology 2014， 12:35


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：本發(fā)明的目的是提供一種改良的鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方 法和試劑盒，進一步改良完善MEA標(biāo)準(zhǔn)以保證輔助生殖技術(shù)的成功和質(zhì)量，為檢測輔助生 殖技術(shù)的質(zhì)量控制包括優(yōu)化體外培養(yǎng)條件及優(yōu)化體外培養(yǎng)液提供了更敏感和有效的手段。
[0007] 技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案： 一種鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法，該方法包括MEA檢測方法，該方法在原 有鼠胎試驗的基本標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，增加了兩個檢測指標(biāo)及對該檢測指標(biāo)的檢測方法， 所述兩個指標(biāo)分別為胚胎的細(xì)胞總數(shù)和囊胚期胚胎中內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的總數(shù)； 所述兩個對檢測指標(biāo)的檢測方法分別包括下述步驟： a)胚胎的細(xì)胞總數(shù)的檢測方法：比較受精卵體外培養(yǎng)發(fā)育（in vitro)的胚胎與體內(nèi) 發(fā)育（in vivo)的同期胚胎內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)； b)囊胚期胚胎中內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的總數(shù)的檢測方法：比較體外培養(yǎng)生成 的囊胚和體內(nèi)發(fā)育的囊胚內(nèi)細(xì)胞團表達(dá)UTFl和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)CDX2的細(xì)胞數(shù)，及其兩者 各占囊胚總細(xì)胞數(shù)的比率。
[0008] 優(yōu)選地，所述方法a)中體外培養(yǎng)發(fā)育和體內(nèi)發(fā)育胚胎的細(xì)胞總數(shù)取得的方法是： 從小鼠超排合籠后48小時至96小時,每12小時檢測胚胎內(nèi)的小鼠胚胎細(xì)胞數(shù)一次， 共5次至；其中每12小時胚胎所含細(xì)胞總數(shù)的計數(shù)方法如下： 上述小鼠胚胎細(xì)胞數(shù)是通過一步細(xì)胞計數(shù)試劑盒將小鼠胚胎細(xì)胞固定和染色半小時 后制片，在40倍熒光顯微鏡下計數(shù)；其中所計數(shù)的小鼠胚胎細(xì)胞為具有正常細(xì)胞核形態(tài) 學(xué)的細(xì)胞，并不包括碎裂細(xì)胞。
[0009] 優(yōu)選地,所述一步細(xì)胞計數(shù)試劑盒包括： A. 固定染色液：包括磷酸鹽緩沖液PBS加多聚甲醛1-5克/100毫升，pH值為7. 4, 5-50 毫微克/毫升的雙苯甲亞胺Hoechst 33342 ; B. 制片液：磷酸鹽緩沖液PBS加抗褪色劑。
[0010] 優(yōu)選地，所述方法b)中囊胚內(nèi)細(xì)胞團表達(dá)胚胎干細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記UTFl和滋養(yǎng)層 細(xì)胞表達(dá)CDX2的細(xì)胞數(shù)采用胚胎免疫熒光技術(shù)試劑盒檢測。
[0011] 優(yōu)選地，所述胚胎免疫熒光技術(shù)試劑盒包括： a. 固定液：由PBS加1-5克/100毫升的多聚甲醛PFA組成，pH值為7. 0-7. 8 ; b. 細(xì)胞膜打孔液：固定液加0. 1-0. 5微升/100毫升的聚山梨酯TWEEN-20和0. 1-0. 5 微升/100毫升的聚乙二醇對-(1，1，3, 3 -四甲基丁基）-苯基醚TRITON X 100 ; c. 胚胎漂洗液：PBS加0. 01-0. 04微升/100毫升的聚山梨酯TWEEN-20; d. 三種不同色譜的DNA染色液： 1) PBS 加 5-50 毫微克 / 毫升的 Hoechst 33342; 2) PBS加0. 01-1. 0毫微克/毫升的碘化丙啶； 3) PBS加1-50毫微克/毫升的4'，6 -二脒-2 -苯基吲哚DAPI ; e. 制片液：PBS加抗褪色劑。
[0012] 優(yōu)選地，所述采用胚胎免疫熒光技術(shù)試劑盒的檢測方法如下： 1) 室溫下小鼠胚胎在胚胎漂洗液內(nèi)漂洗3次； 2) 將上述小鼠胚胎移入固定液，在室溫下固定10-60分鐘，然后移至細(xì)胞膜打孔液 10-60分鐘，再以胚胎漂洗液漂洗胚胎10-20分鐘，重復(fù)多次； 3) 將上述處理后的胚胎在室溫下置于體積比為15-30%的與二級抗體相同源的動物血 清中1-3小時以封殺非特異性的抗體結(jié)合位點； 4) 在4°C -20°C條件下將步驟3)處理后的胚胎與初級抗體結(jié)合8-16小時，再以胚胎漂 洗液漂洗胚胎10-20分鐘，重復(fù)多次；其中，所述的初級抗體為抗UTFl和CDX2的抗體； 5) 室溫下，在避光條件下將步驟4)處理后的胚胎與二級抗體結(jié)合1-2小時；再以胚胎 漂洗液漂洗胚胎10-20分鐘，重復(fù)多次； 6) 根據(jù)二級抗體所聯(lián)結(jié)熒光色譜，將步驟5)漂洗后的胚胎移至DNA染色液中，在室溫 避光條件下孵化10-50分鐘；所述DNA染色液的熒光色素必須與二級抗體所聯(lián)結(jié)熒光色素 不同，以區(qū)分DNA和被標(biāo)記的抗原UFTFl或⑶X2 ; 7) 將步驟6)孵化后的胚胎移至制片液，制片；置于室溫避光條件下10-30分鐘； 8) 采用熒光顯微鏡技術(shù)檢查胚胎表達(dá)UTFl和CDX2的細(xì)胞總數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算其占 總細(xì)胞數(shù)的比率。
[0013] 有益效果：本發(fā)明的一種改良的利用小鼠胚胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方 法，在傳統(tǒng)MEA的基礎(chǔ)上，增加了兩個新的標(biāo)準(zhǔn)：通過每12小時檢測不同培養(yǎng)發(fā)育期胚胎的 細(xì)胞數(shù)；和囊胚胚胎免疫熒光表達(dá)UTFl陽性的內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞數(shù)和免疫熒光表達(dá)CDX2陽性 的滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)的能力。這兩個新標(biāo)準(zhǔn)都是通過體內(nèi)外同期胚胎相比較，直接檢測 到體外培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)缺點，為輔助生殖技術(shù)流程中的各個因素的標(biāo)準(zhǔn)化提供了一種簡單易 行的敏感的檢測手段，從而提高了受精卵體外生長發(fā)育，改善胚胎的質(zhì)量。
[0014]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1為小鼠受精卵(注射hCG并合籠后20小時)在三種體外培養(yǎng)液下培養(yǎng)84小時 后（hCG后104小時）囊胚期胚胎的百分率及每個胚胎的細(xì)胞數(shù)。
[0016] 圖2為受精卵在KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng)后與體內(nèi)同期胚胎形態(tài)學(xué)特征。
[0017] 圖3為受精卵在KSOM或SlVF培養(yǎng)液中培養(yǎng)后與體內(nèi)同期胚胎比較其所含的細(xì)胞 數(shù)。
[0018] 圖4為同一囊胚中內(nèi)細(xì)胞團UTFl的陽性細(xì)胞，滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)⑶X2的陽性細(xì)胞 和通過Hoechst33342染色的細(xì)胞核DNA ; 圖5為同一囊胚中內(nèi)細(xì)胞團UTFl的陽性細(xì)胞數(shù)，滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)CDX2的陽性細(xì)胞數(shù)， 以及兩者占總細(xì)胞數(shù)的比例。
[0019]

【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0021] 實施例1 本發(fā)明將小鼠受精卵在幾種目前臨床常用的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分析囊胚期胚胎的生成率 和囊胚的細(xì)胞數(shù)，不同生長發(fā)育期胚胎的總細(xì)胞數(shù)，囊胚期胚胎內(nèi)陽性表達(dá)胚胎干細(xì)胞生 物學(xué)指標(biāo)UTFl和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)CDX2的細(xì)胞數(shù)。通過與同期生長發(fā)育的胚胎相比較，可 明顯發(fā)現(xiàn)小鼠受精卵在不同的培養(yǎng)液中生長產(chǎn)生了不同質(zhì)量的胚胎。
[0022] 小鼠受精卵進行胚胎培養(yǎng)需滿足如下培養(yǎng)條件： 1) 以10微升培養(yǎng)液微滴，上面覆蓋大約2毫米厚的礦物油； 2) 37°C恒溫、保濕，通入5 % O2 + 5% CO2 + 90% N2的混合氣體； 3) 臺式孵化器（COOK公司），氣體流量為每分鐘15毫升； 4) 加入胚胎前，培養(yǎng)液必須在孵化箱內(nèi)平衡至少3小時，pH值至7. 4 ; 5) 胚胎在培養(yǎng)液中的密度為10微升培養(yǎng)液中加入10個受精卵； 小鼠胚胎試驗（Mouse embryo assay, MEA)步驟如下： 1)試驗動物品系：F1雜交CBA/C57小鼠。
[0023] 2)試驗動物周齡：雌鼠4-8周齡，成熟雄鼠。
[0024] 3)超數(shù)排卵：Γ8周齡雌鼠，經(jīng)腹腔注射PMSG (孕馬血清促性腺激素）10 IU/只； 48小時后經(jīng)腹腔注射hCG (人絨毛膜促性腺激素）10 IU/只，注射hCG當(dāng)日雌鼠與同品系 雄鼠合籠過夜。第二天上午8點檢查交配情況，選擇見栓小鼠備用。
[0025] 4)使用目前常用的人類胚胎培養(yǎng)液(如Sydney IVF，KSOM培養(yǎng)液）作對照，培養(yǎng) 胚胎的當(dāng)天在細(xì)胞培養(yǎng)皿中制備10 - 50微升大小的液體微滴，表面覆蓋培養(yǎng)用石蠟油， 在37 °C、5% CO2和90 %飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)平衡至少4個小時。
[0026] 5) 1-細(xì)胞鼠胚收集：注射hCG后20小時斷頸處死見栓雌鼠，在輸卵管壺腹部收 集1-細(xì)胞鼠胚。將收集到的絮狀受精卵團放置到透明質(zhì)酸酶（150 Pg/mL)中，當(dāng)胚胎周圍 的卵丘和顆粒細(xì)胞被消化分離后立即取出。用緩沖液清洗3次后，挑選出正常形態(tài)的胚胎， 轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)微滴中，用于1-細(xì)胞鼠胚檢測試驗。胚胎在培養(yǎng)液中的濃度為每10微升液滴 中放入10個胚胎。
[0027] 6)體外培養(yǎng)：采用微滴法培養(yǎng)，將收集到的鼠胚，置于預(yù)平衡的微滴中，于37 °C， 5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以鼠胚數(shù)為10個，在10微升大小的液體微滴培養(yǎng)的密 度為標(biāo)準(zhǔn)。
[0028] 7)試驗結(jié)果及基本指標(biāo)觀察： A. 囊胚形成率：1_細(xì)胞胚胎體外分別培養(yǎng)96小時后記錄囊胚數(shù)量質(zhì)量，對形成囊胚的 受精卵比例進行計算。
[0029] 囊胚形成率（％) =囊胚數(shù)/ 1-細(xì)胞期的胚胎數(shù)X 100% B. 囊胚質(zhì)量判斷：囊胚形態(tài)觀察：發(fā)育良好的囊胚，囊胚腔充分?jǐn)U張，內(nèi)細(xì)胞團大小適 中，滋養(yǎng)層細(xì)胞連接緊密且大小均勻。發(fā)育差的囊胚，囊胚腔小，內(nèi)細(xì)胞團小或無內(nèi)細(xì)胞團， 滋養(yǎng)層細(xì)胞稀疏。
[0030] 本發(fā)明進一步檢測不同生長發(fā)育期的胚胎的總細(xì)胞數(shù)和囊胚期胚胎內(nèi)陽性表達(dá) 胚胎干細(xì)胞生物學(xué)指標(biāo)UTFl和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)⑶X2的細(xì)胞數(shù)。通過與同期體內(nèi)生長發(fā)育 的胚胎相比較，可明顯發(fā)現(xiàn)小鼠受精卵在不同的培養(yǎng)液中生長產(chǎn)生了不同質(zhì)量的胚胎。
[0031] 下面通過相關(guān)試驗進行說明。
[0032] 實施例2 比較分析目前市場上常用的培養(yǎng)液對囊胚生成率及其總細(xì)胞數(shù)的影響。
[0033] 受精卵在KSOM，KS0M+AA和sIVF培養(yǎng)液培養(yǎng)至hCG后108小時后進行胚胎質(zhì)量試 驗。
[0034] 受精卵培養(yǎng)：培養(yǎng)條件為37°C恒溫、保濕，通入5 % O2 + 5 % CO2 + 90% N2的混合 氣體；三種體外培養(yǎng)液是目前市場常用的KS0M，KS0M + AA(KS0M加入包含全部必需氨基酸 和非必需氨基酸）和sIVF (Sydney IVF培養(yǎng)液，包括卵裂液和囊胚液）。受精卵在KSOM 和KS0M+AA培養(yǎng)為全程84小時，在sIVF培養(yǎng)液中是分程培養(yǎng)，前48小時在卵裂液中而后 移植至囊胚液。胚胎培養(yǎng)液采用COOK公司生產(chǎn)的產(chǎn)品sIVF胚胎培養(yǎng)液(此培養(yǎng)液是目前 最廣泛應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)的胚胎培養(yǎng)液之一)和KSOMK及S0M+AA胚胎培養(yǎng)液進行對比， 在相同條件下體外培養(yǎng)受精卵。通過胚胎的形態(tài)學(xué)特點記錄并計算出hCG后108小時受精 卵培養(yǎng)后囊胚期胚胎的生成率，然后利用"一步細(xì)胞計數(shù)試劑盒"，并在熒光顯微鏡下檢測 每個胚胎的總細(xì)胞數(shù)。對比結(jié)果如圖1所示，按照傳統(tǒng)MEA受精卵在三種不同培養(yǎng)液中培 養(yǎng)84小時后都到達(dá)了 80%以上的囊胚生成率，符合了目前國際標(biāo)準(zhǔn)。然而每個胚胎平均的 細(xì)胞數(shù)是統(tǒng)計學(xué)上有意義的不同。這說明囊胚生成率已不能正確反映胚胎的質(zhì)量。與其 它兩種培養(yǎng)液相比較，*P值〈〇. 〇〇1。
[0035] 從圖1中可以看出，hCG后108小時受精卵在三種培養(yǎng)液中囊胚期胚胎的生成率 無明顯不同，都超過了 80%，已符合了目前世界認(rèn)可的MEA標(biāo)準(zhǔn)。但是細(xì)胞數(shù)有顯著差異， 在KSOM培養(yǎng)液中生成的囊胚有最低的細(xì)胞數(shù)。本實驗結(jié)果提示了需要更敏感的方法確定 胚胎質(zhì)量。
[0036] 實施例3 與體內(nèi)同期胚胎的總細(xì)胞數(shù)比較分析目前市場上常用的培養(yǎng)液對不同生長發(fā)育期胚 胎的總細(xì)胞數(shù)的影響。
[0037] 將見栓當(dāng)日受孕小鼠分為三組，兩組收集受精卵并在KSOM和SlVF培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為37°C恒溫、保濕，通入5 % O2 + 5 % CO2 + 90% N2的混合氣體。另一組小鼠收 集體內(nèi)同期胚胎。三組均以注射hCG后的相同時間假定為同期胚胎。注射hCG48小時后 每12小時通過采用"一步細(xì)胞計數(shù)試劑盒"，并在熒光顯微鏡下檢測每個胚胎的總細(xì)胞數(shù)， 將培養(yǎng)液中胚胎總細(xì)胞數(shù)與體內(nèi)同期胚胎所含的總細(xì)胞數(shù)進行比較。得出結(jié)論：受精卵在 KSOM培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，從60小時后，胚胎生長發(fā)育明顯遲緩，胚胎內(nèi)卵裂的形態(tài)可能不一致， 細(xì)胞總數(shù)較體內(nèi)發(fā)育的同期胚胎減少。而胚胎在sIVF培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)與體內(nèi)胚胎 接近。
[0038] 如圖2所示，為受精卵在KSOM培養(yǎng)液中培養(yǎng)后與體內(nèi)同期胚胎形態(tài)學(xué)特征， H〇echst33342 DNA染色顯示了胚胎的細(xì)胞核。KSOM培養(yǎng)的胚胎中的細(xì)胞可能具有相對不 一致的形態(tài)學(xué)特征，并出現(xiàn)碎裂核。提示了體外培養(yǎng)可能引起不正常的細(xì)胞分裂及細(xì)胞凋 亡。
[0039] 如圖3所示，為受精卵在KSOM或sIVF培養(yǎng)液中培養(yǎng)后與體內(nèi)同期胚胎比較其所 含的細(xì)胞數(shù)。KSOM培養(yǎng)的胚胎中的細(xì)胞數(shù)較少，而sIVF培養(yǎng)液培養(yǎng)的胚胎中的細(xì)胞數(shù)可能 與體內(nèi)同期胚胎相當(dāng)。提示了 sIVF培養(yǎng)液是較理想的培養(yǎng)液。而KSOM較差。
[0040] 結(jié)果可以看出，SlVF培養(yǎng)液產(chǎn)生的細(xì)胞數(shù)與體內(nèi)同期胚胎相當(dāng)，而KSOM的胚胎所 含的細(xì)胞數(shù)明顯降低（P〈〇. 001)。平均細(xì)胞數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差如表1。
[0041] 表1:

【權(quán)利要求】
1. 一種鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法，該方法包括MEA檢測方法，其特征在 于該方法在原有鼠胎試驗的基本標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上，增加了兩個檢測指標(biāo)及對該檢測指標(biāo) 的檢測方法，所述兩個指標(biāo)分別為胚胎的細(xì)胞總數(shù)和囊胚期胚胎中內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞和滋養(yǎng)層 細(xì)胞的總數(shù)；所述兩個對檢測指標(biāo)的檢測方法分別包括下述步驟： a) 胚胎的細(xì)胞總數(shù)的檢測方法：比較受精卵體外培養(yǎng)發(fā)育的胚胎與體內(nèi)發(fā)育的同期 胚胎內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)； b) 囊胚期胚胎中內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞的總數(shù)的檢測方法：比較體外培養(yǎng)生成 的囊胚和體內(nèi)發(fā)育的囊胚內(nèi)細(xì)胞團表達(dá)UTF1和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)CDX2的細(xì)胞數(shù)，及其兩者 分別占囊胚總細(xì)胞數(shù)的比率。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法，其特征在于， 所述方法a)中體外培養(yǎng)發(fā)育和體內(nèi)發(fā)育胚胎的細(xì)胞總數(shù)取得的方法是： 從小鼠超排合籠后48小時至96小時，每12小時檢測胚胎內(nèi)的小鼠胚胎細(xì)胞數(shù)一次， 共5次至；其中每12小時胚胎所含細(xì)胞總數(shù)[xl]: 上述小鼠胚胎細(xì)胞數(shù)是通過" 一步細(xì)胞計數(shù)試劑盒"將小鼠胚胎細(xì)胞固定和染色半小 時后制片，在40倍熒光顯微鏡下計數(shù)；其中所計數(shù)的小鼠胚胎細(xì)胞為具有正常細(xì)胞核形 態(tài)學(xué)的細(xì)胞，并不包括碎裂細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法，其特征在于， 所述一步細(xì)胞計數(shù)試劑盒包括： A. 固定染色液：包括磷酸鹽緩沖液PBS加多聚甲醛1-5克/100毫升，pH值為7. 4, 5-50 毫微克/毫升的雙苯甲亞胺； B. 制片液：磷酸鹽緩沖液PBS加抗褪色劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種改良的鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法，其特 征在于，所述方法b)中囊胚內(nèi)細(xì)胞團表達(dá)胚胎干細(xì)胞生物學(xué)標(biāo)記UTF1和滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá) CDX2的細(xì)胞數(shù)采用胚胎免疫熒光技術(shù)試劑盒檢測。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法，其特征在于， 所述胚胎免疫熒光技術(shù)試劑盒包括： a. 固定液：由磷酸鹽緩沖液PBS加1-5克/100毫升的多聚甲醛組成，pH值為7.0-7.8 ; b. 細(xì)胞膜打孔液：固定液加0. 1-0. 5微升/100毫升的聚山梨酯和0. 1-0. 5微升/100 毫升的聚乙二醇對-(1，1，3,3 -四甲基丁基）-苯基醚； c. 胚胎漂洗液：PBS加0. 01-0. 04微升/100毫升的聚山梨酯； d. 三種不同色譜的DNA染色液： 1) 磷酸鹽緩沖液PBS加5-50毫微克/毫升的Hoechst 33342 ; 2) 磷酸鹽緩沖液PBS加0. 01-1. 0毫微克/毫升的碘化丙啶； 3) 磷酸鹽緩沖液PBS加1-50毫微克/毫升的4'，6 -二脒-2 -苯基吲哚； e. 制片液：PBS加抗褪色劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的一種鼠胎試驗檢測輔助生殖技術(shù)質(zhì)量的方法，其特征在 于，所述采用胚胎免疫熒光技術(shù)試劑盒的檢測方法如下： 1)室溫下小鼠胚胎在胚胎漂洗液內(nèi)漂洗3次； 將上述小鼠胚胎移入固定液，在室溫下固定10-60分鐘，然后移至細(xì)胞膜打孔液10-60 分鐘，再以胚胎漂洗液漂洗胚胎10-20分鐘，重復(fù)多次； 3) 將上述處理后的胚胎在室溫下置于體積比為15-30%[x2] 1-3小時以封殺非特異性 的抗體結(jié)合位點； 4) 在4°C -20°C條件下將步驟3)處理后的胚胎與初級抗體結(jié)合8-16小時，再以胚胎 漂洗液漂洗胚胎10-20分鐘，重復(fù)多次；其中，所述的初級抗體為抗UTF1和CDX2的抗體； 5) 室溫下，在避光條件下將步驟4)處理后的胚胎與二級抗體結(jié)合1-2小時；再以胚胎 漂洗液漂洗胚胎10-20分鐘，重復(fù)多次； 6) 根據(jù)二級抗體所聯(lián)結(jié)熒光色譜，將步驟5)漂洗后的胚胎移至DNA染色液中，在室溫 避光條件下孵化10-50分鐘；所述DNA染色液的熒光色素必須與二級抗體所聯(lián)結(jié)熒光色素 不同，以區(qū)分DNA和被標(biāo)記的抗原UFTF1或⑶X2 ; 7) 將步驟6)孵化后的胚胎移至制片液，制片；置于室溫避光條件下10-30分鐘； 采用熒光顯微鏡技術(shù)檢查胚胎表達(dá)UTF1和CDX2的細(xì)胞總數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計算其占總 細(xì)胞數(shù)的比率。
【文檔編號】G01N33/569GK104372065SQ201410664162
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月20日
【發(fā)明者】金星亮, 鄭菊芬 申請人:南京優(yōu)而生物科技發(fā)展有限公司