專利名稱：“試管?！奔夹g(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)，特別涉及動(dòng)物的繁殖方法。
“試管家畜”技術(shù)，也叫家畜體外受精技術(shù)(In Vitro Fertilization,IVF)，是指通過(guò)人工操作使家畜的卵子和精子在體外條件下成熟和受精，并能夠發(fā)育為早期胚胎的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)在家畜最早取得成功的是在1982年，美國(guó)的Brackett等(Bio.Reprod.,27:147-158)用高滲溶液處理牛精子，得到了世界首例體外受精的小牛。但他們所采用的精子獲能方法重復(fù)性很差，包括他們自己也未能得到重復(fù)的結(jié)果。1984年本專利申請(qǐng)者(旭日干)和日本學(xué)者花田章，首次利用鈣離子載體Ionophore A23187和咖啡因等化學(xué)藥物誘導(dǎo)山羊、綿羊及牛精子獲能均獲得成功，并利用此方法培育出世界首胎體外受精山羊(Bull Nippon Vet.and Zootech.Coll.,33:219-221)。后來(lái)這一方法在日本、英國(guó)、美國(guó)、中國(guó)和俄羅斯等多國(guó)的實(shí)驗(yàn)室，在綿羊、牛和豬等多種家畜的實(shí)驗(yàn)中取得成功，并在此基礎(chǔ)上逐步發(fā)展成為比較成熟的，可開(kāi)發(fā)利用的生物高技術(shù)。
申請(qǐng)者自1987年起主持國(guó)家“863”高技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目“牛體外受精技術(shù)的研究與開(kāi)發(fā)”，經(jīng)過(guò)“七五”基礎(chǔ)研究、“八五”應(yīng)用研究和“九五”中試開(kāi)發(fā)研究取得了重大進(jìn)展。于1989年培育出了國(guó)內(nèi)首胎、首批“試管綿羊”(1989，內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)，20:564-569)和“試管?！?1990，中國(guó)科學(xué)通報(bào)，21:1666-1667)。同時(shí)創(chuàng)造性地提出了利用屠宰家畜卵巢卵母細(xì)胞工廠化生產(chǎn)“試管胚胎”的技術(shù)路線，提出了牛體外受精技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程，提出了利用羔羊卵子進(jìn)行“試管內(nèi)雜交育種”的新概念，新技術(shù)。
本發(fā)明的目的是利用“試管?！奔夹g(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程，可以批量引進(jìn)國(guó)外良種家畜的遺傳資源，在國(guó)內(nèi)進(jìn)行規(guī)模化純種繁殖，從而迅速擴(kuò)大良種畜群的規(guī)模，以推動(dòng)我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)，特別是肉牛養(yǎng)殖業(yè)的良種化、產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。這一技術(shù)過(guò)程的主要特點(diǎn)是成本低、速度快、數(shù)量大和效果好，因此該項(xiàng)技術(shù)具有任何一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)都不可替代的優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明的內(nèi)容在國(guó)外利用不同優(yōu)良品種牛的資源，大批量生產(chǎn)純種肉牛和奶牛試管胚胎，運(yùn)回國(guó)內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模胚胎移植，從而達(dá)到國(guó)內(nèi)牛品質(zhì)的迅速改良，滿足國(guó)內(nèi)對(duì)高檔肉牛和奶牛的需求，這就是本項(xiàng)技術(shù)的主要目的。這一技術(shù)路線及其生產(chǎn)規(guī)模目前在國(guó)際上尚無(wú)前例。
(1)從國(guó)外屠宰場(chǎng)中采集優(yōu)良品種純種牛卵巢，帶回實(shí)驗(yàn)室后從卵巢表面回收卵母細(xì)胞。將卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟后進(jìn)行體外受精處理，受精用精子采用與卵巢相同品系的種公牛精子。體外受精卵在體外培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)被體外發(fā)育培養(yǎng)至囊胚期，然后將發(fā)育良好的優(yōu)質(zhì)胚胎經(jīng)冷凍保存處理后儲(chǔ)存于液氮罐中。在整個(gè)體外受精培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液中添加的任何成分均確定不含有任何病原體，從而保證批量生產(chǎn)出的良種牛試管胚胎為不帶有病原體的胚胎。
(2)將保存于液氮罐中的胚胎運(yùn)回國(guó)內(nèi)。胚胎解凍后移植到國(guó)內(nèi)遺傳品質(zhì)較差的受體牛子宮內(nèi)。
(3)受體牛受孕后產(chǎn)下優(yōu)良品種的純種牛犢。
(4)良種犢牛經(jīng)18個(gè)月的飼養(yǎng)發(fā)育至育成期小牛。
(5)優(yōu)良品種的育成期小牛經(jīng)3-5個(gè)月的育肥飼養(yǎng)后成為育肥牛。
(6)將育肥牛送至屠宰場(chǎng)屠宰可以得到高品質(zhì)的牛肉。
(7)屠宰得到的高品質(zhì)的牛肉可直接供應(yīng)市場(chǎng)。
(8)屠宰過(guò)程中得到的卵巢又可用于生產(chǎn)良種牛試管胚胎。
(9)選擇發(fā)育狀況優(yōu)秀的育成期小牛，經(jīng)飼養(yǎng)后可成為種牛。良種母牛經(jīng)超數(shù)胚卵處理后可以獲得優(yōu)質(zhì)良種胚胎，用于胚胎移植。
(10)沒(méi)有受孕的受體母?？梢岳脙?yōu)良品種牛的精液進(jìn)行人工授精，生產(chǎn)出具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雜交一代小牛，經(jīng)育肥后屠宰。這樣既可以得到較高質(zhì)量的牛肉，又可避免了受體?？諔言斐傻慕?jīng)濟(jì)損失。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果1．采用此項(xiàng)工藝可以工廠化、大規(guī)模生產(chǎn)牛試管胚胎。利用本技術(shù)從屠宰場(chǎng)采集的卵巢卵母細(xì)胞的30％以上可以發(fā)育至可供胚胎移植的囊胚期胚胎，然后將這些胚胎進(jìn)行冷凍保存。在此條件下兩名研究人員在國(guó)外一年可以生產(chǎn)近萬(wàn)枚胚胎，這一生產(chǎn)量是其他任何技術(shù)不能達(dá)到的。試管胚胎的大規(guī)模生產(chǎn)可以充分保證國(guó)內(nèi)大規(guī)模胚胎移植所用胚胎的供應(yīng)，從而為這一技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化提供保障。
2．采用此項(xiàng)工藝可以短時(shí)間內(nèi)大批量繁殖良種肉牛。利用運(yùn)回國(guó)內(nèi)的牛試管胚胎可以在國(guó)內(nèi)大規(guī)模開(kāi)展胚胎移植工作，目前牛試管胚胎的移植妊娠率為40％左右，一名胚胎移植工作人員一天可移植幾十頭牛，因此只要受體牛充足，每年可以獲得大批試管牛犢。因?yàn)樯a(chǎn)的試管牛胚胎均為純種胚胎，因此胚胎移植得到的牛犢均為純種牛犢，實(shí)現(xiàn)了牛遺傳品種的一步改良。如果采用傳統(tǒng)的牛遺傳品種改良方法(如人工授精)，一個(gè)品種的改良往往需要20年以上的時(shí)間，而且得到的改良品種仍不是純種，如果管理不善很容易造成品種的退化。由此可以看出采用本工藝可以在短時(shí)間內(nèi)得到大量的純種牛，具有周期短，效果好的特點(diǎn)。
3．采用此項(xiàng)工藝可以極大地降低良種牛引進(jìn)的成本。在此之前良種牛的引入主要采取活牛引入和從國(guó)外購(gòu)買超排處理胚胎(體內(nèi)受精胚胎)的方法。從國(guó)外購(gòu)買一頭純種牛往往需要幾萬(wàn)元人民幣，而且很容易造成疾病的傳播，運(yùn)輸也十分不方便。從國(guó)外購(gòu)買超排處理胚胎防止了疾病的傳播，胚胎的運(yùn)輸也十分便利，但每枚胚胎的價(jià)格都在200-300美元以上，價(jià)格十分昂貴，增加了引進(jìn)牛的成本，不容易大規(guī)模推廣。本項(xiàng)工藝避免了上述兩種方法的缺陷，在國(guó)外生產(chǎn)的無(wú)病原體胚胎可以大批量運(yùn)回國(guó)內(nèi)，而且胚胎的成本十分低。兩名研究人員一年在國(guó)外的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用及生活費(fèi)用只需人民幣十多萬(wàn)元，卻可以生產(chǎn)出近萬(wàn)枚胚胎，這樣每枚胚胎的成本只需人民幣幾十元。這樣低成本的胚胎十分適合我國(guó)的國(guó)情，完全可以在國(guó)內(nèi)大規(guī)模推廣應(yīng)用。
從以上幾點(diǎn)可以看出，目前在國(guó)外良種牛的引進(jìn)方法中，采用“試管?！奔夹g(shù)在國(guó)外生產(chǎn)試管胚胎，然后運(yùn)回國(guó)內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模胚胎移植是最有效的技術(shù)途徑。
附圖
為“試管?！奔夹g(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程實(shí)施例在國(guó)外從屠宰場(chǎng)采集純種牛卵巢。將采自屠宰場(chǎng)的卵巢帶回實(shí)驗(yàn)室，從卵巢表面的卵泡內(nèi)回收卵母細(xì)胞，采卵液為BSA+3mg/mlBSA。將卵母細(xì)胞置于Hepes緩沖的TCMl99+10％FCS+HCG+E2內(nèi)成熟培養(yǎng)20-24小時(shí)，培養(yǎng)箱內(nèi)條件為39℃,5％CO2。將與卵巢相同品種的種公牛冷凍精液置于37℃BO+10mM咖啡因內(nèi)，以3000轉(zhuǎn)/分離心洗滌2次，然后將精子移入BO+5mM咖啡因+10mg/mlBSA+5μg/ml肝素的受精培養(yǎng)液中，使精子濃度達(dá)到2×106ml。將成熟培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞移入該精子懸液中，共同培養(yǎng)7小時(shí)進(jìn)行受精處理。
將受精后的受精卵移入發(fā)育培養(yǎng)液中進(jìn)行體外發(fā)育培養(yǎng)。受精卵在Hepes緩沖的TCM199+10％FCS+0.12mg/ml丙酮酸鈉的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)，將發(fā)育至8細(xì)胞期的胚胎移入含有卯丘細(xì)胞或輸卵管上皮細(xì)胞的共同培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚階段，然后進(jìn)行冷凍保存。體外受精胚胎的冷凍保存方法為將囊胚期胚胎移入PBS+20％FCS+10％乙二醇+0.25M蔗糖的冷凍液中平衡15分鐘，裝入冷凍管中進(jìn)行冷凍。冷凍程序?yàn)?7℃下停留10分鐘，5分鐘時(shí)進(jìn)行植冰，然后以0.3℃/分的速度降溫至-30℃，投入液氮中保存。
將保存于液氮罐中的胚胎運(yùn)回國(guó)內(nèi)，在旭日生物高科技有限公司牧場(chǎng)(位于呼和浩特市托克托縣)和其他胚胎移植基地(大連，呼倫貝爾盟)進(jìn)行胚胎移植。胚胎移植時(shí)先將保存于液氮罐中的胚胎進(jìn)行解凍處理，解凍時(shí)將含有胚胎的冷凍管置于30℃水浴中解凍，然后將胚胎移入PBS+20％FCS+0.7M蔗糖的解凍液中停留10分鐘，最后移入PBS+20％FCS中待移植。選擇營(yíng)養(yǎng)狀況良好、發(fā)情后6-7天的受體母牛，利用非手術(shù)方法將解凍后的胚胎移入受體牛子宮內(nèi)，觀察受體牛妊娠情況。對(duì)妊娠母牛需加強(qiáng)管理，防止流產(chǎn)發(fā)生。母牛妊娠十個(gè)月后即可產(chǎn)下純種牛犢。
采用上述工藝流程，在澳大利亞用三年的時(shí)間生產(chǎn)出了一萬(wàn)七千余枚胚胎。在胚胎的生產(chǎn)過(guò)程中，卵母細(xì)胞受精后的卵裂率為80％以上，囊胚的發(fā)育率為40％左右，冷凍胚胎解凍后的形態(tài)正常率為80％以上。通過(guò)國(guó)內(nèi)的胚胎移植工作，現(xiàn)已獲得純種試管牛70多頭，最好的移植受胎率可達(dá)40％以上。目前國(guó)內(nèi)的胚胎移植工作正在大規(guī)模地開(kāi)展中。與此同時(shí)在加拿大建成了第二個(gè)良種?！霸嚬芘咛ァ鄙a(chǎn)實(shí)驗(yàn)室，用以進(jìn)一步擴(kuò)大胚胎來(lái)源和良種牛的品種資源。
權(quán)利要求
1.試管牛技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程，其特征是下列步驟組成(1)從屠宰場(chǎng)中采集優(yōu)良品種純種牛卵巢，從卵巢表面回收卵母細(xì)胞，采卵液為PBS+3mg/mlBSA，將卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)成熟后進(jìn)行體外受精處理，受精用精子采用與卵巢相同品系的種公牛精子，體外受精卵在體外培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)繼續(xù)體外發(fā)育培養(yǎng)至囊胚期，然后將發(fā)育良好的優(yōu)質(zhì)胚胎經(jīng)冷凍保存處理后儲(chǔ)存于液氮罐中，在體外受精培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)液添加的任何成分均確定不含有任何病原體；(2)將保存于液氮罐中的胚胎解凍后移殖到遺傳品質(zhì)較差的受體牛子宮內(nèi)；(3)受體牛受孕后產(chǎn)下優(yōu)良品種的純種牛犢；(4)良種犢牛經(jīng)18個(gè)月的飼養(yǎng)發(fā)育至育成期小牛；(5)優(yōu)良品種的育成期小牛經(jīng)3-5個(gè)月的育肥飼養(yǎng)后成為育肥牛；(6)將育肥牛送至屠宰場(chǎng)屠宰可以得到高品質(zhì)的牛肉；(7)屠宰得到的高品質(zhì)的牛肉可直接供應(yīng)市場(chǎng)；(8)屠宰過(guò)程得到的卵巢又可用于生產(chǎn)良種牛試管胚胎；(9)選擇發(fā)育狀況優(yōu)秀的育成期小牛，經(jīng)飼養(yǎng)后可成為種牛，良種母牛經(jīng)超數(shù)排卵處理后可以獲得優(yōu)質(zhì)良種胚胎，用于胚胎移植；(10)沒(méi)有受孕的受體母?？梢岳脙?yōu)良品種牛的精液進(jìn)行人工受精，生產(chǎn)出具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雜交一代小牛，經(jīng)育肥后屠宰，可以得到較高質(zhì)量的牛肉。
2.如權(quán)利要求1所述的試管牛技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程，其特征是步驟(1)中的培養(yǎng)液為Hepes緩沖的TCM199+10％FCS+HCG+E2，培養(yǎng)時(shí)間為20-24小時(shí)，培養(yǎng)箱條件為39℃、5％CO2，與卵巢相同品種的種公牛冷凍精液置于37℃BO+10mM咖啡因內(nèi)，以3000轉(zhuǎn)/分離心洗滌2次，然后將精子移入BO+5mM咖啡因+10mg/mlBSA+5μg/ml肝素的受精培養(yǎng)液中，使精子濃度達(dá)到2×106ml，培養(yǎng)7小時(shí)，受精后的受精卵在Hepes緩沖的tcm199+10％fcs+0.12mg/ml丙酮酸鈉的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時(shí)，將發(fā)育至8細(xì)胞期的胚胎移入含有卵母細(xì)胞或輸卵管上皮細(xì)胞的共同培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚階段，然后冷凍保存。冷凍程序?yàn)?7℃下停留10分鐘，5分鐘進(jìn)行植冰，然后以0.3℃/分的速度降溫至-30℃，投入液氮中保存。
3.如權(quán)利要求1所述的試管牛技術(shù)產(chǎn)業(yè)化工藝流程；其特征是步驟(2)胚胎解凍時(shí)將含有胚胎的冷凍管呈于30℃水浴中解凍，然后將胚胎移入PBS+20％FCS+0.7M蔗糖的解凍液中停留10分鐘，最后移入PBS+20％FCS待移植，選擇營(yíng)養(yǎng)狀況良好，發(fā)情后6-7天的受體母牛利用非手術(shù)方法將解凍后的胚胎移入受體牛子宮內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物工程技術(shù),利用優(yōu)良品種純種牛卵巢回收卵母細(xì)胞,經(jīng)體外成熟、體外受精、體外發(fā)育及胚胎冷凍和解凍后的移植,利用我國(guó)現(xiàn)有母牛做為受體牛,借腹懷胎,從而得到大批的優(yōu)良品種純種牛犢,本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是可以短時(shí)間內(nèi)大批量繁殖良種肉牛,同時(shí)可以極大地降低良種牛引進(jìn)的成本。
文檔編號(hào)A01K67/02GK1226377SQ9910329
公開(kāi)日1999年8月25日 申請(qǐng)日期1999年4月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月1日
發(fā)明者旭日干 申請(qǐng)人:旭日干