一種快速提高丹參中迷迭香酸含量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術和植物學技術領域，特別涉及到一種快速提高丹參中迷迭香 酸含量的方法。
【背景技術】
[0002] 丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge)又名赤參、紫丹參，為唇形科鼠尾草屬多年生 草本植物丹參的根。丹參中的藥用活性成分主要分為丹參酮和丹參酚酸兩大類。丹參具有 活血化淤、清熱解毒、通經(jīng)、涼血消腫、鎮(zhèn)靜安神之功效，廣泛應用于心腦血管疾病的治療。
[0003] 丹參酮（tanshinone)是中藥丹參的根的提取物，其中含有丹參酮II A、丹參酮I、 隱丹參酮、丹參酮II B等40余種化合物。丹參酮對心血管系統(tǒng)具有廣泛的作用，主要表現(xiàn) 為內皮細胞保護作用、抗心肌缺血作用、改善血液代謝作用以及對心肌的保護作用。其作用 機制研究證明，丹參酮對內細胞缺血再灌注性損傷有保護作用，可以抑制低密度脂蛋白的 氧化，抑制脂制代謝酶的活性，改善脂質代謝過程，對于防治心血管疾病有良好作用（中國 專利【申請?zhí)枴?00610005271. 1，公告號：CN100362993C，發(fā)明名稱：一種丹參酮乳劑及其制 備方法）。
[0004] 丹參酚酸類化合物是存在于丹參或其同屬植物中的酚酸類化合物，其中含有丹參 酚酸A、丹參酚酸B (LAB)、迷迭香酸（RA)等多種化合物。丹參酚酸類化合物對于心腦血管 具有保護作用。能夠抗纖維化，抗肝損傷?？芍委熛詽?。還能殺傷癌細胞，增強抗癌 藥物的療效，且不會相應增加抗癌藥物的毒性。丹參酚類化合物沒有明顯的毒副作用（中 國專利【申請?zhí)枴?00510094596. 7,公告號：CN1762341B，發(fā)明名稱：治療心腦血管疾病、肝臟 疾病的丹參酚酸復合物及其應該用）。
[0005] 迷迭香酸（Rosmarinicacid，簡稱RosA)是一種天然多功能酸酸類化合物。迷迭香 酸具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗過敏、抗氧化、抗血栓抗血小板聚集、防輻射和免疫抑 制作用，迷迭香酸對神經(jīng)系統(tǒng)有抗焦慮作用，對細胞損傷有保護作用，廣泛應用于醫(yī)藥、食 品、化妝品等方面。最新研究表明，丹參中迷迭香酸有抗艾滋病病毒（HIV)活性（參見文獻： William H? William BL. Inhibitors of human immunodeficiency virus type lreverse transcriptase target distinct phases of early reverse transcription. Journal of virology，2001，75 :3095-3104)。
[0006] 隨著丹參有效成分及其藥理活性的深入研究，近年來以丹參為主要原料的藥品、 制劑、化妝品和系列保健產(chǎn)品層出不窮，丹參資源供不應求。伴隨著丹參藥材需求的日益擴 大和野生資源的逐漸減少，質量參差不齊，加劇了丹參的供需矛盾。目前提高丹參有效成份 的方法有人工栽培配合茉莉酸誘導，毛狀根培養(yǎng)，轉基因毛狀根培養(yǎng)，茉莉酸誘導毛狀根， 水楊酸誘導丹參培養(yǎng)細胞等等；提高的成份主要是丹參酮類（包括隱丹參酮、丹參酮IIA、 丹參酮I和二氫丹參酮I)和丹酸酸類（包括丹酸酸、丹酸酸B、迷迭香酸和丹酸酸K)。
[0007] 因此提高丹參中有效成分的含量，尤其是迷迭香酸的含量，對培育優(yōu)異的丹參資 源具有重要意義。
[0008] 目前尚無文獻報道丹參細胞系懸浮細胞培養(yǎng)提高迷迭香酸含量的方法。

【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明的目的是提供一種快速提高丹參中迷迭香酸含量的方法，是用丹參細胞系 懸浮細胞培養(yǎng)方法，提高丹參中有效成分一迷迭香酸的含量。
[0010] 本發(fā)明的主要技術方案是：通過將愈傷組織轉接至液體培養(yǎng)基、反復繼代，并通過 茉莉酸甲酯進行誘導培育出迷迭香酸含量高的丹參細胞系，實現(xiàn)人工培養(yǎng)，達到規(guī)?；?產(chǎn)的目的。
[0011] 本發(fā)明提供了一種快速提高丹參中迷迭香酸含量的方法，該方法主要由以下步驟 組成：
[0012] A、外植體處理：取丹參種子作為外植體，進行清洗和消毒，將干燥的種子接種到 MS空白培養(yǎng)基上，培養(yǎng)成為無菌苗，在無菌狀態(tài)下將丹參無菌苗幼葉、莖、根分別剪下，將葉 片制成塊，莖及根制成段；
[0013] B、愈傷組織的誘導：選用MS作為丹參愈傷組織誘導的基本培養(yǎng)基，將步驟A制備 好的外植體接種于MS培養(yǎng)基附加0. 5mg/L的2, 4-二氯苯氧乙酸（2, 4-D)、0. 5mg/L的6-芐 氨基腺嘌呤（6-BA)、0. 5mg/L的萘乙酸（NAA)，培養(yǎng)基的蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為1%， pH值為5. 0-6. 5,在光照12小時/天，光照強度為3000Lux條件下培養(yǎng)30天，溫度為25°C， 得到顏色有光澤呈鮮黃綠色，生長旺盛，疏松的愈傷組織；
[0014] C、細胞的懸浮培養(yǎng)：將步驟B得到的愈傷組織接種到于與步驟B中所使用的MS培 養(yǎng)基相同組分和含量的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28°C，黑暗條件下，120r/min振蕩培養(yǎng)，每 18-20天進行一次繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)3-15次后得到分散性良好的懸浮細胞系；
[0015] D、茉莉酸甲酯誘導丹參懸浮細胞：在無菌條件下，取新鮮繼代5次以上得到丹參 懸浮細胞，按懸浮細胞體積計算，將茉莉酸甲酯用無菌注射器通過無菌過濾膜注入懸浮細 胞系中，終濃度為0.1 mM/L，培養(yǎng)至12天以上較優(yōu)為14天，即得到迷迭香酸含量高的丹參細 胞系。
[0016] 其中步驟A中，較優(yōu)的，葉片制成0. 5X0. 5cm的塊，莖及根制成1cm的段。
[0017] 其中在步驟B中，較優(yōu)的，培養(yǎng)基中還添加了 0. lmg/L的Vc。
[0018] 步驟8中，2,4-〇母液的配置方法：取1〇11^2,4-〇，先溶于95%乙醇中，然后加入 去離子水加熱溶解，定容至l〇〇mL，冷藏保存；
[0019] NAA母液的配置方法：取50mg NAA，先溶于少量1 mol/L的氫氧化鈉中，然后用去 離子水定容至l〇〇mL，冷藏保存；
[0020] 6-BA母液的配置方法：取50mg 6-BA，先溶于少量1 mol/L的氫氧化鈉中，然后用 去離子水定容至100mL，冷藏避光保存。
[0021] 步驟B中，pH值較優(yōu)為6. 0-6. 5。
[0022] 步驟C中，所述的愈傷組織為顆粒細小、疏松易碎、外觀濕潤鮮艷的白色或淡黃色 愈傷組織。
[0023] 術語解釋，本文中"外植體"指由活植物體上切取下來以進行培養(yǎng)的那部分組織或 器官。
[0024] MS空白培養(yǎng)基、MS、MS基本培養(yǎng)基、MS固體培養(yǎng)基，表示同一意思，是指MS培養(yǎng)基， 固體的是添加有瓊脂的MS培養(yǎng)基，液體是未添加瓊脂的培養(yǎng)基，MS粉末（不含蔗糖）可直 接購自上海前塵生物科技有限公司。
[0025] Lux條件是指光照強度。
[0026] 液體培養(yǎng)基是指未添加瓊脂的培養(yǎng)基。
[0027] 繼代培養(yǎng)是對來自于外植體所增殖的培養(yǎng)物（包括細胞、組織或其切段）通過更 換新鮮培養(yǎng)基及不斷切割或分離，進行連續(xù)多代的培養(yǎng)
[0028] 懸浮細胞系是由單一細胞增殖產(chǎn)生的遺傳背景一致的懸浮細胞。
[0029] 本發(fā)明的方法克服了丹參作為常異交植物，種內變異較大，性狀復雜；栽培丹參只 種不選的狀況使得各產(chǎn)地丹參質量參差不齊，品種退化嚴重，有效成分含量不穩(wěn)定的問題。 本發(fā)明經(jīng)高效液相（HPLC)實驗證明，有效成份4-香豆酸、肉桂酸、L-苯丙氨酸、4-羥基苯 丙酮酸、尿黑酸、L-酪氨酸、迷迭香酸和丹酚酸B提高。特別是能夠快速提高丹參中迷迭香 酸的含量。
[0030] 本發(fā)明的方法操作簡單，能夠生產(chǎn)出迷迭香酸含量高的丹參細胞系，滿足了市場 需求。
【附圖說明】
[0031] 圖1懸浮細胞顯微圖，其中A是三五個成群聚集在一起的丹參懸浮細胞、B是成熟 的細胞，細胞核比較小、C是小圓形的成熟細胞，細胞核比較大。
[0032] 圖2懸浮細胞TTC染色圖。
[0033] 圖3經(jīng)MeJA誘導后丹參懸浮細胞的含量測定結果。
【具體實施方式】
[0034] 現(xiàn)結合實施例和附圖，對本發(fā)明作詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
[0035] 下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商 所建議的條件。
[0036] 實施例1 :
[0037] 1、外植體處理：用自來水沖洗丹參（S. miltiorrhiza Bunge)種子4小時以上，之 后將其浸泡在75%的乙醇溶液中30秒，然后用無菌去離子水沖洗5次，再用濃度為0. 1% 的升汞溶液（lg/L HgCl2)浸泡10分鐘，最后用無菌水沖洗5次，用無菌的紗布將其擦干凈， 將擦凈的種子接種到MS培養(yǎng)基（購自上海生工生物工程公司）上，培養(yǎng)數(shù)周后將長成為無 菌苗。取無菌丹參幼苗，用去離子水沖洗干凈，并用軟毛刷輕輕刷洗，在無菌條件下將丹參 無菌苗幼葉、莖、根分別剪下，用剪刀將葉片切成0. 5X0. 5cm，上表皮向下接種誘導在MS培 養(yǎng)基上，莖及根切成lcm小段。
[0038] 2、激素的配置：
[0039] 2, 4-D母液（100mg/L，購自上海源葉生物科技有限公司）：取10mg2, 4-D，先溶于 95%乙醇中，然后加入去離子水加熱溶解，定容至100mL，冷藏保存。
[0040] NAA母液（500mg/L，購自上海源葉生物科技有限公司）：取50mgNAA，先溶于少量1 mol/L的氫氧化鈉中，然后用去離子水定容至100mL，冷藏保存。
[0041] 6-BA母液（500mg/L，購自上海源葉生物科技有限公司）：取50mg6-BA，先溶于少量 1 mol/L的氫氧化鈉中，然后用去離子水定容至lOOmL，冷藏避光保存。
[0042] 3、愈傷組織的誘導：選用MS(購自上海生工生物工程公司）作為丹參愈傷組織誘 導的基本培養(yǎng)基，將步驟1備好的外植體接種于基本培養(yǎng)基附加表1中2, 4-D、6-BA、NAA不 同濃度，培養(yǎng)基的蔗糖濃度為3%，瓊脂濃度為1 %，pH值為6. 3,在光照12h/d，光照強度 為3000Lux條件下培養(yǎng)30d，溫度為25°C，得到顏色有光澤呈鮮黃綠色，生長旺盛，疏松的愈 傷組織。
[0043] 表1誘導愈傷組織培養(yǎng)基
[0044]
[0045] 表2不同激素配比對愈傷組織誘導的影響
[0046]
[0048] 4、細胞的懸浮培養(yǎng)：挑選步驟3中顆粒細小、疏松易碎、外觀濕潤鮮艷的白色或淡 黃色愈傷組織接種到與步驟3中所使用的MS固體培養(yǎng)基相同組分和含量的液體培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)溫度28°C，黑暗條件下，120r/min振蕩培養(yǎng)，每19天進行一次繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)5次 后得到分散性良好的懸浮細胞系。
[0049] 5、茉莉酸甲酯誘導丹參懸浮細胞：在無菌條件下，取新鮮繼代5次以上得到丹參 懸浮細胞，按懸浮細胞體積計算，將茉莉酸甲酯（購自SIGMA)用無菌注射器通過無菌過濾 膜注入懸浮細胞系中，終濃度為0.1 mM/L，培養(yǎng)12天得到迷迭香酸含量高的丹參細胞系。
[0050] 實施例2 :
[0051] 步驟3中基本培養(yǎng)基中還加入了 0. lmg/LVc，防褐變，其余步驟同實施例1。
[0052] 實施例 3-7 :
[0053] 步驟4中懸浮細胞培養(yǎng)液體培養(yǎng)基的激素配比按表1編號3-8,共6組，其余步驟 同實施例1。進入懸浮培養(yǎng)階段的各激素配比下的丹參懸浮細胞形態(tài)見表3,實施例1中的 3號激素配方獲得了生長狀