本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種制備荔枝菌母種的組織分離方法。
背景技術：
荔枝菌(Litchi chinensis Bacterium)是生長在廣東地區(qū)荔枝林潮濕白蟻窩上，經過高溫多雨、驟出太陽驟降大雨催谷，迅速生長起來的食用菌，素稱為“菌中之王”。能冠宇如此稱號，是因為荔枝菌兼具肉質細嫩、口感清香、味道鮮甜等獨特風味，加之其對生長環(huán)境要求十分苛刻，只生長在荔枝林內潮濕的白蟻窩上，無法人工培植，每年生長周期只有短短20來天，愈加顯得荔枝菌的彌足珍貴。目前有關荔枝菌的研究集中在其菌絲體培養(yǎng)條件的篩選，尚無其母種分離技術的報道，而母種培育制種是實現(xiàn)荔枝菌人工培植的關鍵。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，以期在最大限度保持野生荔枝菌菌株特性的同時獲得高產、優(yōu)質、抗逆性強、適應性強的荔枝菌菌種，為實現(xiàn)荔枝菌的人工高產栽培奠定基礎。
為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：
一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為40～45％的幼嫩子實體，去雜，無菌水洗凈后用75～90％乙醇浸泡50～90s，無菌水沖洗3遍，再用3％NaClO、0.1％HgCl2或0.1％2，4－己二烯酸鉀浸泡1.5min，無菌水沖洗3遍，無菌解剖刀輕輕切開子實體，挑取其中大小為0.25～0.35cm3的中間組織接種即得純培養(yǎng)。
在其中一個實施例中，所述子實體為菌柄與菌蓋銜接處、菌蓋、菌褶、菌柄或擔孢子。
在其中一個實施例中，所述中間組織的接種培養(yǎng)基按重量份包括荔枝殼粉50～60份、瓊脂粉20～25份、葡萄糖5～8份、馬鈴薯10～20份、白蟻巢浸提液25～35份。
在其中一個實施例中，所述荔枝殼粉的粒度為60～100目。
在其中一個實施例中，所述培養(yǎng)基還含有濃度為60～90U/ml的鹽酸四環(huán)素。
在其中一個實施例中，所述白蟻巢浸提液的提取方法為收集白蟻蟻巢，風干，以1:1.2～1.5g/ml的比例加入冷水浸泡6～10min，煮沸12～15min后冷卻至室溫，過濾即得白蟻巢浸提液。
組織分離是利用菌體幼嫩的活組織在適宜的培養(yǎng)基和生長條件下由子實體發(fā)育階段回復到菌絲生長階段，是獲得純菌種的一種方法，它比孢子培養(yǎng)法簡便，培養(yǎng)時間短，不易污染雜菌，成活率高，能保持原菌株的特性，遺傳穩(wěn)定變異小，不僅適于孢子不易收集或萌發(fā)的食用菌，也適于穩(wěn)定優(yōu)良品種的遺傳性。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明采用組織分離的方法制備荔枝菌母種，分離全過程均保持無菌操作，結合野生荔枝菌的生長習性同時在培養(yǎng)基中添加適量抗生素，抑制雜菌生長，能最大限度保持野生荔枝菌菌株特性，所獲得的母種菌絲健壯、顏色潔白、生長迅速，為實現(xiàn)荔枝菌的人工高產栽培奠定了產業(yè)技術基礎，經濟價值大。
具體實施方式
為使本技術領域的技術人員能更好地理解本發(fā)明的技術方案，下面結合實施例對本發(fā)明技術方案進行詳細說明。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
1.白蟻巢浸提液的提取
實施例1
收集白蟻蟻巢，風干，以1:1.2g/ml的比例加入冷水浸泡6min，煮沸12min后冷卻至室溫，過濾即得白蟻巢浸提液。
實施例2
收集白蟻蟻巢，風干，以1:1.35g/ml的比例加入冷水浸泡8min，煮沸13.5min后冷卻至室溫，過濾即得白蟻巢浸提液。
實施例3
收集白蟻蟻巢，風干，以1:1.5g/ml的比例加入冷水浸泡10min，煮沸15min后冷卻至室溫，過濾即得白蟻巢浸提液。
2.接種培養(yǎng)基配方
實施例4
60目荔枝殼粉50份、瓊脂粉20份、葡萄糖5份、馬鈴薯10份、白蟻巢浸提液25份，鹽酸四環(huán)素的濃度為60U/ml。
實施例5
80目荔枝殼粉55份、瓊脂粉22.5份、葡萄糖6.5份、馬鈴薯15份、白蟻巢浸提液30份，鹽酸四環(huán)素的濃度為75U/ml。
實施例6
100目荔枝殼粉60份、瓊脂粉25份、葡萄糖8份、馬鈴薯20份、白蟻巢浸提液35份，鹽酸四環(huán)素的濃度為90U/ml。
3.組織分離法制備荔枝菌母種
實施例7
一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為40％的幼嫩菌柄與菌蓋銜接處子實體，去雜，無菌水洗凈后用75％乙醇浸泡50s，無菌水沖洗3遍，再用3％NaClO浸泡1.5min，無菌水沖洗3遍，無菌解剖刀輕輕切開子實體，挑取其中大小為0.25cm3的中間組織接種至實施例4培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)4～6d，直至菌絲長滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態(tài)即得純培養(yǎng)物。
所得純培養(yǎng)物在1～4℃條件下保存?zhèn)溆茫蛘呒纯捎糜诜敝吃N。
實施例8
一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為42.5％的幼嫩菌蓋子實體，去雜，無菌水洗凈后用82.5％乙醇浸泡70s，無菌水沖洗3遍，再用0.1％HgCl2浸泡1.5min，無菌水沖洗3遍，無菌解剖刀輕輕切開子實體，挑取其中大小為0.30cm3的中間組織接種至實施例5培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)4～6d，直至菌絲長滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態(tài)即得純培養(yǎng)物。
所得純培養(yǎng)物在1～4℃條件下保存?zhèn)溆?，或者即可用于繁殖原種。
實施例9
一種制備荔枝菌母種的組織分離方法，所述方法為選取荔枝菌成熟度為45％的幼嫩菌柄與菌蓋銜接處、菌蓋、菌褶、菌柄或擔孢子子實體，去雜，無菌水洗凈后用90％乙醇浸泡90s，無菌水沖洗3遍，再用0.1％2，4－己二烯酸鉀浸泡1.5min，無菌水沖洗3遍，無菌解剖刀輕輕切開子實體，挑取其中大小為0.35cm3的中間組織接種至實施例6培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)4～6d，直至菌絲長滿，菌絲濃密，粗壯，潔白狀態(tài)即得純培養(yǎng)物。
所得純培養(yǎng)物在1～4℃條件下保存?zhèn)溆?，或者即可用于繁殖原種。
顯然，上述9個實施例僅是本發(fā)明的部分實施例，而不是全部實施例?；诒景l(fā)明的啟示，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本方面所保護的范圍。