專利名稱：高生物量和/或高葉黃素產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因小球藻及其制備方法
高生物量和/或高葉黃素產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因小球藻及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種高生物量和/或高葉黃素產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因小球藻及其制備方法。
背景技術(shù)：
小球藻是一種單細(xì)胞微藻，其含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸及類胡蘿卜素等生物活性物質(zhì)。小球藻所含的類胡蘿卜素以葉黃素為主，葉黃素具有抗氧化活性，能夠預(yù)防癌癥、心血管疾病和年齡相關(guān)黃斑變性等疾病。由于小球藻具有生長速度快、可異養(yǎng)培養(yǎng)、易于進(jìn)行規(guī)?；囵B(yǎng)和藻種改良等優(yōu)點(diǎn)，利用小球藻合成葉黃素越來越受人們的關(guān)注。
透明顫菌血紅蛋白(VHb)是一種氧結(jié)合蛋白，在限氧條件下可以促進(jìn)氧的運(yùn)輸并減少耗氧量，從而提高細(xì)胞的呼吸作用和代謝水平。目前，人們對透明顫菌血紅蛋白基因(Vgb)進(jìn)行了大量研究，該基因已經(jīng)在細(xì)菌、真菌和植物中成功表達(dá)。研究結(jié)果表明Vgb基因的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長、提高目的代謝物的產(chǎn)量和提高細(xì)胞的抗逆性。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因小球藻的方法。
本發(fā)明提供的方法，為將透明顫菌血紅蛋白編碼基因?qū)肽康男∏蛟逯?，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，所述轉(zhuǎn)基因小球藻的生物量和/或葉黃素產(chǎn)量大于所述目的小球藻；
所述透明顫菌血紅蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
上述方法中，所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第545-985位核苷酸。
上述方法中，所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因以透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒的形式導(dǎo)入目的小球藻。
所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒包括CAMV35S啟動子、透明顫菌血紅蛋白編碼基因和CYCl終止子。
所述透明顫菌血紅 蛋白編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列I。
上述方法中，所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒通過重組載體導(dǎo)入目的小球藻。
所述重組載體為將所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體中得到的載體；所述表達(dá)載體具體為PCAMBIA2301 ;在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述重組載體具體為將序列表中序列I所示的核苷酸插入PCAMBIA2301載體的Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)間得到的載體。
上述方法中，所述重組載體通過重組菌導(dǎo)入目的小球藻；所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組菌。上述宿主菌具體為農(nóng)桿菌LBA4404。
上述方法中，導(dǎo)入的方法包括如下步驟:用重組農(nóng)桿菌侵染目的小球藻的原生質(zhì)體；所述重組農(nóng)桿菌為將所述重組載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌得到的。
上述目的小球藻為小球藻ST1002CGMCC N0.6951。上述生物量為藻體冷凍干燥后的干重由上述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。小球藻ST1002已于2012年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCCN0.6951,建議的分類命名為 Chlorella vulgaris。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組載體。本發(fā)明提供的重組載體，為將透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體中得到的載體；所述表達(dá)載體具體為PCAMBIA2301。所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒包括CAMV35S啟動子、透明顫菌血紅蛋白編碼基因和CYCl終止子。 所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列I。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種重組菌。本發(fā)明提供的重組菌，為將上述的重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組菌。上述宿主菌具體為農(nóng)桿菌LBA4404。上述的轉(zhuǎn)基因小球藻、上述的重組載體或上述的重組菌在制備葉黃素中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)葉黃素的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟:I)培養(yǎng)由上述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻或上述的轉(zhuǎn)基因小球藻，收集藻液中的藻體，得到培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因小球藻；2)將所述培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因小球藻在無水乙醇中超聲破碎，再加入KOH水溶液后超聲皂化，得到溶液A ;3)將所述溶液A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到葉黃素。上述方法具體如下:I)在FC培養(yǎng)基中培養(yǎng)(具體為28°C、180r/min搖床培養(yǎng)5天)由上述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻或上述的轉(zhuǎn)基因小球藻，收集藻液中的藻體(具體為8000r/min離心收集lOmin)，得到培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因小球藻；再將培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因小球藻干燥后研磨為粉；2)將經(jīng)過上述I)處理后的培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因小球藻在無水乙醇中超聲(超聲功率210瓦，為連續(xù)超聲溫度35°C)破碎30min ;再加入20% (質(zhì)量百分含量)KOH水溶液超聲皂化(超聲功率210瓦，為連續(xù)超聲溫度35°C ) IOmin ;得到溶液A ；3)將溶液A加入二氯甲烷和蒸餾水萃取，收集二氯甲烷相，蒸發(fā)干燥二氯甲烷，即得到葉黃素。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒導(dǎo)入野生型小球藻中，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，該轉(zhuǎn)基因小球藻的生物量和野生型小球藻相比提高了 38.81%，葉黃素含量和野生型小球藻相比提高了 5.93%，葉黃素產(chǎn)量和野生型相比提高了 47.19%。


圖1為重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-vgb的構(gòu)建過程示意圖
圖2為轉(zhuǎn)vgb小球藻的表型鑒定結(jié)果
左圖為小球藻原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后涂布于篩選培養(yǎng)基有藻落長出，右圖為小球藻原生質(zhì)體未與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)涂布于篩選培養(yǎng)基沒有藻落長出
圖3為轉(zhuǎn)Vgb小球藻在篩選培養(yǎng)基中進(jìn)一步鑒定
圖4為PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)vgb小球藻中vgb基因的插入情況
圖5為PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)vgb小球藻中NPT II基因的插入情況
圖6為轉(zhuǎn)vgb小球藻和野生型小球藻的生物量示意圖
圖7為轉(zhuǎn)vgb小球藻和野生型小球藻的葉黃素含量示意圖
圖8為轉(zhuǎn)vgb小球藻和野生型小球藻的葉黃素產(chǎn)量示意圖具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料，如無特別說明，均購自常規(guī)生化試劑商店。
克隆載體pBluescript II SK+:Stratagene, Catalog Number#212205o
雙兀載體pCAMBIA2301:CAMBIA, Canberra, Australia。
質(zhì)粒pGAPZ a A:1nvitrogen, Catalog Number V205-20。
農(nóng)桿菌菌株LBA4404:1nvitrogen, Catalog Number 18313-015
酶處理液:由溶質(zhì)和溶劑組成；溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液(pH5.8)，其中溶質(zhì)及其終濃度如下:2% (質(zhì)量百分比)纖維素酶(上海生工，CLS002610)，2% (質(zhì)量百分比)蝸牛酶(上海生工,SB0870)和 0.2M KCl。
FC培養(yǎng)基:由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其終濃度如下:葡萄糖10g/L、胰蛋白胨2g/L、牛肉浸膏 lg/L、酵母浸膏 lg/L、FeSO4.7H20 2mg/L。
TYNG培養(yǎng)基:由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其終濃度如下:10g/L蛋白胨、5g/L牛肉浸膏、5g/葡萄糖、0.2g/L 的 MgSO4.7H20，其余為水；pH7.5。
頂培養(yǎng)基:由水和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)及其終濃度如下=NaCl 0.15g/L、MgSO4.7Η200.25g/L、K2HP042.28g/L、KH2PO4L 36g/L、CaCl2.H2O0.078g/L、FeSO40.0025g/L、(NH4) 2S040.53g/L、葡萄糖 1.98g/L、甘油 0.54g/L、MES (2-嗎啉乙磺酸)7.808g/L ；pH5.3。
篩選培養(yǎng)基由FC培養(yǎng)基、KC1、G418、氨芐青霉素、頭孢霉素和水組成，KCl的濃度為0.2mol/L, G418的濃度為450ug/mL，氨芐青霉素的濃度為300ug/mL，頭孢霉素的濃度為300ug/mL。
實(shí)施例1、重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-vgb的構(gòu)建
一、重組質(zhì)粒pBS-vgb的構(gòu)建
( I)透明顫菌血紅蛋白基因vgb的克隆
根據(jù)genebank公布的vgb基因序列(如序列表的序列I自5’末端第545-985位核苷酸)，設(shè)計(jì)兩端引物:
vgb-F:5，-GGAATTCATGTTAGACCAGCAAACC-3，；
vgb-R:5’-AACTGCAGTTATTCAACCGCTTGAGC-3’。
以序列表的序列I自5’末端第545-985位核苷酸為模板,vgb_F和vgb-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min，94°C變性45s，56°C退火lmin，72°C延伸Imin，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸15min。得到44Ibp的PCR產(chǎn)物，即為vgb基因(具有序列表的序列I自5’末端第545-985位核苷酸)。(2)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Pst I雙酶切上述(I)得到的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Pst I雙酶切克隆載體pBluescript II SK+，回收296 Ibp載體骨架(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBS-vgb。二、重組質(zhì)粒 pCAMBIA2301_vgb 的構(gòu)建(I)啟動子CAMV35S的獲得設(shè)計(jì)兩引物:CAMV35S-F:5’-CCCAAGCTTCATGGAGTCAAAGATTCA-3’ ；CAMV35S-R:5’ -GGAATTCAGTCCCCCGTGTTCTCT-3’。以質(zhì)粒pCAMBIA2301 為模板，CAMV35S-F 和 CAMV35S-R 為引物，PCR 擴(kuò)增，得至Ij538bpPCR產(chǎn)物，即為啟動子CAMV35S。PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸15min。`(2)用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I雙酶切(I) PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(3)用限制性內(nèi)切酶Hind III和EcoR I雙酶切上述一得到的重組質(zhì)粒pBS_vgb，回收3402bp載體骨架。(4)將步驟(2)的酶切產(chǎn)物和步驟(3)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pBS-CAMV35S-vgb。(5)終止子CYCl的獲得以質(zhì)粒pGAPZ a A為模板，CYC1-F和CYCl-R為引物，PCR擴(kuò)增得到318bpPCR產(chǎn)物，即為終止子CYCl。設(shè)計(jì)兩端引物:CYCl-F:5’-AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3’ ;CYCl-R:5’-CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3’PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸15min。(6)用限制性內(nèi)切酶Pst I和BamH I雙酶切(5)得到的PCR產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。(7)用限制性內(nèi)切酶Pst I和BamH I雙酶切(4)得到的重組質(zhì)粒pBS-CAMV35S-vgb,回收 3940bp 載體骨架。(8)將步驟(6)的酶切產(chǎn)物和步驟(7)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒PBS-CAMV35S - vgb-CYCl。(9)用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I雙酶切重組質(zhì)粒pBS_CAMV35S - vgb-CYCl，回收1309bp酶切產(chǎn)物(vgb基因表達(dá)盒CAMV35S - vgb-CYCl，核苷酸序列為序列表中的序列O(10)用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I雙酶切雙元載體pCAMBIA2301，回收11608bp載體骨架。
(11)將步驟(9)的酶切產(chǎn)物和步驟(10)的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒PCAMBIA2301-vgb。
重組質(zhì)粒pCAMBIA2301_vgb的結(jié)構(gòu)示意圖及構(gòu)建流程圖見圖1。
將重組質(zhì)粒pCAMBIA2301-vgb送去測序，結(jié)果該質(zhì)粒為將序列表中序列I所示的核苷酸插入PCAMBIA2301載體的Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)間得到的載體。
序列表中序列I為vgb基因表達(dá)盒CAMV35S - vgb_CYCl，其中，序列表中序列I自5’末端第1-538位核苷酸為啟動子CAMV35S，自5’末端第545-985位核苷酸為基因vgb，自5’末端第986-1309位核苷酸為終止子CYCl。
實(shí)施例2、轉(zhuǎn)vgb小球藻鑒定及表型分析
—、轉(zhuǎn)vgb小球藻的獲得
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)小球藻的轉(zhuǎn)化，具體如下:
( I)小球藻原生質(zhì)體的制備
小球藻ST1002已于2012年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCCN0.6951,建議的分類命名為 Chlorella vulgaris。
挑取小球藻ST1002 (CGMCC N0.6951 ;也稱為野生型小球藻)單藻落接種于FC培養(yǎng)基中，28 °C搖床培養(yǎng)至藻體長出。
以1%的接種量轉(zhuǎn)接于50mL新鮮的FC培養(yǎng)基，28°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)期。
以4000rpm的轉(zhuǎn)速4°C離心7min收集藻細(xì)胞，用遇冷的無菌水洗滌藻細(xì)胞一次后，用預(yù)處理劑(預(yù)處理劑由溶質(zhì)和溶劑組成；所述溶劑為20mM磷酸鹽緩沖液配制(pH5.8);所述溶質(zhì)及其濃度為:50mmol/L EDTA, 25mmol/L DTT)處理 30min。
4000rpm的轉(zhuǎn)速離心7min收集藻細(xì)胞，加入IOmL酶處理液，28 °C搖床消化14小時(shí)，得到小球藻原生質(zhì)體。
(2)重組質(zhì)粒PCAMBIA2301-Vgb通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株LBA4404，得到重組農(nóng)桿菌 LBA4404/pCAMBIA2301-vgb (Hind III和 BamH I 酶切，得到 1309bp 的為陽性)。
(3)挑取重組農(nóng)桿菌LBA4404/pCAMBIA2301-Vgb至TYNG培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)至對數(shù)期。離心收集菌體，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基IM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整農(nóng)桿菌濃度為0D_=0.6-0.8加入終濃度為150umol/L的乙酰丁香酮，25°C預(yù)誘導(dǎo)5小時(shí)，收集菌液。
(4)離心收集步驟(I)的原生質(zhì)體，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基頂培養(yǎng)基重懸后，加入步驟(3)得到的菌液中，25°C侵染24小時(shí)，得到藻體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)物。
(5)離心收集步驟(4)中的藻體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)物，涂布于固體的篩選培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)7天，有藻落長出，得到轉(zhuǎn)vgb小球藻。
同時(shí)，以未與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的小球藻原生質(zhì)體做陰性對照，將其涂布于篩選培養(yǎng)基。
與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的藻體涂布于篩選培養(yǎng)基后有藻落(即轉(zhuǎn)vgb小球藻)長出(圖2A),而未與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)的藻體涂布于篩選培養(yǎng)基后沒有藻落長出(圖2B)。
采用同樣的方法將空載體pCAMBIA2301轉(zhuǎn)入野生型小球藻中，得到轉(zhuǎn)空載體小球藻。
二、轉(zhuǎn)vgb小球藻鑒定及表型分析1、二次篩選和表型鑒定將獲得的轉(zhuǎn)Vgb小球藻培養(yǎng)后在篩選培養(yǎng)基中劃線，同時(shí)以野生型小球藻和轉(zhuǎn)空載體小球藻做陰性對照。結(jié)果如圖3所示，Vl至V7為轉(zhuǎn)vgb小球藻藻株，WT為野生型小球藻藻株；可以看出，轉(zhuǎn)vgb小球藻能夠在篩選培養(yǎng)基上生長，而野生型小球藻不能生長。轉(zhuǎn)空載體小球藻與野生型小球藻的結(jié)果無顯著差異。2、轉(zhuǎn)vgb小球藻分子鑒定PCR驗(yàn)證外源基因在轉(zhuǎn)vgb小球藻基因組中的整合情況，具體如下:提取轉(zhuǎn)vgb小球藻和野生型小球藻的基因組DNA，以基因組DNA為模板，分別用引物 vgb-F/vgb-R 和 NPT I1-F/NPT I1-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。vgb-F:5’-GGAATTCATGTTAGACCAGCAAACC-3’ ；vgb-R: 5’-AACTGCAGTTATTCAACCGCTTGAGC-3’。NPT I1-F:5，-TCACTGAAGCGGGAAGGGACT-3，；NPT I1-R:5’-GCGGCGATACCGTAAAGCAC-3’。

PCR 反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 45s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin，運(yùn)行32個(gè)循環(huán)后，72 °C延伸15min。取5uL PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4 (vgb基因片段PCR鑒定)和圖5 (NPT II基因片段PCR鑒定)所示，其中，WT為野生型小球藻藻株、PC為陽性質(zhì)粒pCAMBIA2301-vgb、Vl_V6為轉(zhuǎn)vgb小球藻藻株；可以看出，轉(zhuǎn)vgb小球藻的基因組能夠擴(kuò)增出約441bp vgb基因片段，而野生型小球藻的基因組中不能擴(kuò)增出vgb基因片段；轉(zhuǎn)vgb小球藻的基因組能夠擴(kuò)增出493bpNPT II基因片段，而野生型小球藻的基因組中不能擴(kuò)增出493bpNPT II基因片段。結(jié)果表明，外源基因已經(jīng)插入小球藻基因組中，進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)vgb小球藻構(gòu)建成功。轉(zhuǎn)空載體小球藻采用上述方法鑒定，基因組中不能擴(kuò)增出Vgb基因片段，但能夠擴(kuò)增出493bpNPT II基因片段。3、轉(zhuǎn)vgb小球藻生物量的測定將V3、V4、V6的轉(zhuǎn)vgb小球藻、轉(zhuǎn)空載體小球藻和野生型小球藻以5%(體積百分含量)的量接種于含有IOOmL FC培養(yǎng)基的250mL三角燒瓶中，28°C、180r/min搖床培養(yǎng)5天，得到藻液。將藻液8000r/min離心IOmin收集藻體，除去上清液，藻體冷凍干燥后，稱量干重即為生物量。結(jié)果如圖6所示，轉(zhuǎn)vgb小球藻V3、V4、V6的生物量和野生型(2.36g/L)相比顯著提高，分別為 2.73g/L (藻液)、3.28g/L 和 3.26g/L。轉(zhuǎn)空載體小球藻與野生型小球藻的結(jié)果無顯著差異。三、轉(zhuǎn)vgb小球藻產(chǎn)生葉黃素含量的測定將上述二的3培養(yǎng)后收集的藻體:轉(zhuǎn)vgb小球藻V4、轉(zhuǎn)空載體小球藻和野生型小球藻研磨為粉狀，準(zhǔn)確稱取0.05g轉(zhuǎn)vgb小球藻粉、轉(zhuǎn)空載體小球藻粉和野生型小球藻藻粉，加入2.5mL無水乙醇超聲破碎30min (超聲功率210瓦，為連續(xù)超聲溫度35°C)后，再加1.5mL20%K0H (質(zhì)量百分含量)超聲皂化(超聲功率210瓦，為連續(xù)超聲溫度35°C)IOmin ;得到溶液A ;用二氯甲燒、蒸懼水各20mL萃取，5000r/min離心5min,棄去上層水相，收集二氯甲烷相，40°C低壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到提取物。
提取物用色譜純甲醇定容至5mL ;稀釋5倍，過0.22um濾膜后進(jìn)行HPLC檢測。HPLC檢測的色譜條件為:流動相為甲醇和水(體積比為95:5)，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量10uL，檢測波長為444nm。
每個(gè)株系的小球藻取3株，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
標(biāo)準(zhǔn)品為葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司，X6250)，其保留時(shí)間為9.2min。
轉(zhuǎn)vgb小球藻中保留時(shí)間為9.2min的提取物為葉黃素。
葉黃素含量的標(biāo)曲函數(shù)為y=184018x-8422.2 (R2=0.9824)，其中y為峰面積，X為葉黃素濃度，R2為擬合優(yōu)度。
葉黃素含量結(jié)果如圖7所示,轉(zhuǎn)vgb小球藻V4的葉黃素含量為0.89mg/g (g為藻粉)，和野生型0.84mg/g相比略有提高，提高了 5.93%。
進(jìn)一步分析每升藻液(野生型和轉(zhuǎn)vgb小球藻每升藻液的干粉量不同，具體為如圖6所示生物量；藻液的獲取方式在實(shí)施例2的二的3。)中葉黃素的產(chǎn)量，結(jié)果如圖8所示，轉(zhuǎn)vgb小球藻V4的葉黃素產(chǎn)量為2.91mg/L，和野生型1.98mg/L相比提高了 47.19%。
轉(zhuǎn)空載體小 球藻與野生型小球藻的結(jié)果無顯著差異。
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因小球藻的方法，為將透明顫菌血紅蛋白編碼基因?qū)肽康男∏蛟逯?，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，所述轉(zhuǎn)基因小球藻的生物量和/或葉黃素產(chǎn)量大于所述目的小球藻； 所述透明顫菌血紅蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在在于:所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第545-985位核苷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在在于:所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因以透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒的形式導(dǎo)入目的小球藻； 所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒具體包括CAMV35S啟動子、透明顫菌血紅蛋白編碼基因和CYCl終止子； 所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在在于: 所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒通過重組載體導(dǎo)入目的小球藻； 所述重組載體為將所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體中得到的載體；所述表達(dá)載體具體為PCAMBIA2301。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在在于: 所述重組載體通過重組菌導(dǎo)入目的小球藻；所述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組菌。
6.由權(quán)利要求1-5所述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻。
7.一種重組載體，為將透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒插入表達(dá)載體中得到的載體；所述表達(dá)載體具體為PCAMBIA2301 ； 所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒包括CAMV35S啟動子、透明顫菌血紅蛋白編碼基因和CYCl終止子； 所述透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒的核苷酸序列具體為序列表中的序列I。
8.一種重組菌，為將權(quán)利要求7所述的重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組菌。
9.權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因小球藻、權(quán)利要求7所述的重組載體或權(quán)利要求8所述的重組菌在制備葉黃素中的應(yīng)用。
10.一種生產(chǎn)葉黃素的方法，包括如下步驟: 1)培養(yǎng)由權(quán)利要求1-5所述方法得到的轉(zhuǎn)基因小球藻或權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因小球藻，收集藻液中的藻體，得到培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因小球藻； 2)將所述培養(yǎng)后轉(zhuǎn)基因小球藻在無水乙醇中超聲破碎，再加入KOH水溶液后超聲皂化，得到溶液A ; 3)將所述溶液A用二氯甲烷萃取，收集二氯甲烷相，即得到葉黃素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高生物量和/或高葉黃素產(chǎn)量轉(zhuǎn)基因小球藻及其制備方法。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因小球藻的方法，為將透明顫菌血紅蛋白編碼基因?qū)肽康男∏蛟逯?，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，所述轉(zhuǎn)基因小球藻的生物量和/或葉黃素產(chǎn)量大于所述目的小球藻；所述透明顫菌血紅蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將透明顫菌血紅蛋白編碼基因表達(dá)盒導(dǎo)入野生型小球藻中，得到轉(zhuǎn)基因小球藻，該轉(zhuǎn)基因小球藻的生物量與野生型相比顯著提高，提高了38.81%；葉黃素含量和野生型相比略有提高，提高了5.93%；葉黃素產(chǎn)量和野生型相比提高了47.19%，為高生物量和葉黃素產(chǎn)量小球藻。
文檔編號C12N1/13GK103194459SQ20131012049
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月8日
發(fā)明者林祥志, 馬瑞娟 申請人:國家海洋局第三海洋研究所