一種牛肉中齊帕特羅、西布特羅、克侖普羅和班布特羅等促生長劑殘留量的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種牛肉中齊帕特羅、西布特羅、克侖普羅、班布特羅等促生長劑藥物 殘留量的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 齊帕特羅、西布特羅、克侖普羅、班布特羅等藥物對(duì)動(dòng)物具有明顯地促生長、增加 瘦肉率、改善生產(chǎn)性能等作用。但是殘留有這些藥物的的牛肉如果被人食用后，會(huì)出現(xiàn)心 悸、四肢肌肉顫動(dòng)、心律失常等副作用，嚴(yán)重影響人類的健康。目前還沒有相關(guān)的牛肉中殘 留以上四種藥物的測定方法。為了保證廣大居民食品安全，杜絕和監(jiān)控以上四種藥物在牛 肉中的殘留，防止在突發(fā)事件中的被動(dòng)，需要對(duì)牛肉組織中上述四種促生長劑藥物含量進(jìn) 行檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的缺陷，提供了一種牛肉中齊帕特羅、西布 特羅、克侖普羅、班布特羅等促生長劑藥物殘留量的測定方法。
[0004] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案： 一種牛肉中促生長劑殘留量的測定方法，所述促生長劑為齊帕特羅、西布特羅、克侖普 羅和班布特羅，包括如下步驟： (1) 樣品的提?。喝∫欢康呐Ｈ鈽悠?，絞碎，加入β -葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶， 在ρΗ=5. 2下，水解16h，然后用高氯酸調(diào)節(jié)pH至1.0±0. 2,離心； (2) 樣品的凈化：將離心得到的上清液pH調(diào)節(jié)至9. 5±0. 2,依次用乙酸乙酯、叔丁基甲 醚萃取，合并有機(jī)相，氮?dú)獯蹈桑儆?%vol甲酸水溶液溶解，得到的溶液過陽離子交換固 相萃取柱，依次用2%vol甲酸水溶液、水、甲醇淋洗，抽干，再用氨化甲醇洗脫，收集洗脫液， 氮?dú)獯蹈?，用甲酸甲醇水溶液溶解，膜過濾，得濾液； (3) 步驟（2)所得的濾液上液質(zhì)聯(lián)用儀，得到所述促生長劑的色譜峰面積，液相色譜條 件：C18柱，用0. l%vol甲酸水溶液-甲醇體系進(jìn)行梯度洗脫； (4) 將所述促生長劑標(biāo)準(zhǔn)品添加到空白樣品中，制備成一系列濃度的空白添加試樣，按 步驟（1)- (3)處理，得到濃度-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (5) 根據(jù)步驟（3)和步驟（4)的結(jié)果即可得出牛肉中所述促生長劑的殘留量。
[0005] 進(jìn)一步，步驟（2)所述的甲酸甲醇水溶液為v:v=20:80的0. l%vol甲酸甲醇溶 液-0. l%vol甲酸水溶液。
[0006] 進(jìn)一步，步驟（3)梯度洗脫時(shí)，甲醇體積百分比隨時(shí)間變化如下：0~4min 20% ; 4 ~5min 60% ;5 ~6min 80%。
【附圖說明】
[0007] 圖1為促生長劑的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜圖，從上至下依次為西布特羅、齊帕特羅、 克倫普羅和班布特，各種促生長劑的濃度都為〇. 5 μ g/mL。
【具體實(shí)施方式】
[0008] 以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0009] 1.試劑和儀器 促生長劑：齊帕特羅、西布特羅、克倫普羅、班布特羅標(biāo)準(zhǔn)品，純度均大于98. 0%。甲酸 (HCOOH):分析純。乙酸乙酯（C4H802):分析純。甲醇（CH3OH):色譜純。高氯酸（HClO 4):優(yōu) 級(jí)純。氫氧化鈉（NaOH):優(yōu)級(jí)純。氨水（NH4OH):優(yōu)級(jí)純。乙酸銨（CH 3COONH4)13 0.1 mol/ L高氯酸溶液。5 mol/L氫氧化鈉溶液。5%vol氨水甲醇溶液(氨化甲醇)。0. l%vol甲酸 水溶液。β -葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶（β -glucuronidasc/arylsulfatasc):酶活性 ^ 100, 000units/min。
[0010] 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取上述4種促生長劑標(biāo)準(zhǔn)品10. 0 mg，置于10 mL容量瓶中， 用甲醇溶解并定容，于4°C條件下保存。
[0011] 標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取上述各儲(chǔ)備溶液，用甲醇稀釋，配成濃度為1.0 μ g/mL的 混和標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。根據(jù)需要，用甲醇稀釋上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作 液。
[0012] MCX陽離子交換固相萃取小柱（60mg，3mL)或其他等效柱。微孔濾膜：0· 22 μπι。 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(簡稱液質(zhì)聯(lián)用儀)。電子分析天平：感量0.1 mg。冷凍高速離心機(jī)。 氮吹儀。固相萃取裝置。超聲清洗儀。渦旋混合器。恒溫振蕩水浴。
[0013] 2.促生長劑殘留量的測定 2.1牛肉樣品的處理 準(zhǔn)確稱取絞碎混合均勻的牛肉組織樣品5. 0 g (精確到0. lg)，置于50 mL離心管中， 加入0. 2mol/L乙酸銨緩沖溶液（pH=5. 2) 10 mL，加入20 μ L的β -葡萄糖苷酸酶/芳基 硫酸酯酶，37°C水解16h，加0. lmol/L的高氯酸5ml，再用高氯酸調(diào)pH值到I. 0±0. 2,于 lOOOOr/min轉(zhuǎn)速離心10min后，將上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中。用lOmol/L氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)pH值到9. 5±0. 2,加入乙酸乙酯15 mL，禍旋混合，并震蕩10min，于5000r/min轉(zhuǎn)速離 心IOmin后，用滴管吸出上層乙酸乙酯到另一 50 mL離心管中。向下層水相中加入叔丁基 甲醚10ml，禍旋混合，并震蕩10min，于5000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，合并乙酸乙酯相和叔丁 基甲醚相，50°C下氮?dú)獯蹈?，? mL 2% (v:v)甲酸水溶液溶解，備用。
[0014] MCX陽離子交換固相萃取小柱在使用前依次用甲醇、水、2% (v:v)甲酸水溶液各 3mL淋洗，再取上述甲酸溶液過固相萃取柱，依次用2% (v:v)甲酸水溶液、水、甲醇各3mL 淋洗，抽干。再用5% (v:v)氨化甲醇5mL洗脫，洗脫液在50°C下氮?dú)獯蹈?，?. 4mL 0. 1% (V: V)甲酸甲醇溶液-0. 1% (V: V)甲酸水溶液（V: v=20:80)溶解。搖勾之后，過0. 22Mm微 孔濾膜，濾液上液質(zhì)聯(lián)用儀測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出4種促生長劑的含量。
[0015] 2. 2 4種促生長劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別準(zhǔn)確量取上述4種促生長劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加到5g空白樣品中，制得濃度為 0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6和3. 2yg/kg的一系列空白添加試樣，所得空白添加試樣按照上述 2. 1所述步驟處理，上液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0016] 3.液質(zhì)聯(lián)用儀測試條件 3. 1色譜條件 色譜柱：Z0RBAX Eclipse Plus C18 柱（100 mmX3. 0 mm, I. 8 μm)或相當(dāng)?shù)纳V柱。
[0017] 柱溫：30°C。
[0018] 進(jìn)樣量：10 μ L。
[0019] 流動(dòng)相：Α相：甲醇；B相：濃度為0· 1% (體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液。
[0020] 梯度洗脫情況見表1。
[0021] 表1梯度洗脫程序
3. 2質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源； 掃面方式：正離子掃描； 檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測； 電離電壓：3. 2kv ; 源溫：l〇〇°C ; 霧化溫度：350 ; 錐孔氣流：50L/h ; 霧化氣流速：650 L/h ; 脫溶劑氣、錐孔氣、碰撞氣均為高純氮?dú)饧捌渌线m氣體，使用前應(yīng)調(diào)節(jié)氣體流量使得 質(zhì)譜儀靈敏度達(dá)到檢測要求。毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等電壓值應(yīng)優(yōu)化到最佳靈敏 度。定性定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量見表2. 表2定性定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量
在上述儀器條件下測定基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品溶液。各檢測目標(biāo)化合物以保留時(shí)間 和特征離子與定量離子所對(duì)應(yīng)的LC-MS/MS色譜峰面積相對(duì)豐度進(jìn)行定性。要求被測試樣 中目標(biāo)化合物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)化合物保留時(shí)間的相對(duì)偏差在±2. 5之間；樣 品特征離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過表 3的規(guī)定，則可判斷樣品中存在相應(yīng)的被測物。色譜圖見圖1。
[0022] 表3定性測定時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差
各促生長劑在添加濃度為〇. 1-1.0 μ g/kg時(shí)，本發(fā)明方法的加標(biāo)回收率均介于 70. 1-100. 5% 之間。
[0023] 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的 10% 〇
[0024] 最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種牛肉中齊帕特羅、西布特羅、克侖普羅和班布特羅等促生長劑殘留量的測定方 法，包括如下步驟： (1) 樣品的提取：取一定量的牛肉樣品，絞碎，加入0 -葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶， 在pH=5. 2下，水解16h，然后用高氯酸調(diào)節(jié)pH至1.0±0. 2,離心； (2) 樣品的凈化：離心得到的上清液pH調(diào)節(jié)至9. 5±0. 2,依次用乙酸乙酯、叔丁基甲醚 萃取，合并有機(jī)相，氮?dú)獯蹈?，再?%vol甲酸水溶液溶解，得到的溶液過陽離子交換固相 萃取柱，依次用2%vol甲酸水溶液、水、甲醇淋洗，抽干，再用氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，氮 氣吹干，用甲酸甲醇水溶液溶解，膜過濾，得濾液； (3) 步驟（2)所得的濾液上液質(zhì)聯(lián)用儀，得到所述促生長劑的色譜峰面積，液相色譜條 件：C18柱，用0. l%vol甲酸水溶液-甲醇體系進(jìn)行梯度洗脫； (4) 將所述促生長劑標(biāo)準(zhǔn)品添加到空白樣品中，制備成一系列濃度的空白添加試樣，按 步驟（1)- (3)處理，得到濃度-峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (5) 根據(jù)步驟（3)和步驟（4)的結(jié)果即可得出牛肉中所述促生長劑的殘留量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟（2)所述的甲酸甲醇水溶液為 v:v=20:80的0. l%vol甲酸甲醇溶液-0. l%vol甲酸水溶液。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定方法，其特征在于，步驟（3)梯度洗脫時(shí)，甲醇體積百分 比隨時(shí)間變化如下：〇~4min 20% ;4~5min 60% ;5~6min 80%。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種牛肉中齊帕特羅、西布特羅、克侖普羅和班布特羅等促生長劑殘留量的測定方法，該方法包括牛肉樣品用β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶水解，在pH為1.0±0.2下離心，上清液pH調(diào)至9.5±0.2，依次用乙酸乙酯、叔丁基甲醚萃取，合并有機(jī)相，吹干，再用甲酸溶解，過陽離子交換固相萃取柱，依次用2%甲酸、水、甲醇淋洗，再用氨化甲醇洗脫，洗脫液吹干，用甲酸甲醇水溶液溶解，膜過濾，濾液上液質(zhì)聯(lián)用儀，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出牛肉中所述促生長劑的殘留量。本發(fā)明方法可對(duì)齊帕特羅、西布特羅、克侖普羅和班布特羅4種促生長劑實(shí)現(xiàn)快速檢測，監(jiān)控以上四種藥物在牛肉中的殘留。
【IPC分類】G01N30/88, G01N1/34
【公開號(hào)】CN105092762
【申請?zhí)枴緾N201510530443
【發(fā)明人】熊琳, 李維紅, 李潤林, 楊曉林, 高雅琴
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月26日