專利名稱：一種利用rapd快速區(qū)分葡萄品種的方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及分子生物學分子標記領域，具體地說涉及一種利用RAPD快速地區(qū)分葡萄品種的方法。
背景技術(shù)：
葡萄不僅栽培歷史悠久，而且分布廣泛。近些年來，隨著我國葡萄產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，大量的優(yōu)良品種應用于葡萄生產(chǎn)中。因此，建立葡萄品種快速可靠的鑒定技術(shù)體系對于苗木早期鑒定、品種權(quán)利保護、生產(chǎn)中品種的區(qū)分等具有重要的實際意義。目前，傳統(tǒng)單一的形態(tài)學品種鑒定方法已經(jīng)難以有效區(qū)分或鑒別眾多的品種；而且，許多葡萄育種親本越來越集中在少數(shù)優(yōu)良品種或品系上，使得所選育的新品種在更多的性狀上更加相似，而難以區(qū)分。如何有效的鑒定科研和生產(chǎn)中品種，就成為一個常常遇到，而又非常重要的問題。 迄今尚沒有利用DNA標記進行品種鑒定的快速與高效的措施，也無法形成進行品種鑒定時的依據(jù)與參考。因此，品種鑒定就缺乏目的性，非直觀，同時隨機性太強，工作效率低。為此， 開發(fā)快速進行品種鑒定的新措施具有重要意義。分子標記是隨著分子克隆和重組DNA技術(shù)的發(fā)展而產(chǎn)生的一類遺傳標記。近年來，分子標記技術(shù)已被廣泛用于蔬菜作物的種質(zhì)鑒定和指紋分析。由于DNA分析技術(shù)不受環(huán)境、發(fā)育階段、取樣部位的影響，檢出的多態(tài)位點是無限的，結(jié)果具有高度的可靠性，且鑒別力強，重復性高。在常用的RAPD、RFLP, SSR、AFLP等分子標記技術(shù)中，RAPD(Rand0m Amplified Polymorphic DNA，隨機擴增多態(tài)性DNA)發(fā)展歷史長，是應用最早的DNA標記技術(shù)之一，它以快捷、簡便、不易受外界環(huán)境影響以及不需要預知基因組序列的特點與優(yōu)勢， 已被廣泛應用于品種的分類研究、種質(zhì)資源的遺傳基礎研究、基因連鎖標記、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面。現(xiàn)有RAPD在蔬菜作物的種質(zhì)鑒定中，多采用計算機軟件繪制數(shù)字化指紋圖譜，并結(jié)合統(tǒng)計學軟件進行聚類分析，但聚類分析的結(jié)果往往無法用于品種鑒別。中國專利“基于基因組RAPD分析的豇豆品種分子鑒定方法”(專利號ZL200510018593. 5)公開了基于RAPD 區(qū)分并判斷豇豆不同品種的方法，經(jīng)過篩選得到23個引物，采用0-1指紋技術(shù)并構(gòu)建出聚類樹。該專利采用引物較多，在品質(zhì)鑒定時操作量非常大，通過聚類樹不好判斷區(qū)分品種的引物，而且不夠直觀。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，用于高效區(qū)分葡萄品種，構(gòu)建直觀實用的鑒別圖譜。技術(shù)方案為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法包括如下步驟(1)針對葡萄的基因序列設計RAPD隨機引物，篩選得到穩(wěn)定性和多態(tài)性高的隨機引物，并確定退火溫度；
(2)利用步驟(1)得到的隨機引物對未知葡萄品種進行PCR擴增，根據(jù)特異性譜帶構(gòu)建相應被區(qū)分品種的圖譜關(guān)系。所述步驟(1)中的隨機引物由11個堿基組成，隨機引物篩選通過連續(xù)兩次梯度 PCR選擇條帶一致的溫度作為退火溫度。RAPD中的引物設計非常關(guān)鍵，一般RAPD的引物為 9 10個堿基，理論上，引物越短，模板序列兩端與引物互補的位點數(shù)量越多，擴增的PCR多態(tài)性豐富；但是，引物較短，也會引起模板互補配對穩(wěn)定性低的問題。本發(fā)明引物針對植物品種鑒定的特點，采用11個堿基。在引物篩選過程中，選擇擴增性強、穩(wěn)定性高、多態(tài)性好的隨機引物，滿足用于分析基因組多態(tài)性的引物要求。所述步驟O)中構(gòu)建圖譜關(guān)系，根據(jù)引物擴增出的譜帶，單獨具有多態(tài)性譜帶的品種被區(qū)別出來，其余品種根據(jù)譜帶表現(xiàn)進行分組，再通過其他引物區(qū)別、分組，直到所有品種被鑒別。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)不同的是未采用“0-1”矩陣構(gòu)建指紋圖譜并進行聚類分析， 通過對比譜帶進行篩選，建立直觀的鑒別圖譜。圖譜中的各葡萄品種通過引物擴增后的譜帶表現(xiàn)進行區(qū)別或分組，建立樹形圖，標明相應引物和譜帶。本發(fā)明采用7個隨機引物即可區(qū)別28個葡萄品種，這28個品種包括‘高妻’、‘京亞’、‘黑元帥’、‘紅富士’、‘巨玫瑰’、‘高墨’、‘龍寶’、‘夕陽紅’、‘先鋒’、‘黑瑰香’、‘紅伊豆’、
‘密紅’、‘紅瑞寶’、‘京超’、‘無核’、‘伊豆錦’ 汁’、‘矢富羅莎’、‘藤稔’、‘紅地球’、‘巨峰’
機引物及對應退火溫度如下
‘無核早紅’、‘美人指’、‘信濃樂’、‘翠峰’、‘蜜
‘綠寶石無核’、‘黑奧林’、‘黃意大利’，所述隨
S1+C
S10+A
S10+T
S10+G
S42+G
S48+T
5’ -GTTTCGCTCCC-3， 45.1°C 5’ -CTGCTGGGACA-3’ 43.6 °C 5’ -CTGCTGGGACT-3’ 39.3 °C 5’ -CTGCTGGGACG-3’ 42.1°C 5’ -GGACCCAACCG-3， 45.1°C 5，-GTGTGCCCCAT-3，446 °C ； 5，-GTTTCGCTCCA-3’ 45. 1°C。Sl+A所述步驟O)中的PCR擴增為30 μ 1的反應體系，包括IOXPCRBuffer 3μ 1, 2. 5mmol/LdNTPs 2· 4μ l，25mmol/LMgCl2l. 8μ 1，1. ZSOTaq 酶，隨機引物 IOpmol/ μ 11. 2 μ 1，模板 DNA 40 50ng，加入 ddH20 補齊至 30 μ 1。所述步驟O)中PCR擴增反應95°C預變性:3min，94°C變性30s，復性lmin，72°C延伸2min，42個循環(huán)，72°C延伸lOmin。于4°C保存，在印endorf擴增以上進行擴增，擴增產(chǎn)物在質(zhì)量比1. 3%瓊脂糖凝膠中電泳30 60min，溴化乙錠染色，紫外投射儀觀察拍照得到擴增譜帶。其中，模板DNA提取自未知葡萄品種，稀釋至30 50ng/y 1。有益效果本發(fā)明的一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法操作方便，快速準確，7次PCR就能夠?qū)⒂^個葡萄品種在分子水平上區(qū)分開，并在一定程度上體現(xiàn)了利用11 個堿基引物進行RAPD分子標記在植物品種鑒定的實用性的，所得的品種鑒定圖比聚類樹更具直觀性，即根據(jù)品種鑒定圖就可以找出能區(qū)分任意兩個品種的引物，該方法可以實現(xiàn)苗木的早期鑒定，在其他物種上也具有廣泛的通用性。


圖1是本發(fā)明11個隨機引物鑒別區(qū)分觀個葡萄品種的圖譜關(guān)系示意圖；圖2是利用引物S42+G區(qū)別鑒定‘高妻’、‘蜜汁’、‘無核早紅’的RAPD擴增產(chǎn)物電泳圖；圖3是利用引物S58+T區(qū)別鑒定‘高妻，、‘巨玫瑰’、‘翠峰，的RAPD擴增產(chǎn)物電泳圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。一、葡萄品種材料選取公知公用葡萄品種28個，品種名稱詳見表1。表128個葡萄品種及對應編號
權(quán)利要求
1.一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，其特征在于包括如下步驟(1)針對葡萄的基因序列設計RAPD隨機引物，篩選得到穩(wěn)定性和多態(tài)性高的隨機引物，并確定退火溫度；(2)利用步驟(1)得到的隨機引物對未知葡萄品種進行PCR擴增，根據(jù)特異性譜帶構(gòu)建相應被區(qū)分品種的圖譜關(guān)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，其特征在于所述步驟(1)中的隨機引物由11個堿基組成，隨機引物篩選通過連續(xù)兩次梯度PCR選擇條帶一致的溫度作為退火溫度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，其特征在于所述步驟O)中構(gòu)建圖譜關(guān)系，根據(jù)引物擴增出的譜帶，單獨具有多態(tài)性譜帶的品種被區(qū)別出來，其余品種根據(jù)譜帶表現(xiàn)進行分組，再通過其他引物區(qū)別、分組，直到所有品種被鑒別。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，其特征在于 所述隨機引物及對應退火溫度為S1+C5，-GTTTCGCTCCC--3，45. I0CS10+A5，-CTGCTGGGACA--3，43. 6 0CS10+T5，-CTGCTGGGACT--3，39. 3 0CS10+G5，-CTGCTGGGACG--3，42. I0CS42+G5，-GGACCCAACCG--3，45. I0CS48+T5，-GTGTGCCCCAT--3，44. 6 0CS1+A5，-GTTTCGCTCCA-3，45. I0Co
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，其特征在于所述步驟O)中的PCR擴增為30μ 1的反應體系，包括10XPCR Buffer 3 μ 1,2. 5mmol/ L dNTPs2. 4μ l,25mmol/LMgCl2 1. 8 μ 1，1. ZSUiTaq 酶，隨機引物 IOpmol/μ 1 1· 2 μ 1，模板 DNA40 50ng。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，其特征在于所述步驟(2)中PCR擴增反應95°C預變性:3min，94°C變性30s，復性lmin，72°C延伸2min，42個循環(huán)，72 °C延伸IOmin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用RAPD快速區(qū)分葡萄品種的方法，屬于分子生物學分子標記領域。該方法通過設計出的11個RAPD隨機引物可完全區(qū)分28個葡萄品種，引物經(jīng)穩(wěn)定性和多態(tài)性篩選，并確定最佳退火溫度；通過對11個隨機引物進行PCR擴增，根據(jù)特異性譜帶構(gòu)建相應被區(qū)分品種的圖譜關(guān)系。該方法操作方便，快速準確，7次PCR就能夠?qū)?8個葡萄品種在分子水平上區(qū)分開，所得的品種鑒定圖比聚類樹更具直觀性，即根據(jù)品種鑒定圖就可以找出能區(qū)分任意兩個品種的引物，該方法可以實現(xiàn)苗木的早期鑒定，在其他物種上也具有廣泛的通用性。
文檔編號C12Q1/68GK102277444SQ20111027854
公開日2011年12月14日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者上官凌飛, 劉崇懷, 吳偉民, 宋長年, 房經(jīng)貴, 王晨 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學