本發(fā)明屬于干細(xì)胞領(lǐng)域，涉及腫瘤干細(xì)胞的凍存，具體涉及一種乳腺癌干細(xì)胞凍存保護(hù)劑及制成的凍存保護(hù)試劑盒。

背景技術(shù)：

申請人同日申請了“一種從乳腺癌細(xì)胞株中富集乳腺癌干細(xì)胞的試劑、試劑盒”，該申請?zhí)峁┑脑噭┠苡行娜巳橄侔㎝CF-7細(xì)胞系中便捷、高效地富集得到乳腺癌干細(xì)胞，細(xì)胞球形成周期短(由現(xiàn)有技術(shù)的7天縮短至3天且形成效率顯著提高)、微球體細(xì)胞中CD44⁺CD24^-/low分子標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞和SP細(xì)胞含量高(均由現(xiàn)有技術(shù)的10％以下提高到50％以上)，可以開發(fā)成試劑盒提高科研工作者富集乳腺癌干細(xì)胞的效率。

本申請是為了解決另一個(gè)問題：富集到的乳腺癌干細(xì)胞如何凍存以最大限度的保留其乳腺癌干細(xì)胞特性？研究者不可能每次需要用乳腺癌干細(xì)胞時(shí)都重新進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)、富集，通常都需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)度對乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行凍存、復(fù)蘇后繼續(xù)傳代使用。乳腺癌干細(xì)胞的凍存方法關(guān)乎到復(fù)蘇后的乳腺癌干細(xì)胞所能傳代的次數(shù)以及特性保持。

申請人對現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行了檢索，未發(fā)現(xiàn)專用于乳腺癌干細(xì)胞的凍存保護(hù)劑。考慮到乳腺癌干細(xì)胞也是一種干細(xì)胞，而現(xiàn)有技術(shù)對干細(xì)胞的凍存保護(hù)劑研究較多。

冷凍保存的目的是在液氮的低溫環(huán)境下減緩細(xì)胞的代謝活動(dòng)并維持生命。在細(xì)胞懸液的冷凍過程中，冰晶的形成是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因之一。避免冰晶的形成就要保持冷卻速率緩慢，以使凍存保護(hù)劑逐漸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部形成濃度梯度。當(dāng)冷卻持續(xù)進(jìn)行時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的水分在凍存劑的滲透壓力下逐步流出細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的凍存劑濃度達(dá)到最大時(shí)細(xì)胞就會(huì)完全脫水皺縮達(dá)到最佳凍存狀態(tài)。如果凍存速率太快就不能讓細(xì)胞內(nèi)的水分完全出胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的冰晶形成而對細(xì)胞造成損傷。但凍存液對細(xì)胞有一定毒性作用，凍存速率過低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞在凍存液中暴露的時(shí)間過長而導(dǎo)致細(xì)胞受毒。由凍存保護(hù)劑造成的細(xì)胞毒性和細(xì)胞內(nèi)冰晶造成細(xì)胞損傷這兩種凍存?zhèn)σ驯粡V泛認(rèn)同。

除了冷凍速率，冷凍保護(hù)劑也是減小凍存損傷需要考慮的重要因素之一。冷凍保護(hù)劑根據(jù)穿過細(xì)胞膜的能力被分為滲透性保護(hù)劑和非滲透保護(hù)劑。滲透性冷凍保護(hù)劑有二甲基亞砜、丙三醇、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、甲酰胺等，主要作用是防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成、避免高濃度凍存劑的毒性和使細(xì)胞在耐受度內(nèi)脫水。滲透性保護(hù)劑的保護(hù)能力是由許多小分子構(gòu)成的高溶解度的水溶性復(fù)合物，在高濃度下能夠降低水的冰點(diǎn)，因此在冷凍過程中降低了大量冰晶的形成。非滲透性冷凍保護(hù)劑有海藻糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、聚合物羥乙基淀粉和聚乙烯吡咯烷酮，它們能夠在較低的濃度下保護(hù)細(xì)胞，但要求更高的冷凍速率。如聚合物羥乙基淀粉不能滲入導(dǎo)致細(xì)胞外的濃度增大，在低溫下形成反滲透而脫水起到保護(hù)作用。換言之，非滲透性冷凍保護(hù)劑集中在細(xì)胞外導(dǎo)致細(xì)胞脫水主要是在冷凍的初始階段。海藻糖的保護(hù)作用是和脂膜之間的相互作用，在凍存和復(fù)蘇的過程中保持了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而且能夠形成玻璃化基質(zhì)抑制細(xì)胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生。但即便是非滲透性的保護(hù)劑，也是能引起細(xì)胞損傷的。

以間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存研究為例。為比較凍存率、冷凍保護(hù)劑和凍存時(shí)間對MSCs的影響，研究者們做了大量的研究。早在1997年，有研究將人骨髓MSCs用10％的DMSO在1℃/min到-80℃后凍存在液氮中，24h復(fù)蘇后傳代到15代依然保持成骨分化的能力[Growth kinetics,self-renewal,and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation.J Cell Biochem.1997Feb；64(2):278-94.]。隨后，有研究用10％的DMSO將從人骨髓中分離得到MSCs在1℃/min降至-70℃后在液氮中保存7d，和未凍存的MSCs相比在增殖速率和成骨分化能力上沒有顯著的差異[Characterisation of cryopreserved cells freshly isolated from human bone marrow.Cryo Letters.2006Jan-Feb；27(1):17-28.]。有研究將人臍帶血MSCs用10％DMSO和10％FBS的凍存液凍存在-70℃后在液氮中保存，用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法得到保存了5a的存活率為80％±10％，凍存2a的為89％±5％，并且復(fù)蘇后仍有成纖維的形態(tài)，并能鑒測到CD73、CD90和CD105表面抗原，用茜素紅染色鈣沉積和阿爾新藍(lán)染色蛋白聚糖的方法表明復(fù)蘇后的MSCs仍保持成骨和成軟骨的的分化能力[C-2012:Post-thaw characterization of cord blood-derived mesenchymal stromal cells cryopreserved for up to five years.Cryobiology,2014,69(3):519]。這些研究的重點(diǎn)都是在MSCs凍存后的最高細(xì)胞存活率和功能，最大化保證凍存后的MSCs和最新分離出來的MSCs表現(xiàn)相同特性。

遺憾的是，現(xiàn)有技術(shù)中這些針對干細(xì)胞的凍存保護(hù)劑并不能很好地適用于乳腺癌干細(xì)胞的凍存，難以有效保持乳腺癌干細(xì)胞凍存前的生物學(xué)特性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種乳腺癌干細(xì)胞凍存保護(hù)劑及由此制成的凍存保護(hù)試劑盒，以有效減少凍存對乳腺癌干細(xì)胞的損傷。

技術(shù)方案公布如下：

一種乳腺癌干細(xì)胞凍存保護(hù)劑，用于凍存保護(hù)MCF-7乳腺癌干細(xì)胞，由無血清培養(yǎng)基凍干粉和胎牛血清FBS組成；所述無血清培養(yǎng)基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加常規(guī)生長因子、加蘭他敏和石蒜堿，常規(guī)生長因子包括重組人表皮生長因子EGF、牛血清白蛋白BSA、胰島素和B27，配制成EGF濃度為15-25g/L、BSA濃度為3-5g/L、胰島素濃度為4-6mg/L、濃度為1.5-2.5％、加蘭他敏濃度為50-100nmol/L、石蒜堿濃度為50-100nmol/L的培養(yǎng)液，于37℃、5％CO₂條件下?lián)u床保存20-28h，冷凍干燥。

優(yōu)選地，所述無血清凍干粉濃度為60-90g/L。

優(yōu)選地，所述的乳腺癌干細(xì)胞凍存保護(hù)劑由無血清培養(yǎng)基凍干粉和胎牛血清FBS組成，無血清凍干粉濃度為75g/L；所述無血清培養(yǎng)基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加常規(guī)生長因子、加蘭他敏和石蒜堿配制成EGF濃度為20g/L、BSA濃度為4g/L、胰島素濃度為5mg/L、濃度為2％、加蘭他敏濃度為75nmol/L、石蒜堿濃度為75nmol/L的培養(yǎng)液，于37℃、5％CO₂條件下?lián)u床保存24h，冷凍干燥。

一種乳腺癌干細(xì)胞凍存保護(hù)試劑盒，與胎牛血清FBS配合用于凍存保護(hù)MCF-7乳腺癌干細(xì)胞，包括分裝的無血清培養(yǎng)基凍干粉，無血清培養(yǎng)基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加常規(guī)生長因子、加蘭他敏和石蒜堿配制成EGF濃度為20g/L、BSA濃度為4g/L、胰島素濃度為5mg/L、濃度為2％、加蘭他敏濃度為75nmol/L、石蒜堿濃度為75nmol/L的培養(yǎng)液，于37℃、5％CO₂條件下?lián)u床保存24h，冷凍干燥。

優(yōu)選地，所述的乳腺癌干細(xì)胞凍存保護(hù)試劑盒還包括干燥劑或防腐劑或抗氧化劑。

發(fā)明效果：

本發(fā)明提供的凍存保護(hù)劑是在MCF-7乳腺癌干細(xì)胞富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)而成，能有效減少凍存對乳腺癌干細(xì)胞的損傷，復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率高，致瘤能力強(qiáng)，與凍存前無顯著差異，顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)?；诖酥苽涞脑噭┖杏兄诖龠M(jìn)該凍存保護(hù)劑的商品化和標(biāo)準(zhǔn)化，為科研工作者提供便利。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例介紹本發(fā)明的技術(shù)方案。下述實(shí)施例中未特別強(qiáng)調(diào)的實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)材料，無特別要求，都是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的常規(guī)材料。

實(shí)施例1：不同凍存保護(hù)劑對乳腺癌干細(xì)胞凍存復(fù)蘇后存活率和致瘤性的影響

1、實(shí)驗(yàn)材料

MCF-7乳腺癌干細(xì)胞富集用含血清培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)液中加入10％的胎牛血清FBS和雙抗、加蘭他敏和石蒜堿共150nmol/L，二者摩爾比為1:1。1L培養(yǎng)基加入10ml青霉素-鏈霉素溶液(100×雙抗，北京雷根生物技術(shù)有限公司)。

MCF-7乳腺癌干細(xì)胞富集用無血清培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)液中加入雙抗(濃度同上)、重組人表皮生長因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰島素5mg/L、B272％(1L培養(yǎng)基加20ml 50X B27)、加蘭他敏和石蒜堿共150nmol/L，二者摩爾比為1:1。

MCF-7乳腺癌干細(xì)胞傳代用無血清培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)液中加入雙抗(濃度同上)、重組人表皮生長因子EGF 20g/L、牛血清白蛋白BSA4g/L、胰島素5mg/L、B272％(1L培養(yǎng)基加20ml 50X B27)，無需添加加蘭他敏和石蒜堿。

本發(fā)明凍存保護(hù)劑：由無血清培養(yǎng)基凍干粉和胎牛血清FBS組成，無血清凍干粉濃度為75g/L；所述無血清培養(yǎng)基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加常規(guī)生長因子、加蘭他敏和石蒜堿配制成EGF濃度為20g/L、BSA濃度為4g/L、胰島素濃度為5mg/L、濃度為2％、加蘭他敏濃度為75nmol/L、石蒜堿濃度為75nmol/L的培養(yǎng)液，于37℃、5％CO₂條件下?lián)u床保存24h，冷凍干燥。

對比凍存保護(hù)劑：基于DMSO的標(biāo)準(zhǔn)凍存液，由10％DMSO和90％胎牛血清FBS組成。

2、實(shí)驗(yàn)方法

(1)貼壁培養(yǎng)MCF-7細(xì)胞系

MCF-7細(xì)胞系在上述MCF-7乳腺癌干細(xì)胞富集用含血清培養(yǎng)基中于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，貼壁后當(dāng)細(xì)胞增殖至85％左右時(shí)，處于對數(shù)生長期，用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化、離心、重懸后傳代。

(2)微球體培養(yǎng)(MCF-7乳腺癌干細(xì)胞富集)

取第2代處于對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞用上述MCF-7乳腺癌干細(xì)胞富集用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞以2×10⁴/mL接種至塑料培養(yǎng)瓶中于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)每2-3天更換1次培養(yǎng)液，第3、5、7天計(jì)數(shù)其中的微球體數(shù)目、大小，并計(jì)算微球體形成效率。其中，微球體形成效率＝微球體數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100％。定義≥60μm的球體為微球體。把25cm²的培養(yǎng)瓶底面分割成25個(gè)等面積的小格，隨機(jī)選取15個(gè)小格，計(jì)數(shù)≥60μm的微球體的數(shù)量。

(3)MCF-7乳腺癌干細(xì)胞凍存

實(shí)驗(yàn)組：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干細(xì)胞消化液；消化第3天微球體并吹打；鏡下見大多數(shù)單細(xì)胞形成時(shí)終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入本發(fā)明凍存保護(hù)劑，吸吹均勻，細(xì)胞濃度調(diào)整至1×10⁶個(gè)/mL，分裝于凍存管中，標(biāo)記凍存日期。按照非程序化凍存法凍存(-4℃，1h；置厚壁泡沫中于-80℃保存)。

對照組：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干細(xì)胞消化液；消化第3天微球體并吹打；鏡下見大多數(shù)單細(xì)胞形成時(shí)終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入對比凍存保護(hù)劑，吸吹均勻，細(xì)胞濃度調(diào)整至1×10⁶個(gè)/mL，分裝于凍存管中，標(biāo)記凍存日期。按照非程序化凍存法凍存(-4℃，1h；置厚壁泡沫中于-80℃保存)。

(4)復(fù)蘇方法

將凍存1周的細(xì)胞置于60℃恒溫水浴箱中，0.5min內(nèi)快速復(fù)蘇。融化后迅速移入離心管中，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，吹吸均勻，以1000r/min離心5min，棄去上清。重復(fù)1次。

(5)復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率測定

將復(fù)蘇細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色后，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，測定臺(tái)盼藍(lán)拒染率，并與冷凍前相比較，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率＝(1-臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100％。

(6)致瘤性測定

A、凍存前致瘤性測定用細(xì)胞懸液的制備：

第3天微球體單細(xì)胞懸液的制備：配制0.05％trypsin-0.53mmol/L EDTA-4Na的干細(xì)胞消化液；消化微球體并吹打；鏡下見大多數(shù)單細(xì)胞形成時(shí)終止消化，1500r/min離心6min，吸棄上清；加入DMEM/F12培養(yǎng)液重懸制成濃度2×10²/ml、2×10⁴/ml、2×10⁶/ml單細(xì)胞懸液。

B、實(shí)驗(yàn)組凍存后致瘤性測定用細(xì)胞懸液的制備：

將復(fù)蘇細(xì)胞以1×10⁵/mL接種至上述MCF-7乳腺癌干細(xì)胞傳代用無血清培養(yǎng)基于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后將其消化加入DMEM/F12培養(yǎng)液重懸制成濃度2×10²/ml、2×10⁴/ml、2×10⁶/ml單細(xì)胞懸液。

C、對照組凍存后致瘤性測定用細(xì)胞懸液的制備：

將復(fù)蘇細(xì)胞以1×10⁵/mL接種至上述MCF-7乳腺癌干細(xì)胞傳代用無血清培養(yǎng)基于37℃、5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)后將其消化加入DMEM/F12培養(yǎng)液重懸制成濃度2×10²/ml、2×10⁴/ml、2×10⁶/ml單細(xì)胞懸液。

將上述單細(xì)胞懸液分別接種于小鼠左、右背部皮下，每部位接種0.2ml。觀察接種后8周的腫瘤生長情況。

3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)細(xì)胞存活率

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率為(96.4±4.9)％；對照組細(xì)胞存活率為(77.8±4.2)％。

由此可見，與現(xiàn)有技術(shù)中基于DMSO的標(biāo)準(zhǔn)凍存液相比，本發(fā)明提供的凍存保護(hù)劑具有更為優(yōu)異的保護(hù)效果，能最大限度避免乳腺癌干細(xì)胞在凍存過程中的死亡。

(2)致瘤性

8周后各組成瘤情況如下表(√代表成瘤；×代表未成瘤)：

由此可見，與現(xiàn)有技術(shù)中基于DMSO的標(biāo)準(zhǔn)凍存液相比，本發(fā)明提供的凍存保護(hù)劑具有更為優(yōu)異的保護(hù)效果，能最大限度保護(hù)乳腺癌干細(xì)胞的致瘤性。

實(shí)施例2：凍存保護(hù)試劑盒

一種乳腺癌干細(xì)胞凍存保護(hù)試劑盒，與胎牛血清FBS配合用于凍存保護(hù)MCF-7乳腺癌干細(xì)胞，包括分裝的無血清培養(yǎng)基凍干粉，無血清培養(yǎng)基凍干粉由如下方法制備：在DMEM/F12培養(yǎng)液中添加常規(guī)生長因子、加蘭他敏和石蒜堿配制成EGF濃度為20g/L、BSA濃度為4g/L、胰島素濃度為5mg/L、濃度為2％、加蘭他敏濃度為75nmol/L、石蒜堿濃度為75nmol/L的培養(yǎng)液，于37℃、5％CO₂條件下?lián)u床保存24h，冷凍干燥。

試劑盒中還可以設(shè)有分包裝的硅膠干燥劑或防腐劑或抗氧化劑等。

本發(fā)明提供的凍存保護(hù)劑是在MCF-7乳腺癌干細(xì)胞富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)而成，能有效減少凍存對乳腺癌干細(xì)胞的損傷，復(fù)蘇后的細(xì)胞存活率高，致瘤能力強(qiáng)，與凍存前無顯著差異，顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)?；诖酥苽涞脑噭┖杏兄诖龠M(jìn)該凍存保護(hù)劑的商品化和標(biāo)準(zhǔn)化，為科研工作者提供便利。

上述具體實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明的技術(shù)方案，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不受限于上述具體實(shí)施例。