專利名稱：一種非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物及其作為胎牛血清 等的替代物在細胞培養(yǎng)中的應用。
(二)
背景技術：
在常規(guī)的細胞培養(yǎng)、擴增過程中，動物源性血清如胎牛血清(FBS) 是細胞擴增必須的添加成分。
再生醫(yī)學的細胞治療手段中，臨床使用的種子細胞不僅有數量要求， 并且需要保證其安全有效，動物源性血清參與細胞培養(yǎng)雖然能滿足數量 需求，卻給臨床治療帶來了不安全隱患。而自體來源的血清無論獲得及使 用都有諸多不便，無法達到使細胞快速擴增的效果，也無法滿足臨床細胞 治療對于細胞數量的需求。
(三)

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是一種非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物及其作為胎牛血 清等的替代物在細胞培養(yǎng)中的應用。
本發(fā)明采用的技術方案是
一種非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物，由如下方法制備得到取3~5 體積單位O型的血沉棕黃層和1體積單位AB型的血漿混合，300 400g 離心，取上清液作為一個體積單位的富含血小板血漿；將富含血小板血漿 過濾除去白細胞，-l(TC以下冷凍保存?zhèn)溆?，使用?0 37。C解凍、 3000 5000g離心去除血小板膜碎片，既得所述非動物源性細胞培養(yǎng)血清
3替代物，以PLT表示。
血液由液體成分的血漿和懸浮于其中的血細胞組成，合稱為全血。 血漿離開血管的全血經抗凝處理后，通過離心沉淀，所獲得的不含細胞 成分的液體，即血漿。血清離體的血液凝固之后，經血凝塊聚縮釋出的 液體，即血清。粗略的說，血清與血漿的區(qū)別，主要在于血清不含纖維蛋 白元。血沉棕黃層富含血小板，是全血經重離心獲得的沉淀部分，上清部 分即為血漿。
具體的，所述非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物由如下方法制備得到 取4體積單位O型的血沉棕黃層和1體積單位AB型的血漿混合，341g 離心6min,取上清液作為一個體積單位的富含血小板血漿；將富含血小 板血漿過濾除去白細胞，-30°(3冷凍保存?zhèn)溆?，使用?7。C解凍、5000g 離心5min去除血小板膜碎片，既得所述非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物， 即PLT。
本發(fā)明還涉及所述的非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物作為胎牛血清
替代物在細胞培養(yǎng)中的應用。
所非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物作為胎牛血清替代物可用于培養(yǎng)
間質干細胞、人軟骨細胞、人肌腱細胞或皮膚人成纖維細胞等常規(guī)細胞的 培養(yǎng)。所述培養(yǎng)僅僅是以PLT替代胎牛血清，其他參數可按照本領域常 規(guī)方法進行。
所述PLT在細胞培養(yǎng)基的用量可參照胎牛血清用量，優(yōu)選的，本發(fā) 明中所述的應用為在DMEM培養(yǎng)液中添加10%體積的PLT,作為待用 培養(yǎng)基基本組分，用于細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)基中其他附加組分，如肝素、雙抗 等，按常規(guī)用量即可。本發(fā)明方法能夠避免使用動物源性血清，避免了異種添加物的高危險
性；而制備及利用人血小板溶血產物(HPL)作為血清替代物進行細胞培 養(yǎng)，不僅能夠刺激細胞在短期內大量擴增，還能夠維持干細胞的多向分化 潛能，不影響細胞質量。
這種細胞培養(yǎng)及擴增方法，不僅有利于加速實-驗研究進程，更有利于 縮短臨床使用周期。
本發(fā)明的有益效果主要體現在利用PLT作為胎牛血清替代物用于 細胞培養(yǎng)，能夠免除細胞培養(yǎng)中的動物源性成分，加速細胞倍增，從而滿 足臨床安全和縮短手術周期需求，不僅適用于間質干細胞，亦適用于其他 人源細胞的擴增培養(yǎng)。 具體實施例方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一 步描述,但本發(fā)明的保護范圍 并不僅限于此
實施例1: PLT獲得方法具體操作步驟
(1) 釆全血(450ml±45ml),至血袋(枸櫞酸鹽磷酸鹽右旋糖血袋)；
(2) 22。C靜置16小時后，血液離心(4250g, 13min， 22°C )，分離紅細 胞和血小板，得到血沉棕黃層和血漿。儀器(CompomatG3， NPBI， Amsterdam, the Netherlands ));
(3) 為避免MSC引發(fā)凝集反應；四單位的O型血沉棕黃層混合一單位 的AB血漿，輕柔離心(341g， 6min， 22°C )作為一個單位的富含 血小板血漿(PRP)。 PRP轉移入貯存袋，過濾除去白細胞。-30°C 冷凍保存。使用前，37。C解凍離心(4000g， 15min)，去除PLT膜 碎片，降低引發(fā)異體之間的免疫應答的危險。(4)上清液即為PLT。
實施例2: PLT作為血清替代物培養(yǎng)間質干細胞
培養(yǎng)基配制500mlDMEM基礎培養(yǎng)基中添加50mLPLT, 1OOOU肝 素，lmmol谷氨酰胺，5mL雙抗(青霉素與鏈霉素濃度各為10000U/mL); 原代細胞培養(yǎng)
1. 抽取5ml骨髓，肝素抗凝；利用PLT培養(yǎng)基進行差速貼壁法培養(yǎng)；
2. 36小時后首次換液，75cm2細胞培養(yǎng)瓶添加15ml培養(yǎng)基。
3. 每2 3天換液一次；第5 6天胰酶消化計數，此為原代細胞獲取過程； 細月包擴增
1. 初始以3><105個細胞種植，每隔2天換液一次，細胞密度到達90%以 上即可傳代。
2. 胰酶消化，每瓶以3xl()S個細胞密度種植，2 3天換液一次；
3. 經過11 14天擴增及傳代過程，總共可收獲不小于3x 108個細胞。 而常規(guī)以添加胎牛血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，由初始3xl()S個細胞培養(yǎng)
至獲得不小于3x 108個細胞，通常需要14天以上。
實施例3: PLT作為血清替代物培養(yǎng)人軟骨細胞
培養(yǎng)基配制500mlDMEM基礎培養(yǎng)基中添加50mLPLT， 1000U肝 素，lmmol谷氨酰胺，5mL雙抗(青霉素與鏈霉素濃度各為10000U/mL); 使用75cm2培養(yǎng)瓶擴增細胞； 細胞擴增
1.以1 x 106個細胞/瓶種植，每2天換液一次，細胞密度到達90%以上傳 代。
62. 胰酶消化傳代，種植密度為1.5xloV瓶；隔2 3天換液；
3. 經過11-14天擴增及傳代過程，總共可收獲不小于4.5x 108個細胞。 軟骨細胞的異位成軟骨培養(yǎng)
1. 收集106個以上軟骨細胞；
2. 用0.25ml膠原凝膠、0.25ml軟骨基質混懸，使之成凝膠團塊；
3. 將團塊植入棵鼠背部皮下，4周后取出觀察，組織學切片檢測，呈典型 軟骨組織結構。
實施例4: PLT作為血清替代物培養(yǎng)人肌腱細胞
培養(yǎng)基配制500mlDMEM基礎培養(yǎng)基中添加50mLPLT, IOOOU肝素， lmmol谷氨酰胺，5mL雙抗(青霉素與鏈霉素濃度各為10000U/mL); 使用75cn^培養(yǎng)瓶擴增細胞； 細胞擴增
1. 以5xl05個細胞/瓶種植，每2天換液一次，細胞密度到達90%以上傳 代。
2. 胰酶消化傳代，種^f直密度為8x 105/瓶；隔2 3天換液；
3. 經過11 14天擴增及傳代過程，總共可收獲不小于3 x 108個細胞。
實施例5: PLT作為血清替代物培養(yǎng)皮膚人成纖維細胞
培養(yǎng)基配制500mlDMEM基礎培養(yǎng)基中添加50mLPLT, 1OOOU肝素，
lmmol谷氨酰胺，5mL雙抗(青霉素與鏈霉素濃度各為10000U/mL);
4吏用75cm^咅養(yǎng)并瓦擴增細月包；
細胞擴增
1. 以5xl05個細胞/瓶種植，每2天換液一次，細胞密度到達90%以上傳代。
2. 胰酶消化傳代，種植密度為8x 105/瓶；隔2~3天換液；
3. 經過11 14天擴增及傳代過程，總共可收獲不小于3x 108個細胞。
權利要求
1. 一種非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物，由如下方法制備得到取3～5體積單位O型的血沉棕黃層和1體積單位AB型的血漿混合，300～400g離心，取上清液作為一個體積單位的富含血小板血漿；將富含血小板血漿過濾除去白細胞，-10℃以下冷凍保存?zhèn)溆茫褂们?0～37℃解凍、3000～5000g離心去除血小板膜碎片，既得所述非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物，以PLT表示。
2. 如權利要求1所述的非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物，其特征在于所 述非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物由如下方法制備得到取4體積單 位O型的血沉棕黃層和1體積單位AB型的血漿混合，341g離心6min, 取上清液作為一個體積單位的富含血小板血漿；將富含血小板血槳過 濾除去白細胞，-30°(3冷凍保存?zhèn)溆茫褂们?7X:解凍、5000g離心5min 去除血小板膜碎片，既得所述非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物，即PLT。
3. 如權利要求1所述的非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物作為胎牛血清替 代物在細胞培養(yǎng)中的應用。
4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所非動物源性細胞培養(yǎng)血清替 代物作為胎牛血清替代物用于培養(yǎng)間質干細胞、人軟骨細胞、人肌腱 細胞或皮膚人成纖維細胞。
5. 如權利要求4所述的應用，其特征在于所述的應用為在DMEM培養(yǎng) 液中添加10%體積分數的PLT,用于細胞培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物(PLT)及其應用，所述PLT由如下方法制備得到取3～5體積單位O型的血沉棕黃層和1體積單位AB型的血漿混合，300～400g離心，取上清液作為一個體積單位的富含血小板血漿；將富含血小板血漿過濾除去白細胞，-10℃以下冷凍保存?zhèn)溆?，使用?0～37℃解凍、3000～5000g離心去除血小板膜碎片，既得所述非動物源性細胞培養(yǎng)血清替代物。本發(fā)明的有益效果主要體現在利用PLT作為胎牛血清替代物用于細胞培養(yǎng)，能夠免除細胞培養(yǎng)中的動物源性成分，加速細胞倍增，從而滿足臨床安全和縮短手術周期需求，不僅適用于間質干細胞，亦適用于其他人源細胞的擴增培養(yǎng)。
文檔編號C12N5/0775GK101486996SQ200910096079
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月6日 優(yōu)先權日2009年2月6日
發(fā)明者姜洋子, 歐陽宏偉 申請人:浙江大學