專利名稱：一種大麥黃矮病毒RNAi植物表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大麥黃矮病毒RNAi植物表達(dá)載體及其應(yīng) 用，特別涉及來源于大麥黃矮病毒GAV株系復(fù)制酶基因序列的雙鏈RNAi雙T-DNA植物表達(dá)載 體及其在抗禾谷類黃矮病基因工程中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禾谷類黃矮病毒病是由大麥黃矮病毒O^Wey ye7"^ ofer/ w'r"s, BYDVs)引起、斷蟲 介導(dǎo)，在小麥、大麥、燕麥和黑麥等多種作物上廣為傳播的一種毀滅性病毒病害[MillerWA, Rasochova L. 5ar7e/ye72cw oVarf Firw5e5". Annu Rev Phytopathol， 1997， 35:167~190]。 禾谷類黃矮病毒病的發(fā)病面積和危害程度呈逐年擴(kuò)大和加重趨勢，BYDV-GAV是當(dāng)前我國流行 的病毒株系[Liu Y, Sun B, Wang XF, Zheng CL and Zhou GH. 7T ree o^curige"/"-Js6eJec/ cZ 似/y。Aes /hr 5^eci/!z'c ofetectJ'o" <xf t力e朋turaJ "op〃Ja fi朋。/* Aar/e/ "W置cfer/ w>,s j'" 6M朋d。f-Wot力/Z)"Wza"o". Virol Methods, 2007, 145(1): 22 29]。 栽培品種中的抗黃矮病基因極少，迄今沒有發(fā)現(xiàn)來自普通小麥的抗病基因，即使在大麥中唯 一鑒定命名的抗、耐大麥黃矮病基因)W么其抗性水平還受遺傳背景和栽培條件影響[Burnett PA， Comeau A and Qualset CO. /fost to7era/ ce or re67'5t朋ce /or co/^_roZ of力ar/ey
"/7w 6ferZ! In: Barley Yellow Dwarf: 40 Years of Progress (D' Arcy CJ and Burnett PAeds)， 1995. 32廣343;錢幼亭，周廣和，周希明.從麥類種質(zhì)資源中篩選大麥黃矮病毒 抗原.植物保護(hù)學(xué)報，1993， 20(1): 71~75]，抗病資源短缺是抗黃矮病育種取得突破性進(jìn)展 的限制性瓶頸因子。
近年來，植物抗病毒基因工程研究進(jìn)展較快[Dupr印，Henry M， Posadas G ， et al. ( e"e"caJ7y ^ i'/ ee/"i"(g" w力eat /or Mr7e/ /e7i置oVar/ res7'st朋ce. ^fia 7e/
JWioir Zter/" Z^ease.'yPeceT^ JoVa/7ce51 ,i/ti/i-e 5"tra tegies. Henry M&Mc Nab A eds. CIMMYT, Texceco， Mexico, 2002. 27~28;張增艷，辛志勇.抗黃矮病小麥生物技術(shù)育 種研究進(jìn)展.作物雜志，2005， 5: 19 22],然而，轉(zhuǎn)化病毒復(fù)制酶基因、外殼蛋白(CP)和運(yùn) 動蛋白基因正義鏈或負(fù)義鏈獲得的轉(zhuǎn)基因植株抗性水平不高，通常表現(xiàn)為延遲發(fā)病時間或減 輕癥狀[McGrath PF, Vincent JR, Lei CH, Pawlowski WP， Torbert KA， Gu W， Ka印pler HF, Wan Y, Lemaux PG, Rines HR， Somers DA, Larkins BA and Lister RM. Coat protein-mediated resistance to isolates of barley ye〗low dwarf in oats and barley. Eur J Plant Pathol. 1997, 103:695 - 710;成卓敏，吳茂森，夏光敏等.應(yīng)用基因槍法獲得抗大麥黃矮病毒轉(zhuǎn)基 因小麥.植物病理學(xué)報，2000， 30(2): 16—121]。 RNA干擾(RNA interference, RNAi)是真 核生物中普遍存在的由雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的同源mRNA降解現(xiàn)象[Zamore PD, Tuschl T, Sharp P and Bartel DP. y A^'.. ob"Z Je "ra/70tec/ y 廁c/ii-e"51 t力e ofe/ e/ cfe"t c7eara《e 。/M"似at^-i^/wWeofjWeiy^arrah. Cell, 2000, 101:25~33]。在細(xì)胞中，長的dsRNA 被類似RNase的Dicer酶切割成21 26bp的小干擾RNA(siRNA) 。 siRNA與蛋白復(fù)合物結(jié)合后形成 RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC，同時解鏈。有活性的RISC與同單鏈siRNA互補(bǔ)的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合后導(dǎo)致 特定mRNA的降解。RNAi是植物在長期進(jìn)化過程中形成的一種抗病毒機(jī)制，病毒在植物細(xì)胞內(nèi) 繁殖產(chǎn)生的雙鏈RNA誘導(dǎo)了植物固有的RNAi機(jī)制，然而在相對中性的自然界，天然的RNAi系統(tǒng)不能起到完全或較高水平地抵御某種病毒侵染的作用[Voinnet 0. Review, yP朋w7朋"y^ as a p7朋t /順""e 57st柳a卵jV7st "/YAse51. Trends Gen, 2001， 17(8): 449~459]。轉(zhuǎn)基因 大麥和煙草的研究表明，根據(jù)病毒的某一序列構(gòu)建可在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生雙鏈RNA (如發(fā)卡 RNA)的載體，強(qiáng)化植物體內(nèi)天然的RNAi抗病毒機(jī)制，能夠獲得免疫水平的高抗轉(zhuǎn)基因植物 [Waterhouse PM, Graham MW and Wang MB. Kz'r"s 7"a i"a"ce a"G^e/ e sj7e"d'"《i/ ; 2朋ts c朋力e /^"ceW sj'/7"7Z"朋eows e^oresw'o/ o/" se"se a/ c/朋"'se"se / 服Proc Natl Acad Sci， 1998, 95:13959 13964; Missiou A, Kal肌tidis K， Bouflal A， Tzortzakaki S， Martin Tabler M, Tsagris M. ( e"era"'o/7 of tra/75^e/ iCjDoL3t"op7a/ ts1/ 化/ 7/i-esj'st3"f to尸"ato K/r"s ^ro塔力/ 朋w7e"ci/^. Mol Breed, 2004， 14:185 197]。作為一種新的分
子育種技術(shù)，RNAi已成功用于植物抗病性、籽粒品質(zhì)性狀的改良實踐。
轉(zhuǎn)基因技術(shù)是作物性狀改良的一種有效育種途徑，由于轉(zhuǎn)基因(尤其是除草劑和抗生素類 選擇標(biāo)記基因)潛在的安全性風(fēng)險，轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境和食用安全性問題越來越受到人們的 關(guān)注[Richard BF， Ed D, Roy LF, Robert TF. 5"e7e"a力Je鵬rAer ge"esv safe /br/ 7a/ ts1. Biotechnology, 1992, 10: 1441 1444]。剔除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標(biāo)記基因是解決這一問 題的有力手段。目前，獲得無選擇標(biāo)記的方法有多種，其中的有效方法之一是構(gòu)建含雙T一DNA 區(qū)的植物表達(dá)載體[Komari T, Hiei Y， Saito Y, Murai N and Kumashiro T. Vectors carrying two separate T-DNAs for Co-transformation of higher plants mediated by 4^ratectejrj'哪 Z""y/7e/acie"s and segregation of transformants free from selection markers. Plant J， 1996, 10: 165 - 174]，將目標(biāo)基因與選擇標(biāo)記基因分開在不同的T一DNA區(qū)，通過轉(zhuǎn)基因植 株后代基因的分離使標(biāo)記基因與目標(biāo)基因分離，從而獲得僅含目標(biāo)基因的安全轉(zhuǎn)基因后代植 株[Matthews PR, Wang MB, Waterhouse PM， Thornton S， Fieg SJ, Gubler F and Jacobsen JV. Marker gene elimination from transgenic barley, using co-transfor腿tion with adjacent 'twin T-DNAs' on a standard 4^ro力aci:arz'i/ffltransformation vector. Molecular Breeding, 2001， 7: 195-202]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種含雙邊界序列的BYDV-GAV株系復(fù)制酶基因雙鏈RNAi植物表達(dá) 載體及其應(yīng)用。
本發(fā)明提供的RNAi植物表達(dá)載體含有來源于BYDV-GAV復(fù)制酶基因0RF1堿基序列的發(fā)卡 RNA(hpRNA)表達(dá)盒或/和選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒。hpRNA表達(dá)盒和選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒分別位于 同一載體的2個獨(dú)立的T-DNA區(qū)。hpRNA表達(dá)盒含有Ubi啟動子驅(qū)動的復(fù)制酶基因反向重復(fù) 序列片段，是來自序列表1的5'端第32位核苷酸序列按照序列表1的核苷酸排列方式向3' 端延長，長度分別為824bp (GAVpol+，序列表1劃線部分)和607bp (GAVpol-，序列表1陰 影部分)的脫氧核苷酸片段，在植物細(xì)胞內(nèi)能轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA。選擇標(biāo)記基因 表達(dá)盒含有CaMV35S啟動子、潮霉素基因hpt和Nos終止子。
上述hpRNA表達(dá)盒以及含有它的重組表達(dá)載體，包括構(gòu)建的中間載體和具雙邊界序列的 RNAi表達(dá)載體，工程菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的RNAi植物表達(dá)載體通過使用Ti質(zhì)粒、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等 常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)能轉(zhuǎn)錄形成hpRNA雙鏈RNA分子，誘導(dǎo) 產(chǎn)生RNAi,導(dǎo)致浸染到植物細(xì)胞里的病毒同源mRNA分子特異性降解，病毒不能繁殖和再浸 染，轉(zhuǎn)基因植株獲得病毒抗性。被轉(zhuǎn)化的植物宿主可以是小麥、大麥、燕麥和黑麥等禾本科 植物。上述含雙邊界的RNAi植物表達(dá)載體可借助根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，從轉(zhuǎn)基因植株
4的分離后代中剔除選擇標(biāo)記基因，在培育無選擇標(biāo)記基因的抗黃矮病轉(zhuǎn)基因安全作物方面具 有很好的應(yīng)用前景。


圖1為pMBW246-GAVpol+的EcoRI/BamHI酶切結(jié)果，其中1、 2、 3、 4為四個陽性克??； M為lkb的marker;
圖2為pMBW246-hP-GAVpol的EcoRI/BaraHI/Xbal酶切結(jié)果，其中1為陽性克隆；M為lkb 的marker;
圖3為pWBVec8-2b-hpGAVpol的BamHI/EcoRI酶切結(jié)果，其中7、 11、 16為陽性克隆； M為llkb的marker;
圖4為pWBVec8-2b-hpGAVpol的質(zhì)粒圖譜。
具體實施例方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。 實施例1菌株、質(zhì)粒的獲得及PCR引物的合成
1. 菌株和質(zhì)粒
質(zhì)粒pTGAVpl-O提供載體構(gòu)建所需的BYDV—GAV株系復(fù)制酶基因0RF1序列(見序列表1 )。 基礎(chǔ)質(zhì)粒pMBW246提供構(gòu)建編碼發(fā)卡RNA表達(dá)盒所需的Ubiqutin啟動子和Tmr終止子；中 間載體pWBVec8-2B含有2個相鄰的T-DNA區(qū)，其中一個T-DNA區(qū)攜有選擇標(biāo)記基因Apt表達(dá) 盒。大腸桿菌菌株為machl-Tl，根癌土壤桿菌菌株為AGL1。
2. PCR引物序列
根據(jù)大麥黃矮病毒GAV株系聚合酶基因序列(序列表l)設(shè)計GAVpol+和GAVpo1-片段的上 下游引物，在GAVpol+序列的5'和3'端分別設(shè)有KpnI和FxoRI兩個酶切位點(diǎn)，在GAVpol-序列 的5'端設(shè)有EcoRI—個酶切位點(diǎn)。
GAVpol+上游引物 5' CGG GGTACCAAGGCGGTCAAAGATTTCA3，(含KpnI酶切位點(diǎn))
下游引物 5' CGGGAATTCGTCGACGTCCCCTACATTTTCAACGTA3，(含EcoRI酶切位點(diǎn))
GAVpol-上游引物 5， CGGGAATTCCAAGGCGGTCAAAGATTTCA3，(含EcoRI酶切位點(diǎn)) 下游引物 5， CTTGGACGTCTCCACCTTCTTGACCT3，
實施例2具雙T-DNA區(qū)的雙鏈RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建
1. PCR擴(kuò)增目的片段
提取質(zhì)粒pTGAVp1-0DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得含相應(yīng)酶切位點(diǎn)的片段GAVpol+ (824bp) 和GAVpol- (607bp)。
2. pMBW246-GAVpol+中間載體的構(gòu)建
擴(kuò)增產(chǎn)物GAVpol+經(jīng)Kpnl和EcoRI完全雙酶切，1%瓊脂糖電泳分離回收酶切片段，與 經(jīng)同樣酶切得到的中間載體pMBW246回收大片段，在T4DNA連接酶的作用下16。C連接過夜， 連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌machl-Tl感受態(tài)細(xì)胞，挑選部分克隆子提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒 定。重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/BamHI雙酶切產(chǎn)生900bp和5. 4kb的兩個片段，與目的質(zhì)粒的酶切圖 譜吻合，將其命名pMBW246-GAVpol+ (圖l)。3. 發(fā)卡RNA中間表達(dá)載體pMBW246-hp-GAVpol的構(gòu)建
EcoRI單酶切PCR擴(kuò)增得到的GAVpol-片段，將607bp的GAVpol-片段反向插入到經(jīng)同樣 酶切的中間載體pMBW246-GAVpol+中，挑選部分克隆子進(jìn)行酶切鑒定，重組質(zhì)粒經(jīng) EcoRI/BamHI/Xbal完全酶切產(chǎn)生3kb、 2kb、 800bp、 337bp、 240bp、 200bp的片段，與目的 質(zhì)粒酶切圖譜吻合，該重組質(zhì)粒(命名為pMBW246-hp-GAVpo1，圖2)含有由Ubiqutin啟動 子、Tml'終止子以及GAVpol+ (824bp)和GAVpol- (607bp)反向重復(fù)序列構(gòu)成的發(fā)卡RNA 表達(dá)盒，在細(xì)胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄形成loop長度為0.23kb、雙鏈莖(stem)長度為1. 2kb的發(fā)卡 RNA結(jié)構(gòu)。
4. 具雙T-DNA區(qū)的GAV復(fù)制酶基因RNAi植物表達(dá)載體構(gòu)建
Notl/Hindl11酶切pMBW246-hp-GAVpo1中間表達(dá)載體，電泳分離回收帶有Ubi啟動子、 發(fā)卡RNA編碼序列和Tml'終止子的表達(dá)盒，將其連接到載體質(zhì)粒pWBVec8-2B其中一個T-DNA 區(qū)的Notl/HindHI克隆位點(diǎn)，挑選部分重組子進(jìn)行酶切鑒定，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/BamHI酶切 產(chǎn)生1. 4kb、 2. lkb、 3. 5kb、 9kb四條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，將其命名為pWBVec8-2b-hpGAVpo1 (圖3)。該載體具有兩個T-DNA區(qū)(圖4),其中一個攜帶選擇標(biāo)記基因hpt表達(dá)盒，另一個 攜帶GAV復(fù)制酶基因hpRNA表達(dá)盒，hpRNA的反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過分子內(nèi)序列互 補(bǔ)形成發(fā)卡狀(莖環(huán)結(jié)構(gòu))雙鏈RNA，從而誘導(dǎo)植物RNAi。
序列表l: BYDV—GAV株系復(fù)制酶基因部分序列
TAT,YrATTA'n'(:Trr(:A,v'、(x,YrGGn'(;ATG(;.vv' TAT(:T(;(;(;(:v'訂TTAA(;na:(:AT(;A「(;nTn'(,T「v、('AT(;T(;n、
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AGTCCTGAAGCACGTGCCAGGCGGGAACGCATGGACGTGCTTGACTCTGTGGGTTTTTAGGTCGSEQUENCE LISTING 〈110〉中國科學(xué)院成都生物研究所
〈120〉 一種大麥黃矮病毒RNAi植物表達(dá)載體及其應(yīng)用
〈130〉 說明書
<160〉 5
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
<211> 1025
〈212〉 腿
〈213> Barley yellow dwarf virus
〈400〉 1
atgttcttcgaaatact cat鄉(xiāng)agctagtgc認(rèn)ggcggtcaaagstttcatcagccac60
tgctactctagwt^^tctatstattattctttcaaacgatggctgatggaaatatct120
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g犯gacttcgaggctgaactcgctga聊gttcgctgagaggg3ggatgaggtgga卿g240
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<210> 2
7〈211> 〈212〉 〈213>
28 腿
Barley yellow dwarf virus
<400> 2
cggggt3cc3 3ggcggtcaa agatttca
〈210〉 3 <211> 36 <212> DNA
<213> Barley yellow dwarf virus 〈400〉 3
cgggaattcg tcgacgtccc ctacattttc aacgta 36
<210> 4
〈211〉 29
<212> DNA
〈213> Barley yellow dwarf virus
〈210〉 5 〈211〉 26 〈212〉 DNA
〈213> Barley yellow dwarf virus 〈400〉 5
cttggacgtc tccaccttct tgacct 26
<400> 4
cgggaattcc aaggcggtca aagatttca
權(quán)利要求
1、一種大麥黃矮病毒基因發(fā)卡RNA表達(dá)盒，其特征在于含有來自序列表1的5′端第32位核苷酸序列按照序列表1的核苷酸排列方式向3′端延長、長度分別為824bp和607bp的反向重復(fù)脫氧核苷酸片段。
2、 一種大麥黃矮病毒RNAi植物表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求l 所述的大麥黃矮病毒基因發(fā)卡RNA表達(dá)盒。
3、 一種大麥黃矮病毒RNAi植物表達(dá)載體，其特征在于含有雙T-DNA 區(qū)，其中一個T-DNA區(qū)含有權(quán)利要求1所述的大麥黃矮病毒基因發(fā)卡RNA表 達(dá)盒；另一個T-DNA區(qū)含有選擇標(biāo)記基因表達(dá)盒。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種大麥黃矮病毒RNAi植物表達(dá)載體，其特 征在于所述的選擇標(biāo)記基因為知L
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的大麥黃矮病毒RNAi植物表達(dá)載 體，其特征在于所述載體能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA 分子，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生RNAi。
6、 含有權(quán)利要求1所述大麥黃矮病毒基因發(fā)卡RNA表達(dá)盒的重組表達(dá)載 體、工程菌或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7、 權(quán)利要求1所述的大麥黃矮病毒基因發(fā)卡RNA表達(dá)盒在培育抗禾谷類 黃矮病植物中的應(yīng)用。
8、 權(quán)利要求2或3或4或5所述的大麥黃矮病毒RNAi植物表達(dá)載體在 培育抗禾谷類黃矮病植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種大麥黃矮病毒基因發(fā)卡RNA表達(dá)盒、RNAi植物表達(dá)載體及其應(yīng)用。本發(fā)明大麥黃矮病毒基因發(fā)卡RNA表達(dá)盒、RNAi植物表達(dá)載體含有來自序列表1的5′端第32位核苷酸序列按照序列1的核苷酸排列方式向3′端延長，長度分別為824bp和607bp的反向重復(fù)脫氧核苷酸片段，能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成發(fā)卡RNA結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA分子，從而誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生RNAi，寄主獲得高抗病毒的能力。本發(fā)明的載體在培育抗禾谷類黃矮病植物或抗禾谷類黃矮病的無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因安全植物方面具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號A01H1/00GK101684464SQ200810046119
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月22日
發(fā)明者孫文瑜, 磊 王, 靜 陳 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所