用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，首先用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基試管斜面培養(yǎng)霉菌孢子，然后用無菌生理鹽水將孢子洗下，再將孢子懸液稀釋至一定濃度后接種于馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所得到的細(xì)小菌粒即為霉菌液體菌種。本發(fā)明方法簡單，所得霉菌液體菌種大小均勻、性狀一致，接種時能夠保證各搖瓶接種量的一致性，大大增強了搖瓶發(fā)酵實驗的可比性及可信度。
【專利說明】用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種霉菌液體菌種的制備方法，尤其適應(yīng)于制備用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種。
【背景技術(shù)】
[0002]霉菌是形成分枝菌絲的真菌的統(tǒng)稱。霉菌與人類生產(chǎn)和生活關(guān)系極其密切，除了可使人、畜、農(nóng)作物、工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品患病和霉變外，其分泌的酶、藥物、色素等化合物廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、紡織、食品、醫(yī)藥、皮革等行業(yè)中。為了獲得新的霉菌菌株或提高已有霉菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，常常需要進行菌株篩選、誘變或發(fā)酵條件優(yōu)化等實驗。在這些實驗操作過程中，均涉及到大量的對比實驗用于比較不同菌株或不同發(fā)酵條件下目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，以便確定最佳菌株或最佳發(fā)酵條件。
[0003]為了真實的反應(yīng)不同菌株間或不同發(fā)酵條件對目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的影響，在進行發(fā)酵比較實驗時，必須采取措施最大限度的降低實驗誤差，其中，降低對比實驗間接種量、減少菌種性狀的差異就是簡便有效的措施。對于霉菌來說，一般通過兩種方式進行接種，一是接種菌絲球，該種方法往往無法進行準(zhǔn)確的定量從而引起較大的實驗誤差；二是接種孢子，該方法雖能準(zhǔn)確定量，但由于孢子生成的時間存在差異導(dǎo)致孢子性狀不同，也會給實驗帶來一定的誤差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目 的是:提供一種用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，該方法制備的霉菌種子能最大限度的保證各實驗搖瓶的接種量和菌體性狀的一致。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是該用于搖瓶對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法包括以下步驟:
(1)將一小塊霉菌菌苔接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基試管斜面上，于25-30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)96-192h,直至固體斜面長滿孢子；
(2)將霉菌孢子用生理鹽水洗下，稀釋至一定濃度后，用5mL移液器將孢子懸液按一定比例接種于裝有IOOmL馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基和少量玻璃珠的500mL三角瓶中，250C -30°CU00-120rmp轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48_72h，直至培養(yǎng)液中長出大量的均勻一致的小菌粒，所得到的細(xì)小菌粒即為霉菌液體菌種。
[0006]其中，移取霉菌液體菌種的操作是:用5mL移液器按3_5%的體積比將小菌粒接種于相應(yīng)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C -37°C、120-150rmp轉(zhuǎn)速下進行發(fā)酵，得所需要的霉菌代謝產(chǎn)物。
[0007]其中，步驟(1)中，所用試管規(guī)格為20mmX200mm。
[0008]其中，步驟(1)中，馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3左右的小塊，加蒸餾水1000mL煮沸30min后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g、瓊脂粉15g，加熱至瓊脂溶化后，用蒸餾水補足至1000mL,然后分裝于試管，用硅膠塞塞緊，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋中121°C滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至80°C時，擺成試管斜面至冷卻凝固。
[0009]其中，步驟(2)中，霉菌孢子稀釋后的濃度為:在620nm波長下吸光度為0.5-0.7，孢子懸液的接種比例為馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基體積的3-5%。
[0010]其中，步驟(2)中，馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3的小塊，加蒸餾水1000mL煮沸30分鐘后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g溶解，用蒸餾水補足至lOOOmL，500mL三角瓶中分裝IOOmL,再加入少量玻璃珠，最后用6層紗布包住瓶口，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌20min。
[0011]其中，5mL移液器是指:剪掉移液器吸頭尖端后，吸頭的尖端孔徑為2-3_。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點是:所得霉菌小菌粒呈顆粒狀，其菌球較小，大小及菌體性狀一致，在將其接種至發(fā)酵培養(yǎng)基時能夠保證各實驗搖瓶接入量和菌體性狀一致，從而提高了實驗的可比性，增強了實驗數(shù)據(jù)的可信度，最終提高了實驗效率。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)解決方案，這些實施例不能理解為是對技術(shù)方案的限制。
[0014]實施例1:依以下步驟制備米曲霉液體菌種用以比較淀粉酶的產(chǎn)生量
(O馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3左右的小塊，加蒸餾水1000mL煮沸30min后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g、瓊脂粉15g，加熱至瓊脂熔化后，用蒸餾水補足至1000mL,分裝于試管(20mmX 200mm)至三分之一體積處，用硅膠塞塞緊瓶口，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋中121°C滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至80°C時擺成試管斜面至冷卻凝固；
(2)將霉菌接種于試管固體斜面:取試管斜面保藏的米曲霉菌種，在超凈工作臺上用滅菌接種鏟取小塊菌苔，接種于步驟(1)的新鮮試管斜面上，塞好硅膠塞后置于25°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)192h,直至培養(yǎng)基表面長滿大量孢子為止；
(3)馬鈴薯鹿糖液體培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3的小塊,加蒸懼水1000mL煮沸30分鐘后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g溶解，用蒸餾水補足至lOOOmL, 500mL三角瓶中分裝IOOmL,再加入少量玻璃珠后用6層紗布包住瓶口，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌20min ；
(4)將霉菌孢子接種于馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中:取步驟(2)的新鮮培養(yǎng)的固體試管斜面種子，在超凈工作臺上，用5mL滅菌移液器吸取5mL滅菌生理鹽水加入到試管斜面中，再用滅菌刮鏟輕刮試管斜面，直至將所有霉菌孢子刮下，輕輕震蕩試管，使孢子呈均勻分布狀態(tài)，然后在試管中繼續(xù)加入滅菌生理鹽水直至孢子懸液在620nm波長下的吸光度為0.5，用滅菌槍頭吸取制備好的孢子懸濁液加入馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，每個含IOOmL培養(yǎng)基的三角瓶中接入3mL孢子懸液； (5)菌粒培養(yǎng):將接種后的三角瓶置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)速為120rmp，培養(yǎng)溫度為30°C，直至三角瓶中長出均勻的小米粒大小的菌粒；
(6)米曲霉液體菌種培養(yǎng):取5mL移液器吸頭，用剪刀剪掉吸頭的尖頭少許，使吸頭出口直徑為2mm，高壓滅菌鍋滅菌備用；將培養(yǎng)好的菌粒用處理過的移液器吸頭吸取一定體積后快速接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3%，用8層紗布包扎后置于恒溫培養(yǎng)箱中25 °C、150rpm條件下培養(yǎng)，用以比較淀粉酶的產(chǎn)生量。
[0015]實施例2:依以下步驟制備青霉菌液體菌種用以比較青霉素的產(chǎn)生量
(O馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3左右的小塊，加蒸餾水1000mL煮沸30min后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g、瓊脂粉15g，加熱至瓊脂熔化后，用蒸餾水補足至1000mL,分裝于試管(20mmX 200mm)至三分之一體積處，用硅膠塞塞緊瓶口，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋中121°C滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至80°C時擺成試管斜面至冷卻凝固；
(2)將霉菌接種于試管固體斜面:取試管斜面保藏的青霉菌種，在超凈工作臺上用滅菌接種鏟取小塊菌苔，接種于步驟(1)的新鮮試管斜面上，塞好硅膠塞后置于27.5°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)144h,直至培養(yǎng)基表面長滿大量孢子為止；
(3)馬鈴薯鹿糖液體培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3的小塊,加蒸懼水1000mL煮沸30分鐘后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g溶解，用蒸餾水補足至lOOOmL, 500mL三角瓶中分裝IOOmL,再加入少量玻璃珠后用6層紗布包住瓶口，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌20min ；
(4)將霉菌孢子接種于 馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中:取步驟(2)的新鮮培養(yǎng)的固體試管斜面種子，在超凈工作臺上，用5mL滅菌移液器吸取5mL滅菌生理鹽水加入到試管斜面中，再用滅菌刮鏟輕刮試管斜面，直至將所有霉菌孢子刮下，輕輕震蕩試管，使孢子呈均勻分布狀態(tài)，然后在試管中繼續(xù)加入滅菌生理鹽水直至孢子懸液在620nm波長下的吸光度為0.6，用滅菌槍頭吸取制備好的孢子懸濁液加入馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，每個含IOOmL培養(yǎng)基的三角瓶中接入4mL孢子懸液；
(5)菌粒培養(yǎng):將接種后的三角瓶置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)60h,轉(zhuǎn)速為IlOrmp,培養(yǎng)溫度為27.5°C，直至三角瓶中長出均勻的小米粒大小的菌粒；
(6)青霉菌液體菌種培養(yǎng):取5mL移液器吸頭，用剪刀剪掉吸頭的尖頭少許，使吸頭出口直徑為2.5mm,高壓滅菌鍋滅菌備用；將培養(yǎng)好的菌粒用處理過的移液器吸頭吸取一定體積后快速接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的4%，用8層紗布包扎后置于恒溫培養(yǎng)箱中31 °C、135rpm條件下培養(yǎng)，用以比較青霉素的產(chǎn)生量。
[0016]實施例3:依以下步驟制備木霉菌液體菌種用以比較纖維素酶的產(chǎn)生量
(O馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3左右的小塊，加蒸餾水1000mL煮沸30min后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g、瓊脂粉15g，加熱至瓊脂熔化后，用蒸餾水補足至1000mL,分裝于試管(20mmX 200mm)至三分之一體積處，用硅膠塞塞緊瓶口，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋中121°C滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至80°C時擺成試管斜面至冷卻凝固；
(2)將木霉菌接種于試管固體斜面:取試管斜面保藏的木霉菌菌種，在超凈工作臺上用滅菌接種鏟取小塊菌苔，接種于步驟(1)的新鮮試管斜面上，塞好硅膠塞后置于30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h,直至培養(yǎng)基表面長滿大量孢子為止；
(3)馬鈴薯鹿糖液體培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3的小塊,加蒸懼水1000mL煮沸30分鐘后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g溶解，用蒸餾水補足至lOOOmL, 500mL三角瓶中分裝IOOmL,再加入少量玻璃珠后用6層紗布包住瓶口，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋內(nèi)121°C滅菌20min ；
(4)將木霉菌孢子接種于馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中:取步驟(2)的新鮮培養(yǎng)的固體試管斜面種子，在超凈工作臺上，用5mL滅菌移液器吸取5mL滅菌生理鹽水加入到試管斜面中，再用滅菌刮鏟輕刮試管斜面，直至將所有霉菌孢子刮下，輕輕震蕩試管，使孢子呈均勻分布狀態(tài)，然后在試管中繼續(xù)加入滅菌生理鹽水直至孢子懸液在620nm波長下的吸光度為
0.7，用滅菌槍頭吸取制備好的孢子懸濁液加入馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中，每個含IOOmL培養(yǎng)基的三角瓶中接入5mL孢子懸液；
(5)菌粒培養(yǎng):將接種后的三角瓶置于恒溫振蕩器中培養(yǎng)72h，轉(zhuǎn)速為lOOrmp，培養(yǎng)溫度為25°C，直至三角瓶中長出均勻的小米粒大小的菌粒； (6)木霉菌液體菌種培養(yǎng):取5mL移液器吸頭，用剪刀剪掉吸頭的尖頭少許，使吸頭出口直徑為3mm，高壓滅菌鍋滅菌備用；將培養(yǎng)好的菌粒用處理過的移液器吸頭吸取一定體積后快速接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%，用8層紗布包扎后置于恒溫培養(yǎng)箱中37°C、120rpm條件下培養(yǎng)，用以比較纖維素酶的產(chǎn)生量。
【權(quán)利要求】
1.用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，其特征在于該方法包括如下步驟: (1)將一小塊霉菌菌苔接種于馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基試管斜面上，于25-30°C培養(yǎng)96-192h，直至固體斜面長滿孢子； (2)將霉菌孢子用生理鹽水洗下，稀釋至一定濃度后，用5mL移液器將孢子懸液按一定比例接種于裝有IOOmL馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基和少量玻璃珠的500mL三角瓶中，250C -30°CU00-120rmp轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48_72h，直至培養(yǎng)液中長出大量的均勻一致的小菌粒，所得到的細(xì)小菌粒即為霉菌液體菌種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，其特征在于移取霉菌液體菌種的操作是:用5mL移液器按3-5%的體積比將小菌粒接種于相應(yīng)的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C -37°C、120-150rmp轉(zhuǎn)速下進行發(fā)酵，得所需要的霉菌代謝產(chǎn)物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，所用試管規(guī)格為20mmX200mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，其特征在于:步驟(1)中，馬鈴薯蔗糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基配制:去皮土豆200g切成Icm3左右小塊，加蒸餾水1000mL煮沸30min，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g、瓊脂粉15g，加熱至瓊脂熔化后，用蒸餾水補足至1000mL,分裝于試管，并用硅膠塞塞緊，牛皮紙包扎后于高壓滅菌鍋中121°C滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至80°C時，擺成試管斜面至冷卻凝固。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，霉菌孢子稀釋后的濃度為:在620nm波長下吸光度為0.5-0.7。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，孢子懸液的接種比例為馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基體積的3-5%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，其特征在于:步驟(2)中，馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基配制:將去皮土豆200g切成Icm3的小塊，加蒸餾水1000mL煮沸30分鐘后，用六層紗布濾去馬鈴薯塊，在濾液中加蔗糖20g溶解，用蒸餾水補足至lOOOmL，500mL三角瓶中分裝IOOmL,再加入少量玻璃珠用6層紗布包住瓶口，牛皮紙包扎后于聞壓滅囷鍋內(nèi)121 C滅囷20min。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述用于搖瓶發(fā)酵對比實驗的霉菌液體菌種的制備方法，其特征在于:5mL移液器是指:剪掉移液器吸頭尖端后，吸頭的尖端孔徑為2-3_。
【文檔編號】C12N1/14GK103966106SQ201410192861
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月9日
【發(fā)明者】李明華, 孟秀梅, 陸正清, 張貴英 申請人:江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院