本發(fā)明涉及一種胡桃醌的提取方法，更特別地說，涉及一種天然活性成分胡桃醌的超臨界萃取方法。

背景技術(shù)：

核桃(Juglans regia L.)屬于胡桃科(Juglandaceae)胡桃屬(Juglans L.)，是核桃屬植物中經(jīng)濟價值最高的一種。核桃在我國資源豐富，具有顯著的經(jīng)濟效益和藥用價值。每年8、9 月份在核桃收獲季便產(chǎn)生大量的核桃外果皮，即核桃青皮，由于核桃青皮堿性較強，既不能用作飼料，也不能直接做肥料，農(nóng)民及一些商販們往往將其隨意堆置在田間、地頭、路邊或溝邊；一旦下雨或青皮浸水，就會產(chǎn)生大量堿性的褐色廢水，污染核桃青皮周邊的土壤及水域，造成環(huán)境污染。據(jù)相關(guān)資料記載，核桃葉、枝、青皮、樹皮都有藥用價值，具有殺菌、消毒、利尿、滋補、解毒等功效。隨著化學(xué)殺蟲劑的長期大量應(yīng)用,導(dǎo)致有害生物產(chǎn)生抗藥性、殺傷天敵及引起害蟲再猖獗等副作用已越來越明顯?，F(xiàn)在要消除相同數(shù)量的害蟲所需要的農(nóng)藥劑量較之前不斷增加，農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留一直是擺在人們面前的一個重大的食品安全問題。植物源殺蟲劑是一類利用植物中含有殺蟲活性物的某些部分或提取有效成分制成的殺蟲劑, 具有區(qū)別于有機農(nóng)藥的拒食、抑制生長發(fā)育、忌避、忌產(chǎn)卵、麻醉、抑制種群形成等特異的作用機制，且具有高效、低毒或無毒、無污染、選擇性高、不使害蟲產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點。人類利用植物來源的成分進行殺蟲防病的歷史悠久，隨著人們越來越重視與環(huán)境有較高和諧度的新型殺蟲劑的研究，近年來對植物源農(nóng)藥的開發(fā)逐漸從經(jīng)驗階段上升到科學(xué)試驗階段。因此開發(fā)包括植物源農(nóng)藥在內(nèi)的環(huán)境友好型農(nóng)藥顯得尤為重要，但關(guān)于核桃青皮在農(nóng)業(yè)病蟲害防治方面的報道卻較少，尋求簡單易行、成本低廉和符合綠色環(huán)保要求的植物源殺蟲劑，已成為國內(nèi)外研究的一個熱點。

核桃青皮中含有豐富的活性物質(zhì)如胡桃醌、α-氫化胡桃醌、4-葡萄糖苷、鞣質(zhì)、沒食子酸、胡桃醌生物堿和萘醌等，未成熟時含有豐富的維生素C和60%以上的水分。關(guān)于核桃青皮、核桃葉等的提取物在抗蟲、抑菌方面的活性作用研究已有較多的報道。核桃青皮壓成漿液，噴撒可防治蚜蟲、紅蜘蛛。核桃青皮的石油醚、乙醇提取物對板栗朱砂葉螨有很好的觸殺作用。胡桃醌不溶于冷水，微溶于熱水，可溶于乙醇、乙醚，并能與氯仿、苯混溶。當(dāng)其溶于堿溶液時呈紫紅色，溶于濃硫酸時呈血紅色。將核桃加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物核桃青皮開發(fā)成綠色殺蟲劑，具有開發(fā)投入少、技術(shù)含量高、產(chǎn)品附加值大、市場廣闊等優(yōu)勢和特點。因此，研究高效、節(jié)能、環(huán)保的提取胡桃青皮的殺蟲劑有效成分制備綠色殺蟲劑具有較大的實用意義，必將為社會作出巨大的貢獻。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本本發(fā)明將核桃加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物核桃青皮開發(fā)成綠色殺蟲劑，技術(shù)工藝合理，有效的保存了核桃青皮的活性物質(zhì)，具有開發(fā)投入少、技術(shù)含量高、產(chǎn)品附加值大、市場廣闊等優(yōu)勢和特點。該方法不但快捷、生產(chǎn)率高，而且殺蟲無毒、無味、不燃、不腐蝕、價格便宜且易于回收，滿足了環(huán)保和工業(yè)化的要求。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的。一種由核桃青皮制備綠色殺蟲劑的方法：

a. 制備核桃青皮干粉：使用脫皮機將新鮮核桃脫皮得到核桃青皮，烘干核桃青皮得到核桃青皮干粉；

b. 提?。喝?00質(zhì)量份的核桃青皮干粉打碎，室溫下用500-700質(zhì)量份的95% 乙醇浸泡3次得到核桃青皮提取液，將三次的提取液合并后濃縮得乙醇粗提物，將乙醇粗提物烘干打粉，過60-100目篩得粗提物干粉備用；

c. 純化：將粗提物干粉再用乙醇進行溶解，取15-20質(zhì)量份粗提物經(jīng)大孔樹脂進行純化，用洗脫劑洗脫，收集極性低的物質(zhì)部位得到得乙醇純化提取液，將乙醇純化提取液濃縮、烘干、打粉，過60～100目篩得提取物干粉備用；

d. 制劑：取100質(zhì)量份的提取物干粉，用5-10質(zhì)量份的3%~5%乙醇溶解，然后分別加入0.8-1質(zhì)量份乳化劑和滲透劑，最后用純凈水定容，配成水油相一體的10倍量的核桃青皮提取物原藥液。

優(yōu)化的，步驟b采用小于55℃的低溫，持續(xù)48個小時以上間接熱源加熱進行烘干。

優(yōu)化的，步驟b中的核桃青皮在提取前粉碎至20～60目。

優(yōu)化的，步驟b中提取用的95%乙醇試劑可以由60%-純甲醇、石油醚、二氯甲烷、氯仿替代分別制成不同比例的乙醇提取物、石油醚提取物、二氯甲烷提取物以及氯仿提取物。

優(yōu)化的，步驟c中純化所用大孔樹脂可用ODS、MCI、DM101、AB-8不同型號純化。

優(yōu)化的，步驟c中純化所用洗脫劑可為甲醇、乙醇或水。

優(yōu)化的，步驟c中收集部位可為低極性、中極性或中低極性。一種如權(quán)利要求1所述的由核桃青皮制備綠色殺蟲劑的方法，其特征在于：所述步驟d中所用的乳化劑可以為硬脂酰乳酸鈉、硬脂酰乳酸鈣、雙乙酰酒石酸單甘油酯、蔗糖脂肪酯、蒸餾單甘酯。

核桃青皮提取物作殺蟲劑在防治韭蛆幼蟲病害中的應(yīng)用方法如下：將制成的核桃青皮提取物原藥液加入水稀釋2倍，充分溶解后得到核桃青皮提取物殺蟲劑；在第1代2 齡韭蛆幼蟲始盛期，選擇晴天將核桃青皮提取物殺蟲劑噴灑于韭菜葉片正反面。

本發(fā)明有益效果：本發(fā)明利用核桃青皮提取物對韭蛆幼蟲具有較高的觸殺活性，尤其對于殺蟲與拒食活性最強。且本發(fā)明采用了乙醇單溶劑進行提取，操作方法簡便，無任何化學(xué)污染產(chǎn)生，就制備主要原料而言，核桃在我國資源豐富,青皮被作為廢棄物，將其變廢為寶，保護了生態(tài)環(huán)境，胡桃青皮中的胡桃醌、α-氫化胡桃醌、4-葡萄糖苷、鞣質(zhì)、沒食子酸、胡桃醌生物堿和萘醌、豐富的維生素C在抗蟲、抑菌方面的起到巨大作用，實現(xiàn)了社會效益和經(jīng)濟效益的雙贏。通過試驗表明，與傳統(tǒng)40%辛硫磷乳油防治效果相比，本發(fā)明的50%稀釋濃度的核桃提取物對對韭蛆幼蟲防治率與40%辛硫磷乳油500倍稀釋液效果相當(dāng)效果相同。

附圖說明

圖1表示5%藥液、10%藥液、25%藥液、50%藥液、100%藥液、空白對照組的實驗效果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體附圖及實施例對本發(fā)明做進一步的描述。

實施例1：

(1). 制備核桃青皮干粉：新鮮核桃經(jīng)脫皮機脫皮后，低溫烘干。為防止青皮活性成分特別是胡桃醌含量的降低，烘干溫度控制在50℃；

(2). 提取：取1kg的核桃青皮，打碎，室溫下用5 kg的95% 乙醇浸泡3次，合并提取液，濃縮后得乙醇粗提物備用；

(3). 純化：粗提物用乙醇溶解，取粗提物20質(zhì)量份的大孔樹脂DM101進行純化，配制比例為30:70的乙醇和水溶液做洗脫劑洗脫，收集極性低的物質(zhì)部位，濃縮、烘干、打粉，過60目篩備用；

(4). 制劑：取100 g的提取物干粉，用5 g的5%乙醇溶解，然后加入1 g的硬脂酰乳酸鈉乳化劑和滲透劑，最后用純凈水定容，配成水油相一體的10倍量的粗提物原藥液。

實施例2：

(1). 制備核桃青皮干粉：新鮮核桃經(jīng)脫皮機脫皮后，低溫烘干。為防止青皮活性成分特別是胡桃醌含量的降低，烘干溫度控制在40℃以下；

(2). 提?。喝?kg的核桃青皮，打碎，室溫下用7 kg的95% 乙醇浸泡3次，合并提取液，濃縮后得乙醇粗提物備用；

(3). 純化：粗提物用乙醇溶解，取粗提物20質(zhì)量份的大孔樹脂（DM101、AB-8等）進行純化，用比例分別為90:10乙醇和溶液水做洗脫劑洗脫，收集低極性的物質(zhì)部位，濃縮、烘干、打粉，過60目篩備用；

(4). 制劑：取100 g的提取物干粉，用10 g的5%乙醇溶解，然后加入1 g的雙乙酰酒石酸單甘油酯乳化劑和滲透劑，最后用純凈水定容，配成水油相一體的10倍量的粗提物原藥液。

實施例3：

(1). 制備核桃青皮干粉：新鮮核桃經(jīng)脫皮機脫皮后，低溫烘干。為防止青皮活性成分特別是胡桃醌含量的降低，烘干溫度控制在45℃以下；

(2). 提取：取1kg的核桃青皮，打碎，室溫下用6 kg的95% 乙醇浸泡3次，合并提取液，濃縮后得乙醇粗提物備用；

(3). 純化：粗提物用乙醇溶解，取粗提物20質(zhì)量份的大孔樹脂AB-8進行純化，洗脫劑為10:90比例的乙醇和水溶液，收集低極性的物質(zhì)部位，濃縮、烘干、打粉，過60目篩備用；

(4). 制劑：取100 g的提取物干粉，用5 g的5%乙醇溶解，然后加入1 g的硬脂酰乳酸鈉乳化劑和滲透劑，最后用純凈水定容，配成水油相一體的10倍量的粗提物原藥液。將粗提物原藥液濾液濃縮，除去溶劑，即得稠膏狀核桃青皮提取物備用。

實施例4：

本發(fā)明核桃青皮韭蛆幼蟲的防治效果小試試驗。

1、試驗材料

⑴供試苗：韭菜苗；

⑵防治對象：2 齡韭蛆幼蟲；

⑶供試藥劑：實施例1制得的核桃青皮提取物原藥液、清水。

2、試驗設(shè)計

在第1代2 齡韭蛆幼蟲始盛期，選擇晴天將各組藥液稀釋配制0.25%濃度藥液、0.5%濃度藥液、1%濃度藥液、5%濃度藥液、10%濃度藥液、25%濃度藥液、50%濃度藥液、100%濃度濃度藥液后，用毛筆挑取六組20 頭2 齡韭蛆幼蟲放入培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙上，用微量移液器吸取500 μL不同比例的藥液及清水從蟲體上方滴加到蟲體上，以所有試蟲蟲體都能均勻著藥為宜。然后取約0.5 cm長的韭菜段在藥液中浸10 s，晾干表面水分后放入皿內(nèi)。放入溫度25 ℃、相對濕度75%的光照培養(yǎng)箱中，及時補充浸藥的韭菜段并加水保濕。

3、藥效檢查

每一藥劑濃度重復(fù)3次，用藥48 h后檢查結(jié)果。死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為：用毛筆尖輕觸蟲體，以不動者計為死亡。

4、結(jié)果

表1 不同濃度的核桃青皮提取物藥劑對韭蛆幼蟲的防治效果

從表1可看出，與加入清水的空白對照組相比，本發(fā)明實施例1制備的核桃青皮提取物確實對韭蛆幼蟲有較好的防治效果，噴藥48h后核桃青皮提取物稀釋濃度在25%時藥液殺蟲效果已經(jīng)可以達到80％以上，核桃青皮提取物稀釋濃度在50％殺蟲效果最好可以達100％，表現(xiàn)出良好的速效性和持效性。圖1表示5%藥液、10%藥液、25%藥液、50%藥液、100%藥液、空白對照組的實驗效果。

具體結(jié)果如表所示：

實驗得回歸方程：y=2.322+1.490x，其中LC₅₀=0.028，95%置信區(qū)間為0.006-0.172。

實施例5：

核桃青皮提取液作為殺蟲劑的中試試驗。

1、試驗材料

⑴供試苗：韭菜苗；

⑵防治對象：2 齡韭蛆幼蟲；

⑶供試藥劑：40%辛硫磷乳油、清水、實施例1制得的50%稀釋濃度的核桃青皮提取物。

2、試驗設(shè)計

在第1代2 齡韭蛆幼蟲始盛期，將各組藥液稀釋根據(jù)小試試驗結(jié)果將供試藥劑稀釋成相應(yīng)濃度并確定藥液用量，接蟲48 h后選擇晴天在韭菜植株附近灌入稀釋好的藥液，清水和40%辛硫磷乳油(魯南勝邦農(nóng)藥有限公司生產(chǎn))分別作為空白對照和陽性對照。

3、施藥方法

本試驗在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所的濟南試驗田進行，試驗采用常規(guī)壓力容器噴施法。

4、藥效檢查

選擇栽植后具代表性的韭菜地，劃分3個重復(fù)區(qū)，每小區(qū)分為9個處理小區(qū)。待處理４d后，每處理小區(qū)隨機選取12簇韭菜，檢查每簇韭菜中韭蛆的活蟲數(shù)。為了保證小區(qū)間蟲量的一致性，采用接蟲的方法，每小區(qū)中每簇韭菜 (每簇10個單株)接入3齡末幼蟲20頭。

5、結(jié)果

結(jié)果表明50%的核桃青皮提取液與40%辛硫磷乳油500倍稀釋液效果相當(dāng)。

盡管上文對本發(fā)明的具體實施方式給予了詳細(xì)描述和說明，但是應(yīng)該指明的是，我們可以依據(jù)本發(fā)明的構(gòu)想對上述實施方式進行各種等效改變和修改，其所產(chǎn)生的功能作用仍未超出說明書及附圖所涵蓋的精神時，均應(yīng)在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。