專利名稱：來源于嗜線蟲致病桿菌細菌和發(fā)光光桿狀菌細菌的毒素基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種由致病桿菌屬(Xenorhabdus)和光桿狀菌屬(Photorhabdus)細菌產(chǎn)生的對昆蟲具有特異性的新型蛋白毒素的鑒定和分離。此外，本發(fā)明還涉及將編碼此類毒素的基因引入例如昆蟲特異性病毒(包括昆蟲痘病毒和核型多角體病毒)、細菌(包括薄壁菌門(Gracilicutes)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)和疵壁菌門(Mendosicutes))、酵母以及植物內(nèi)以用于蟲害控制的技術(shù)。
背景技術(shù)：
已知Steinernematidae科及Heterorhabditidae科的昆蟲致病線蟲在共生關(guān)系上分別與致病桿菌屬和光桿狀菌屬的細菌相關(guān)。據(jù)觀察，這些細菌在沒有其線蟲共生伙伴幫助的情況下就具有殺死多種不同昆蟲的能力。本發(fā)明人分離了編碼源自嗜線蟲致病桿菌菌株A24和發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1的一種新型殺蟲毒素蛋白的多核苷酸分子。
發(fā)明內(nèi)容
第一方面，本發(fā)明提供一種分離的編碼殺蟲毒素的多核苷酸分子，所述的多核苷酸分子包含一基本與下列之一相符合的核苷酸序列(i)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，(ii)如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列，以及(iii)編碼具殺蟲活性毒素片段的(i)或(ii)的一部分的核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述的多核苷酸分子包括基本上與(i)或(ii)相符的核苷酸序列。
第二方面，本發(fā)明提供一種分離的編碼殺蟲毒素的多核苷酸分子，所述的多核苷酸分子包含一與SEQ ID NO2所示核苷酸序列的序列同一性至少達85％，更優(yōu)選的則至少達95％的核苷酸序列。
第三方面，本發(fā)明以基本純凈的形式提供一種殺蟲毒素，該殺蟲毒素包含一與下列之一的序列同一性至少達70％的氨基酸序列
(i)如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，(ii)如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，(iii)(i)或(ii)的具殺蟲活性毒素片段的氨基酸序列。
優(yōu)選地，所述的殺蟲毒素包含一與(i)或(ii)的序列同一性至少達85％，更優(yōu)選的則至少達95％的氨基酸序列。最優(yōu)選地，該殺蟲毒素包含一基本上與(i)或(ii)所定義的氨基酸序列相符的氨基酸序列。
第四方面，本發(fā)明提供一種重組微生物，該重組微生物的特征在于它由本發(fā)明第一或第二方面所述的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化并表達該多核苷酸分子。
可有效地由本發(fā)明第一或第二方面所提到的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化的微生物包括細菌，如埃希氏桿菌屬、薄壁菌門、厚壁菌門、軟壁菌門及疵壁菌門；原生動物以及酵母。該微生物可通過常規(guī)方法由包含編碼毒素的多核苷酸分子的表達載體轉(zhuǎn)化，該多核苷酸分子通過操作與一種適當?shù)恼T導(dǎo)型或組成型的啟動子序列連接起來。
第五方面，本發(fā)明提供一種生產(chǎn)殺蟲毒素的方法，所述的方法包括(i)在適合于該編碼毒素的多核苷酸分子表達的條件下培養(yǎng)根據(jù)第四方面所述的微生物，以及(ii)可任選地回收表達的殺蟲毒素第六方面，本發(fā)明提供一種昆蟲特異性重組病毒，該昆蟲特異性重組病毒的特征在于其基因組的非必需區(qū)內(nèi)包含本發(fā)明第一或第二方面所述并經(jīng)操作與一種適當?shù)恼T導(dǎo)型或組成型的啟動子序列連接起來的多核苷酸分子。
優(yōu)選地，第六方面所述昆蟲特異性重組病毒選自昆蟲痘病毒和核型多角體病毒。該重組病毒可通過諸如同源重組這樣的常規(guī)方法加以生產(chǎn)。
第七方面，本發(fā)明提供一種殺死有害昆蟲的方法，所述的方法包括將有效劑量的第四方面所述重組微生物和/或第六方面所述重組病毒以可任選的與一種可接受的農(nóng)用載體混合的方式應(yīng)用到所述昆蟲大批滋生的地區(qū)。
第八方面，本發(fā)明提供一種由本發(fā)明第一或第二方面所述的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化并能夠表達該多核苷酸分子的植物。
第八方面所述的植物可以是易受有害昆蟲攝食而造成損害的任何具有農(nóng)業(yè)、樹藝、園藝或裝飾價值的植物。但優(yōu)選地，該植物是選自具有農(nóng)業(yè)價值的植物，如谷類(例如小麥和大麥)、蔬菜植物(例如番茄和馬鈴薯)、果樹(例如柑橘類植物和蘋果樹)。其它優(yōu)選的植物包括煙草和棉花。
該植物可通過包括農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化和電穿孔在內(nèi)的常規(guī)方法加以轉(zhuǎn)化。優(yōu)選地，編碼毒素的多核苷酸分子可經(jīng)過操作與一種適當?shù)恼T導(dǎo)型或組成型的啟動子序列連接起來。特別優(yōu)選的啟動子序列包括花椰菜花葉病毒(CaMV 35 S)啟動子元件和來自于sub-clover stunt virus(SCSV)的啟動子元件。
文中涉及核苷酸序列的地方使用“基本相符”這一術(shù)語是想包含那些由于簡并性而不會造成編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生改變的核苷酸序列的小變化。此外，使用這一術(shù)語還想包含那些在特殊體系中需用來增加表達但這些變化不會導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)生物活性降低的序列上的其它小變化。
文中涉及氨基酸序列的地方使用“基本相符”這一術(shù)語是想包含那些不會導(dǎo)致殺蟲毒素生物活性降低的氨基酸序列上的小變化。這些變化可能包括保守的氨基酸替代。設(shè)想的替代有-G、A、V、I、L、M；D、E；N、Q；S、T；K、R、H；F、Y、W、H；以及P、堿性氨基酸鈉鹽。
文中使用“具殺蟲活性的毒素片段”這一術(shù)語是想包含那些由例如下述的蠟螟(Galleria mellonella)生物測定方法所決定的保持殺蟲活性的殺蟲毒素片段。
整個說明書中使用“包括”、“包含”等術(shù)語是想指明已確定的某個步驟、組分或特征或成組的步驟、組分或特征的內(nèi)涵中是包含或是不包含另外的某個步驟、組分或特征或成組的步驟、組分或特征的內(nèi)涵。
下文將以引用下述非限定性實施例和附圖的方法對本發(fā)明作更進一步的說明。
附圖簡述附
圖1toxb4克隆的嗜線蟲致病桿菌DNA插入片段的蛋白編碼(有義)鏈核苷酸序列。陰影框顯示位于核苷酸位點17-19的翻譯起始密碼子(ATG)和位于核苷酸位點1121-1123的翻譯終止密碼子(TAA)。用于測序引物設(shè)計的寡聚核苷酸序列位置用箭頭和引物名稱(TOX F1、TOXR3等)標出。位于序列上方指向為從左到右的箭頭表示有義鏈引物，位于序列下方指向為從右到左的箭頭表示反義鏈引物。
附圖2推導(dǎo)出的來源于嗜線蟲致病桿菌菌株A24、含有368個氨基酸的toxb4蛋白序列，該序列由開始于toxb4基因序列(附圖1)第17位核苷酸位點、結(jié)束于第1120位核苷酸位點的長可讀框概念翻譯衍生而出。
附圖3發(fā)光光桿狀菌V16/1毒素基因克隆的限制圖，圖中顯示出推定的毒素蛋白編碼區(qū)的位置(純黑框)及轉(zhuǎn)錄方向(箭頭)。RI＝EcoRI、RV＝EcoR V、H＝Hind III、S＝Sma I。由克隆產(chǎn)生的包含選定限制片段的毒素產(chǎn)物顯示于限制圖上方。(+，具毒素活性；-，無毒素活性)。
附圖4發(fā)光光桿狀菌III/Sma I DNA片段的蛋白編碼(有義)鏈核苷酸序列。陰影框顯示翻譯起始密碼子(ATG)和翻譯終止密碼子(TAG)。與附圖1簡述所述相同，用于測序引物設(shè)計的寡聚核苷酸序列位置用箭頭和引物名稱標出。圖中對用于亞克隆及鑒定保持毒素活性必需序列的限制酶切位點加以下劃線并標記。
附圖5推導(dǎo)出的來源于發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1、含有335個氨基酸的PlV16tox1蛋白序列，該序列由開始于Hind III/Sma I限制酶切片段(附圖4)第172位核苷酸位點、結(jié)束于第1179位核苷酸位點的長可讀框概念翻譯衍生而出。
附圖6使用GCG電腦軟件包的Gap程序?qū)惺染€蟲致病桿菌菌株A24toxb4基因及含有發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1 PlV16tox1基因的蛋白可讀框核苷酸序列進行對比。上行為嗜線蟲致病桿菌序列，下行為P.luminescens序列。
附圖7使用GCG電腦軟件包的Gap程序?qū)幋a嗜線蟲致病桿菌菌株A24 toxb4蛋白及編碼發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1 PlV16tox1蛋白的由擴展可讀框推導(dǎo)出的蛋白序列進行對比。上行為嗜線蟲致病桿菌序列，下行為發(fā)光光桿狀菌序列。
附圖8提供一種利用IMPACTTM體系表達和分離嗜線蟲致病桿菌A24toxb4蛋白及發(fā)光光桿狀菌V16/1 PlV16tox1蛋白的流程圖。圖中用純黑條代表毒素蛋白并指明第一個氨基酸(Met)和最后一個氨基酸(Ile)。
實施例1
來源于嗜線蟲致病桿菌A24和發(fā)光光桿狀菌的毒素基因的分離和鑒定重組細菌DNA文庫的構(gòu)建從嗜線蟲致病桿菌菌株A24中分離高分子量基因組DNA使用Marmur(1961)的方法，從發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1中分離高分子量基因組DNA使用Scott等人(1981)的方法。用限制性內(nèi)切酶Sau 3AI對基因組DNA進行部分消化以產(chǎn)生長度為30-50千堿基對的DNA片段，并與牛小腸堿性磷酸酶保溫以脫去磷酸。用限制性內(nèi)切酶Bam HI消化粘粒克隆載體“Supercos”(Stratagene)并按照標準過程(Maniatis等，1982)以1∶3的載體基因組DNA比率將其與部分消化的細菌DNA連接起來。利用Gi gapack II XL Packaging Extract并按照廠家說明(Stratagene)體外包裝連接好的DNA。將包裝好的DNA轉(zhuǎn)染到大腸桿菌菌株NM554(F-、recA、araD139、Δ(ara，leu)7896、ΔlacY74、galU-、galK-、hsr、hsm+、strA、mcrA[+]、mcrA[-])中。將轉(zhuǎn)染的細菌鋪到含150μg.ml-1氨芐青霉素的Luria Bertani(LB)瓊脂培養(yǎng)基上，以挑選包含重組粘粒克隆的細菌。
對來源于嗜線蟲致病桿菌菌株A24的昆蟲毒素基因進行功能性篩選分離使含有各個粘粒克隆的細菌培養(yǎng)物在28℃下于含有150μg.ml-1氨芐青霉素的LB肉湯中生長過夜。將細菌培養(yǎng)物用2mg.ml-1的溶菌酶處理15分鐘以形成無細胞裂解液。將裂解液按5微升等分并每份注入到三只蠟螟第四齡幼蟲的血腔中。鑒定出兩個具有殺蟲活性的克隆。由包含非重組Supercos載體的大腸桿菌NM554細胞經(jīng)溶菌酶處理而制備的對照裂解液在Galleria生物測定中不具有毒素活性。
可產(chǎn)毒素克隆的鑒定利用標準的堿裂解過程(Maniatis等，1982)分離可表達毒素克隆的粘粒DNA。將分離的DNA用限制性內(nèi)切酶消化及瓊脂糖凝膠電泳(Maniatis等，1982)加以分析。兩個粘?？寺】磥戆耸染€蟲致病桿菌基因組DNA中大約34.6kb的相同區(qū)段。一種稱為cos149的克隆被用來作進一步的分析。
將cos149經(jīng)Bam HI酶切所得的7.4kb片段與質(zhì)粒載體pGEM7Z(f)+(Promega Biotec)連接并利用電穿孔以Bio-Rad Gene Pulser在25mF、200及2.5kV條件于0.2cm小池中轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α(F-、F80dlac ZΔM15、recA1、endA1、gyrA96、thi-1、hsdR17[rk-mk+]、supE44、relA1、deoR、Δ[lacZYA-argF]U169)中。將亞克隆產(chǎn)物命名為N8pGEM。利用Galleria血淋巴注射生物測定方法測出由包含了含毒素的N8pGEM克隆的大腸桿菌細胞制備的裂解液。
利用Erase-a-base試劑盒(Promega Biotec)按Henikoff(1984)方法由N8pGEM制備出一組單向缺失克隆并用酶Cla I和Sph I加以消化。通過T4 DNA連接酶連接使缺失DNA重新環(huán)化并以上述的電穿孔方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH5α中。利用Galleria生物測定法對長度各異的缺失亞克隆進行鑒定和毒素生產(chǎn)測試。仍可進行毒素表達的最小克隆(命名為tox1)即包含了1.5kb的嗜線蟲致病桿菌DNA。
用限制性內(nèi)切酶Sac I和Hind III對tox 1克隆的質(zhì)粒DNA進行分離、消化并利用Erase-a-base試劑盒進行定向缺失。對一組缺失克隆進行鑒定和毒素生產(chǎn)測試。仍具毒素活性的最小克隆(命名為toxb4)即包含了1.2kb的嗜線蟲致病桿菌DNA。利用載體和基因特異性測序引物以及ABI PrismTM雙脫氧終止子染色測序混合物(AppliedBiosystems)對toxb4克隆的兩條鏈進行測序。利用標準的堿裂解過程(Maniatis等，1982)制備質(zhì)粒DNA，通過一種熱循環(huán)測序流程對雙鏈DNA進行測序，并依照廠商說明用DNA自動測序儀(Applied BiosystemsModel377)對測序反應(yīng)進行分析。
toxb4克隆包含一段長1205bp、編碼368個氨基酸殘基(附圖2)的蛋白可讀框的插入片段(附圖1)。已利用blastn、fasta及blastp等用于DNA和蛋白序列的程序在非冗余Genbank核苷酸數(shù)據(jù)庫及蛋白數(shù)據(jù)庫中對toxb4的核苷酸序列及推導(dǎo)出的蛋白質(zhì)序列進行了搜索。在嗜線蟲致病桿菌序列與數(shù)據(jù)庫中存在的序列之間沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計上的明顯相似性。
一種來源于發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1的toxb4同系物的分離以toxb4基因作為雜交探針利用核酸雜交技術(shù)在發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1制備的基因組DNA粘粒文庫中進行了篩選。37℃過夜條件下在含有150μg.ml-1氨芐青霉素的LB瓊脂平板上生長出兩百個克隆，按照廠商說明將這些細菌克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)到尼龍膜片(Colony/Plaque ScreenTM，NENDuPont)上。通過0.5N NaOH處理使菌落在膜上原位溶解并用pH7.5的1.0M Tris-Cl中和，晾干使粘粒DNA固定在膜上。將濾膜在含有5XSSPE、0.2％w/v脫脂奶粉、0.5％w/v SDS以及0.2％mg/ml變性鮭精DNA的溶液中于68℃預(yù)雜交3小時。雜交探針的制備是利用隨機引物合成技術(shù)用Gigaprime DNA標記試劑盒(GPK-1，Bresatec)以50μCi的α-32P-dATP制備出大約100ng放射標記的分離toxb4 DNA。在含有5X SSPE、0.2％w/v脫脂奶粉、0.5％w/v SDS以及0.2％mg/ml變性鮭精DNA的溶液中將濾膜與toxb4探針在68℃下保溫過夜。將濾膜用2X SSC簡單沖洗，室溫下用含有2X SSC及0.1％w/v SDS的溶液洗滌一次，時間15分鐘，再于68℃用含有0.5X SSC及0.2％SDS的溶液洗滌一次，時間30分鐘。最后用0.5X SSC沖洗之后，使濾膜在-80℃放射自顯影24小時。檢測到三個雜交有toxb4探針的克隆。將每種克隆增值培養(yǎng)并利用Galleria生物測定法對細胞裂解液進行毒性鑒定。分別命名為cos154和cos160的兩個克隆顯示出毒素表達。由cos154和cos160分離出粘粒DNA并利用限制酶消化及DNA印記雜交法進行分析。從cos160克隆分離出一條長8.5kb、可與toxb4探針雜交的Not I限制酶片段并將其亞克隆到質(zhì)粒載體pBC(KS)+(Stratagene)的Not I位點上。進一步的限制酶作圖及生物測定鑒定出一條長2.4kb、包含產(chǎn)生活性毒素所需的所有序列的Eco RI片段。
發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1毒素基因的鑒定另外構(gòu)建了三種含2.4kb Eco RI片段的亞克隆并作了毒素生產(chǎn)測試(附圖3)。將1.65kb的Hind III/Eco RI片段、1.39kb的Hind III/SmaI片段及1.44kb的Eco RV/Eco RI片段分別連接到pBluescript II(KS)+(Stratagene)質(zhì)粒載體上并將連接好的DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株DH10BTM(Stratagene)(F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)F80dlacZΔM15Δ1acX74 deoR recA1、araD139Δ(ara，leu)7697 galU galK I-rpsL nupG)中。將包含各種亞克隆的培養(yǎng)物制成細胞裂解物，并利用Galleria幼蟲血腔注射的方法進行生物測定。包含1.65kb Hind III/EcoRI片段的培養(yǎng)物及包含1.39kb Hind III/Sma I片段的培養(yǎng)物均表達出活性毒素，但包含1.44kb Eco RV/Eco RI片段的培養(yǎng)物在生物測定中無活性(附圖3)。因此，位于發(fā)光光桿狀菌V16/1的Hind III/Eco RI片段5’端與Eco RV位點之間的序列對于pBluescript II(KS)+質(zhì)粒表達毒素而言是必需的，而位于3’端與Sma I位點之間的序列是非必需的。將毒素基因命名為PlV16tox1，而將由該基因編碼的毒素蛋白命名為PlV16tox1。在內(nèi)部限制酶位點及委托合成寡核苷酸測序引物的基礎(chǔ)上發(fā)展了一種用于發(fā)光光桿狀菌DNA的1.39kb Hind III/Sma I片段測序的策略。對1.39kb的Hind III/Sma I片段的兩條鏈都進行了全序列測定(附圖4)。對該DNA序列進行分析則鑒定出唯一一種長335個氨基酸殘基的長可讀框(附圖5)。
來源于嗜線蟲致病桿菌及發(fā)光光桿狀菌的毒素基因序列及蛋白序列比較利用GCG軟件包的‘Gap’程序?qū)煞N菌種的與推導(dǎo)的毒素蛋白可讀框相對應(yīng)的DNA序列進行了比較。兩種基因序列的編碼區(qū)有83％的同一性(附圖6)，但使用擴展可讀框的5’和3’序列間沒有立即顯示出明顯的相似性。同樣用‘Gap’程序?qū)Χ舅氐鞍仔蛄羞M行的比較發(fā)現(xiàn)相互間有75％的同一性，若把保守氨基酸的物理化學(xué)差異考慮在內(nèi)，則二者相似性為86％(附圖7)。兩種蛋白之間存在的兩種擴展的插入/缺失變體可確定那些就抗蠟螟的毒素活性而言并非必需的氨基酸。
實施例2來源于嗜線蟲致病桿菌A24的毒素基因的分布分別用致病桿菌屬中鑒定的四種菌種、致病桿菌屬中未分類的一種附加菌種以及發(fā)光光桿狀菌的六種菌株的典型菌株制備出基因組DNA，挑選這些菌種是為了能在由16S核糖體RNA基因分析鑒定出的各主要遺傳種群中至少包括其中一種(Brunel等，1997)。將DNA用限制性內(nèi)切酶消化，利用瓊脂糖凝膠電泳分級分離并利用DNA印記方法(Maniatis等，1982)轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。利用由X.nematophilus A24 toxb4基因制備的探針對濾膜進行雜交。選擇雜交條件使同一性平均約為65％的序列能夠被檢測到。結(jié)果顯示于表1。
表1
+表示出現(xiàn)雜交的DNA，-表示不存在毒素基因探針的雜交。
很明顯，來源于嗜線蟲致病桿菌A24的毒素基因同系物在致病桿菌屬的一些種中存在，同時也在光桿狀菌屬的一些而不是全部隔離群中存在。
實施例3克隆到質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中的毒素基因的活性當A24toxb4克隆或V16tox1基因被插入到pGEM型(PromegaBiotec)或pBluescript型(Stratagene)普通質(zhì)粒載體并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中時即表達出活性毒素蛋白。更特別的是，嗜線蟲致病桿菌毒素A24toxb4基因被克隆到pGEM7z質(zhì)粒中而發(fā)光光桿狀菌V16tox1基因被克隆到pBluescript SK質(zhì)粒中。
細胞抽提物的制備將含毒素基因重組質(zhì)?；蚍侵亟M親本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞培養(yǎng)物置于營養(yǎng)肉湯中37℃生長過夜。在培養(yǎng)物中加入溶菌酶至終濃度1mg/ml并將混合物置于室溫30分鐘以溶解細胞。將澄清裂解液直接用于生物測定。
生物測定抽提物用血腔內(nèi)注射測定法進行生物測定。將10微升大腸桿菌細胞裂解液通過節(jié)間膜注射到一種蠟螟幼蟲的腹部。每種抽提物的生物測定注射10只幼蟲，并將幼蟲置于22℃。每天記錄死亡率。結(jié)果顯示于表2。
表2
經(jīng)含有嗜線蟲致病桿菌A24或發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1來源毒素基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞制備出的抽提物可殺死蠟螟幼蟲并在注射后5天內(nèi)導(dǎo)致注射個體的全部死亡。僅含有質(zhì)粒載體pBluescript SK或pGEM7z的細胞制備的抽提物不能殺死蠟螟幼蟲。
溫度對毒性的影響用轉(zhuǎn)化了克隆的毒素基因或質(zhì)粒載體空白對照的大腸桿菌細胞制備抽提物并如前所述注射到蠟螟幼蟲內(nèi)。使經(jīng)注射的幼蟲保持在20℃或25℃。結(jié)果顯示于表3。
表3
含有嗜線蟲致病桿菌A24來源的克隆的毒素基因或發(fā)光光桿狀菌V16來源的毒素基因的細胞制備出的抽提物在注射后三天內(nèi)殺死了所有保持于25℃的幼蟲，在注射后六天內(nèi)殺死了所有保持于20℃的幼蟲。由僅包含克隆載體pBluescript或pGEM7z的細胞制備出的抽提物不會對幼蟲造成顯著的致命性。
實施例4針對不同昆蟲物種的毒素活性(1)Helicoverpa armigera(鱗翅目夜蛾科)生物測定將抽提物用血腔內(nèi)注射測定法進行生物測定。將10微升大腸桿菌細胞裂解液通過節(jié)間膜注射到四齡Helicoverpa armigera幼蟲腹部。每種抽提物的生物測定注射24只幼蟲，并將注射過的幼蟲保持于27℃。每天記錄死亡率。結(jié)果顯示于表4。
表4
經(jīng)含有嗜線蟲致病桿菌A24或發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1來源毒素基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞制備出的抽提物在注射后24小時內(nèi)對注射幼蟲造成了顯著的致命性。所有幼蟲在注射后4天內(nèi)死亡，有少數(shù)“逃脫者”例外，這是由移去注射針頭時導(dǎo)致注射物滲漏造成的。僅含有質(zhì)粒載體pBluescript SK或pGEM7z的細胞制備的抽提物不對H.armigera幼蟲產(chǎn)生顯著影響。
(2)印度谷螟(鱗翅目)生物測定抽提物用血腔內(nèi)注射測定法進行生物測定。將5微升大腸桿菌細胞裂解液通過節(jié)間膜注射到一種末齡期印度谷螟幼蟲的腹部。每種抽提物的生物測定注射20只游走期幼蟲，并將注射過的幼蟲保持于26℃。每天記錄死亡率。結(jié)果顯示于表5。
表5
經(jīng)含有嗜線蟲致病桿菌A24或發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1來源毒素基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞制備出的抽提物在注射后24小時內(nèi)對注射幼蟲造成了顯著的致命性。所有幼蟲在3天內(nèi)死亡。僅含有質(zhì)粒載體pBluescript SK或pGEM7z的細胞制備的抽提物不對生存的印度谷螟幼蟲產(chǎn)生顯著影響。
(3)銅綠蠅(雙翅目麗蠅科)成蟲生物測定抽提物用血腔內(nèi)注射測定法進行生物測定。將5微升大腸桿菌細胞裂解液通過節(jié)間膜注射到一種三日齡銅綠蠅雌性飛蟲的腹部。每種抽提物的生物測定注射20只飛蟲，并將注射過的飛蟲保持于25℃。每天記錄死亡率。結(jié)果顯示于表6。
表6
經(jīng)含有嗜線蟲致病桿菌A24或發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1來源毒素基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞制備出的抽提物在注射后24小時內(nèi)對注射飛蟲造成了顯著的致命性。所有飛蟲在注射后4天內(nèi)死亡。僅含有質(zhì)粒載體pBluescript SK或pGEM7z的細胞制備的抽提物也在注射后的前48小時內(nèi)對銅綠蠅飛蟲產(chǎn)生了顯著的致命性。在這一由對照產(chǎn)生的致命性穩(wěn)定后，殘余飛蟲在實驗期內(nèi)沒有發(fā)生更多的死亡。用鹽水注射進行的附加實驗表明這種對照組早期致死是由注射過程對飛蟲造成物理傷害所引起的。
(4)銅綠蠅(雙翅目麗蠅科)幼蟲生物測定抽提物用血腔內(nèi)注射測定法進行生物測定。將5微升大腸桿菌細胞裂解液通過節(jié)間膜注射到游走期末齡銅綠蠅幼蟲的腹腔。每種抽提物的生物測定注射20只幼蟲，并將注射過的幼蟲保持于25℃。每天記錄死亡率。結(jié)果顯示于表7。
表7
經(jīng)含有嗜線蟲致病桿菌A24或發(fā)光光桿狀菌菌株V16/1來源毒素基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細胞制備出的抽提物在注射后48小時內(nèi)對注射幼蟲造成了顯著的致命性。所有幼蟲在注射后4天內(nèi)死亡，有少數(shù)“逃脫者”例外，原因如前文H.armigera處所述，是由退出針頭時造成滲漏引起的。與銅綠蠅成蟲的情況相同，僅含有質(zhì)粒載體pBluescript SK或pGEM7z的細胞制備的抽提物也在注射后的前48小時內(nèi)對銅綠蠅幼蟲造成了顯著的致命性。此后對照組死亡率穩(wěn)定下來，而殘余幼蟲在實驗期該幼蟲組內(nèi)沒有發(fā)生更多的死亡。如上所述，用鹽水注射進行的附加實驗表明這種對照組早期致死是由注射過程對飛蟲造成物理傷害所引起的。
(5)棉蚜(半翅目蚜科)稚蟲生物測定用含有嗜線蟲致病桿菌毒素基因或空質(zhì)粒載體pGEM7z的大腸桿菌細胞制備抽提物。將抽提物以10％的體積比濃度與一種特定的液體食物相混合并持續(xù)5天時間使蚜蟲可隨意獲得該種食物。結(jié)果顯示于表8。
表8
*食物的一種額外處理，即與大腸桿菌細胞抽提物相比以相同的終濃度補加溶菌酶，以此作為溶菌酶可能帶來的任何潛在影響的對照。
由幼蟲蛻皮數(shù)量的減少可看出嗜線蟲致病桿菌A24毒素能有效地阻礙其生長，并在5天內(nèi)殺死了大部分幼蟲。因此，嗜線蟲致病桿菌A24毒素可通過口服對棉蚜產(chǎn)生殺蟲作用。
實施例5來源于嗜線蟲致病桿菌的全長毒素蛋白的表達與純化對來源于嗜線蟲致病桿菌A24及發(fā)光光桿狀菌V16/1的克隆基因編碼的毒素作進一步的性質(zhì)鑒定需要以一種可對毒素作親和純化的形式將全長蛋白進行表達。這一目的是通過將全長毒素與可用于親和這樣的融合配偶體制成一種融合蛋白加以表達，并在純化階段后用將毒素域加以化學(xué)切割來實現(xiàn)的。IMPACTTM系統(tǒng)(New England Biolabs)是一種合適的表達與純化體系，在該體系中，毒素可讀框的復(fù)制開始于一種與殼多糖結(jié)合區(qū)短DNA編碼序列融合的自剪接內(nèi)含子編碼序列的5’末端。
包含嗜線蟲致病桿菌A24毒素基因及發(fā)光光桿狀菌V16/1毒素基因的重組質(zhì)粒用IMPACTTM載體pCYB3(附圖8)制備。制備這些構(gòu)建體需要在毒素可讀框的兩個末端設(shè)計一種可使毒素基因按照閱讀框架插入表達載體的單一限制酶位點，以使翻譯開始于毒素蛋白的甲硫氨酸起始密碼子，并使用于蛋白剪接的切割位點緊靠著毒素可讀框的最終殘基。按照廠商說明(IMPACTTM系統(tǒng)手冊，New England Biolabs)在大腸桿菌中表達融合蛋白，制備細菌細胞抽提物，在殼多糖纖維素柱上親和分離融合蛋白，于柱上進行DTT介導(dǎo)的融合蛋白的切割并洗脫純化的毒素蛋白。
利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析柱洗脫液以檢測兩種毒素構(gòu)建體的主要蛋白產(chǎn)物是否符合預(yù)期大小(約40千道爾頓)。制品中還含有個別其它蛋白，但包含的量與把聚丙烯酰胺膠進行考馬斯藍染色而確定的樣品所含全蛋白含量相比低于10％。從1升大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物中大約分離出750μg PlV16tox1毒素及1.5mg A24toxb4毒素。純化蛋白經(jīng)磷酸緩沖鹽溶液透析，同時按照廠商說明(Millipore)用標稱分子量分離點為10千道爾頓的濾膜在Millipore離心管上滲濾濃縮到終濃度約1mg/ml。
實施例6純化毒素蛋白的生物活性生物測定如上所述，純化的嗜線蟲致病桿菌及發(fā)光光桿狀菌毒素活性用蠟螟幼蟲及Helicoverpa armigera幼蟲的血腔內(nèi)注射生物測定法進行測定。毒素蛋白制備物用磷酸緩沖鹽溶液稀釋后每只幼蟲注射10微升蛋白溶液。每種蛋白濃度注射10只幼蟲并每隔12小時記錄死亡率，注射后持續(xù)觀察6天。每只幼蟲注射蛋白的測試劑量范圍為1納克(10-9g)～1毫克(10-6g)。利用IMPACTTM系統(tǒng)制備一種屬于惰性蛋白的大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白并以用于兩種毒素蛋白的相同方法加以純化和濃縮。將純化的麥芽糖結(jié)合蛋白用作這些實驗的對照。測試采用的任意劑量麥芽糖結(jié)合蛋白均不對幼蟲造成致死性。結(jié)果顯示于表9～表12。
表9純化PlV16tox1毒素對蠟螟幼蟲的影響
表10純化A24 tox b4毒素對蠟螟幼蟲的影響
表11純化PIV16tox1毒素對H.armigera幼蟲的影響
表10純化A24toxb4毒素對H.armigera幼蟲的影響
<p>一次向每只幼蟲注射毒素蛋白至少20ng后，嗜線蟲致病桿菌A24毒素及發(fā)光光桿狀菌V16/1毒素殺死的幼蟲百分數(shù)均非常高。死亡率取決于毒素的類型和濃度。H.armigera對小劑量嗜線蟲致病桿菌A24毒素具有很高的敏感性，每只幼蟲注射10-20ng毒素即導(dǎo)致很高的死亡率，但它對發(fā)光光桿狀菌V16/1毒素敏感性較小，只有每只幼蟲注射20ng以上劑量的蛋白時才觀察到明顯的死亡率。對蠟螟幼蟲的觀測得出了類似的敏感性模式。盡管更大劑量的毒素殺死幼蟲更快，但殺死兩個物種的幼蟲所用的時間并不強烈依賴于毒素注射后的時間。但是，只要每只幼蟲的注射總劑量大于或等于20ng時，昆蟲的死亡就非常顯著，因為H.armigera幼蟲停止進食而蠟螟幼蟲不能吐出繭絲。
因此，由嗜線蟲致病桿菌的A24toxb4基因和發(fā)光光桿狀菌的PlV16tox1基因編碼的毒素蛋白是有效的殺蟲劑，對包括蠟螟、H.armigera及印度谷螟在內(nèi)的鱗翅目幼蟲進行昆蟲血腔注射則尤其有效。
實施例7純化毒素對培養(yǎng)物內(nèi)的昆蟲細胞的影響分別測試純化的嗜線蟲致病桿菌A24毒素與發(fā)光光桿狀菌V16/1毒素及對照麥芽糖結(jié)合蛋白對組織培養(yǎng)物內(nèi)的昆蟲細胞的生長及生存力的影響。將在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)的含104個細胞的樣品以幾種不同的濃度與待測蛋白混合并接種到96孔組織培養(yǎng)平板的加樣孔中。使細胞在25℃條件下生長24小時，用血細胞記數(shù)器進行細胞記數(shù)并目測估算細胞溶解作用。結(jié)果顯示于表13。
表13
*ND未作細胞數(shù)測定測試采用的任一蛋白濃度的對照麥芽糖結(jié)合蛋白對所有細胞系的細胞生長或生存力均沒有影響。兩種毒素蛋白對果蠅Schneider2細胞系的細胞生長或生存力沒有任何顯著影響。嗜線蟲致病桿菌A24毒素在0.1μg/ml以上濃度時對鱗翅目High-five細胞系造成顯著的細胞生長抑制及細胞毒性。發(fā)光光桿狀菌V16毒素僅在1μg/ml這一測試采用的最高濃度時造成輕微的細胞生長抑制。嗜線蟲致病桿菌A24毒素在0.001μg/ml以上濃度時對鱗翅目Sf9細胞系造成顯著的細胞生長抑制及細胞毒性，而發(fā)光光桿狀菌V16毒素在0.1μg/ml及更高濃度時對該種細胞系有毒性作用。因此，該族毒素對組織物內(nèi)培養(yǎng)的昆蟲細胞顯示出生長抑制活性及細胞毒性，尤其是對鱗翅目來源的細胞系。用一種小鼠雜交瘤細胞系所作的類似實驗表明只有嗜線蟲致病桿菌A24毒素，而且僅在1μg/ml這一測試采用的最高濃度時造成了輕微的生長抑制。
正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所意識到的，本發(fā)明提供一種具有對廣泛的生物系統(tǒng)實施基因工程，并進而可更有效地用于農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)業(yè)及林業(yè)有害昆蟲防治用途的新型毒素。該新型毒素能利用本領(lǐng)域眾所周知的一種或多種蛋白質(zhì)純化方法加以純化。具殺蟲活性的片段可由純化毒素經(jīng)，例如，胰蛋白酶或溴化氰裂解獲得。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到就特定實施方案所示的本發(fā)明而言會存在許多并沒有背離本發(fā)明概括性描述的精神或范圍的變化和/或改變。因此無論從哪方面來看，該實施方案都將被認為是說明性的及非限制性的。
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序列列表<110>聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織<120>來源于嗜線蟲致病桿菌細菌和發(fā)光光桿狀菌細菌的毒素基因<130>91182<150>P08088<151>1997年7月17日<160>6<170>Patent In Ver.2.0
SEQ ID NO1<211>1106<212>DNA<213>嗜線蟲致病桿菌<400>1atggttatta aacccgtaac aactccgagt gtaacacaat taacgcctga tgatagagta 60acgcctgatg ataaaggtga atatcaaccc gttgaaaagc aaatagcgga agatataata 120cgtgtactag aattcaagca aacaaatgaa agtcatacag gattgtatgg aattgcatat 180cgagctaaga aagtaataat agcatatgct ttagcggtaa gtggtattca taatgtctct 240caacttccag aagactatta taaaaacaag gataacacag gtagaattta tcaagaatac 300atgtctaatc ttttatctgc actattgggt gagaatggtg atcaaatttc taaagatatg 360gcaaatgatt ttacccagaa cgaactggag tttggaggtc aacgtcttaa aaatacctgg 420gatacccctg atcctgagaa taaactattg gaagattatt cagatgaaga taaattatta 480gcactatatt tcttcgcttc acaagaactt ccaatggagg caaatcaaca atcaaatgca 540gcaaattttt ttaaagtaat tgatttttta cttatcttat ctgctgtaaa atcactggga 600aaaaggattt tttcaaaaaa tttttacaac ggtctagaaa ctaaatcatt agagaattat 660attgagagaa aaaaactttc taaacctttc tttcgaccac cgcagaagtt acctgatggc 720agaacaggct acttggccgg tccaacaaaa gcgcctaaat tgccaacaac gtcttctaca 780gcaacaacgt ctacagcagc ttcatctaat tggagagtta gtttgcaaaa acttagagac 840aacccatcca gaaatacatt tatgaaaatg gatgatgctg caaaacgaaa atatagttca 900tttataaaag aggtacaaaa gggtaatgat ccacgtgcag cagcagcaag tattggcaca 960aaaagcggca gtaacttcga aaaactgcaa ggtagagatt tatatagtat aagactaagc 1020caagaacaca gggtaacatt ctccataaat aatactgacc aaataatgga gatccaaagt 1080gttggaactc attaccaaaa tatataa 1107SEQ ID NO2<211>1008<212>DNA<213>發(fā)光光桿狀菌<400>2atggttatac aattaacacc tgatgataga agtggatatc cacccgttga aaagcaaata 60gcaggagata tagtacgtat actaaacttt aagcaaacag atgagggtca tacagcatca 120tatggaattg aatatcgagc taagaaaata atattagctt acgctttggc tgtaaatggt 180attcataatg tatctaaact tcctgatgat tattataaga ataaagagac tgctgagaga 240attcatcaag aatatatgtc taatctttca tctgcaccat taggtgaaaa tggtgatcaa 300atttctaaag atatggcaaa tggtttttat aagaatgaac tggattttga aggtcaatat 360cctcaaaaca tttggaatgt tcctgagctt gaaaataaac cattgagtgc ttattcagat 420gacgataaat tattagcact atattttttc tctgtacagg aaattccact ggaggaaaat 480caacaatcaa atgccgcaag attttttaaa ttaattgatt tcttatttac cttatctgct 540gtaacttcac tgggaaggag gattttttca aaaaactttt acaatggatt agaggctaaa 600tcattagaga attatattga gagaaaaaaa ctttctaaac ctttccttcg accaccgcag 660agattacctg atggcagaat aggttatttg gctggaccaa cagaagcgcc taaatggaga 720gtgagtttta aagaacttaa aaataacaaa tctaggaatg gattttctaa tatggaaggg 790gctgcaaaac aaaagtatag ttcatttata aaagaggcac aaaagggtaa cgctccacag 840acagcagcga aaagtattgg tacagccagt ggcagtaacc tggaaaaatt gccgaataat 900ttatatagtg tgaggctaag ccaaaaagac agggtaacct ttactcaaaa tgatactgac 960aatacaatga cggttcatag tgttggaact cattataaaa atatatga 1008SEQ ID NO3<211>368<212>PRT<213>嗜線蟲致病桿菌<400>3Met Val Ile Lys Pro Val Thr Thr Pro Ser Val Ile Gln Lau Thr Pro1 5 10 15Asp Asp Arg Val Thr Pro Asp Asp Lys Gly Glu Tyr Gln Pro Val Glu20 25 30Lys Gln Ile Ala Gly Asp Ile Ile Arg Val Leu Glu Phe Lys Gln Thr35 40 45Asn Glu Ser His Thr Gly Leu Tyr Gly Ile Ala Tyr Arg Ala Lys Lys50 55 60Val Ile Ile Ala Tyr Ala Leu Ala Val Ser Gly Ile His Asn Val Ser65 70 75 60Gln Leu Pro Glu Asp Tyr Tyr Lys Asn Lys Asp Asn Thr Gly Arg Ile85 90 95Tyr Gln Glu Tyr Met Ser Asn Leu Leu Ser Ala Leu Leu Gly Glu Asn100 105 110Gly Asp Gln Ile Ser Lys Asp Met Ala Asn Asp Phe Thr Gln Asn Glu115 120 125Leu Glu Phe Gly Gly Gln Arg Leu Lys Asn Thr Trp Asp Ile Pro Asp130 135 140Leu Glu Asn Lys Leu Leu Glu AsP Tyr Ser Asp Glu Asp Lys Leu Leu145 150 155 160Ala Leu Tyr Phe Phe Ala Ser Gln Glu Leu Pro Met Glu Ala Asn Gln165 170 175Gln Ser Asn Ala Ala Asn Phe Phe Lys Val Ile Asp Phe Leu Leu Ile
180 185190Leu Ser Ala Val Thr Ser Leu Gly Lys Arg Ile Phe Ser Iys Asn Phe195 200 205Tyr Asn Gly Leu Glu Thr Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Glu Arg Lys210 215 220Lys Leu Ser Lys Pro Phe Phe Arg Pro Pro Gln Lys Leu Pro Asp Gly225 230 235 240Arg Thr Gly Tyr Leu Ala Gly Pro Thr Lys Ala Pro Lys Leu Pro Thr245 250 255Thr Ser Ser Thr Ala Thr Thr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Asn Irp Arg250 265 270Val Ser Leu Gln Lys Leu Arg Asp Asn Pro Ser Arg Asn Thr Phe Met275 280 285Lys Met Asp Asp Ala Ala Lys Arg Lys Tyr Ser Ser Phe Ile Lys Glu290 295 300Val Gln Lys Gly Asn Asp Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ser Ile Gly Thr305 310 315 320Lys Ser Gly Ser Asn Phe Glu Lys Leu Gln Gly Arg Asp Leu Tyr Ser325 330 335Ile Arg Leu Ser Gln Glu His Arg Val Thr Phe Ser Ile Asn Asn Thr340 345 350Asp Gln Ile Met Glu Ile Gln Ser Val Gly Thr His Tyr Gln Asn Ile355 360 365
SEQ ID NO4<211>335<212>PRT<213>發(fā)光光桿狀菌<400>4Met Val Ile Gln Leu Thr Pro Asp Asp Arg Ser Gly Tyr Pro Pro Val15 10 15Glu Lys Gln Ile Ala Gly Asp Ile Val Arg Ile Leu Asn Phe Lys Gln20 25 30Thr Asp Glu Gly His Thr Ala Ser Tyr Gly Ile Glu Tyr Arg Ala Lys35 40 45Lys Ile Ile Leu Ala Tyr Ala Leu Ala Val Ser Gly Ile His Asn Val50 55 60Ser Lys Leu Pro Asp Asp Tyr Tyr Lys Asn Lys Glu Thr Ala Glu Arg65 70 75 80lle Tyr Gln Glu Tyr Met Ser Asn Leu Ser Ser Ala Leu Leu Gly Glu85 90 95Asn Gly Asp Gln Ile Ser Lys Asp Met Ala Asn Gly Phe Tyr Lys Asn100 105 110Glu Leu Asp Phe Glu Gly Gln Tyr Pro Gln Asn Ile Trp Asn Val Pro115 120 125Glu Leu Glu Asn Lys Pro Leu Ser Ala Tyr Ser Asp Asp Asp Lys Leu130 135 140Leu Ala Leu Tyr Phe Phe Ser Val Gln Glu Ile Pro Leu Glu Glu Asn145 150 155 160Gln Gln Ser Asn Ala Ala Arg Phe Phe Lys Leu Ile Asp Phe Leu Phe165 170 175Thr Leu Ser Ala Val Thr Ser Leu Gly Arg Arg Ile Phe Ser Lys Asn190 185 190Phe Tyr Asn Gly Leu Glu Ala Lys Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Glu Arg195 200 205Lys Lys Leu Ser Lya Pro Phe Phe Arg Pro Pro Gln Arg Leu Pro Asp210 215 220Gly Arg Ile Gly Tyr Leu Ala Gly Pro Thr Glu Ala Pro Lys Trp Arg225 230 235 240Val Ser Phe Lys Glu Leu Lys Asn Asn Lys Ser Arg Asn Gly Phe Ser245 250 255Ssn Met Glu Gly Ala Ala Lys Gln Lys Tyr Ser Ser Phe Ile Lys Glu260 265 170Val Gln Lys Gly Asn Ala Pro Gln Thr Ala Ala Lys Ser Ile Gly Thr275 280 285Ala Ser Gly Ser Asn Leu Gly Lys Leu Pro Asn Asn Ley Tyr Ser Val290 295 300Arg Leu Ser Gln Lys Asp Arg Val Thr Phe Thr Gln Asn Asp Thr Asp305 310 315 320Asn Thr Met Thr Val His Ser Val Gly Thr His Tyr Lys Asn Ile325 330 335
SEQ ID NO5<211>1205<212>DNA<213>嗜線蟲致病桿菌<400>5ataatgggaa agtacaatgg ttattaaacc cgtaacaact ccgagtgtaa tacaattaac 60gcctgatgat agagtaacgc ctgatgataa aggtgaatat caacccgttg aaaagcaaat 120agcgggagat ataatacgtg tactagaatt caagcaaaca aatgaaagtc atacaggatt 180gtatggaatt gcatatcgag ctaagaaagt aataatagca tatgctttag cggtaagtgg 240tattcataat gtctctcaac ttccagaaga ctattataaa aataaggata acacaggtag 300aatttatcaa gaatacatgt ctaatctttt atctgcacta ttgggtgaga atggtgatca 360aatttctaaa gatatggcaa atgattttac ccagaacgaa ctggagtttg gaggtcaacg 420tcttaaaaat acctgggata ttcctgatct tgagaataaa ctattggaag attattcaga 480tgaagataaa ttattagcac tatatttctt tgcttcacaa gaacttccaa tggaggcaaa 540tcaacaatca aatgcagcaa atttttttaa agtaattgat tttttactta tcttacctgc 600tgtaacatca ctgggaaaaa ggattttttc aaaaaatttt cacaatggtc tagaaactaa 660atcattagag aattatattg agagaaaaaa actttctaaa cctttctttc gaccaccgca 720gaagttacct gatggcagaa caggctactt ggccggttca acaaaagcgc ctaaattgcc 780aacaacgtct tctacagcaa caacgtctac agcagcttca tctaattgga gagttagttt 840gcaaaaactt agagataacc catccagaaa tacatttatg aaaatggatg atgctgcaaa 900acgaaaatat agttcattta taaaagaggt acaaaagggt aatgatccac gtgcagcagc 960agcaagcatt ggtacaaaaa gcggcagtaa cttcgaaaaa ctgcaaggta gagatttata 1020tagtataaga ctaagccaag aacacagggt aacattctcc ataaataata ctgaccaaat 1080aatggagatc caaagtgttg gaactcatca ccaaaatata taacctgatt tatagaagtg 1140atAagacgta agataaatat ggaaggttgt aattctattg cacttcctca gaggtgaccg 1200ctcag 1205SEQ ID NO6<211>1388<212>DNA<213>發(fā)光光桿狀菌<400>6aagcttgcta ataattcttg cgtaagttaa ttttacattg aaattaacgc ttaaaaagcc 60agggaaaact ctatatttaa agttgaaatt tatattagta gcgacaaatt gcggagtttt 120ctgccagaaa tttcatagct caaataaaca ttaacataat ggagaaatat aatggttata 180caattaacac ctgatgatag aagtggatat ccacccgttg aaaagcaaat ageaggagat 240atagtacgta tactaaactt taagcaaaca gatgagggtc atacagcatc atatggaatt 300gaatatcgag ctaagaaaat aatattagct tacgctttgg ctgtaagtgg tattcataat 360gtatctaaac ttcctgatga ctattataag aataaagaga ctgctgagag aatttatcaa 420gaatatatgt ctaatctttc atctgcacta ttaggtgaaa atggtgatca aatttctaaa 480gatatggcaa atggttttta taagaatgaa ctggattttg aaggtcaata cccccaaaac 540atttggaatg ttcctgagct tgaaaataaa ccattgagcg cttattcaga tgacgataaa 600ttattagcac tatatttttt ctctgtacag gaaattccac tggaggaaaa tcaacaatca 660aatgccgcaa gattttttaa attaattgat ttcttattta ccttatctgc tgtaacttca 720ctgggaagga ggattttttc aaaaaacttt tacaatggat tagaggctaa atcattagag 780aattatattg agagaaaaaa actttctaaa cctttctttc gaccaccgca gagactacct 840gatggcagaa taggttattt ggetggacca acagaagcgc ctaaatggag agtgagtttt 900aaagaactta aaaataacaa atctaggaat ggattttcta atatggaagg ggctgcaaaa 960caaaagtata gttcatttat aaaagaggta caaaagggta acgctccaca gacagcagcg 1020aaaagtattg gtacagccag tggcagtaac ctggaaaaat tgccgaataa tttatatagt 1080gtgaggctaa gccaaaaaga cagggtaacc tttactcaaa atgatactga caacacaatg 1140acggttcata gtgttggaac tcattataaa aatatatgat gagtaatctc tgacttcgat 1200tgacagagca tttttaagct ctcattttct caacgggagt ctcataaggc gttttacttt 1260tcaagccact atgtggtctg tgataattgt aaaacgcctt cttttagcca atacacttta 1320ctaccaagaa aatatatacc ctatggattt caagatggat cgcggcggca agggagcgaa 1380tccccggg 1388
權(quán)利要求
1.一種分離的編碼殺蟲毒素的多核苷酸分子，所述的多核苷酸分子包括一基本與下列之一相符合的核苷酸序列(i)如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；(ii)如SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；以及(iii)編碼具殺蟲活性毒素片段的(i)或(ii)的一部分的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子包含一基本與SEQ ID NO1所示核苷酸序列相符合的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子包含一基本與SEQ ID NO2所示核苷酸序列相符合的核苷酸序列。
4.一種分離的編碼殺蟲毒素的多核苷酸分子，所述的多核苷酸分子包含一與SEQ ID NO2所示核苷酸序列的序列同一性至少達85％的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的分離的多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子包含一與SEQ ID NO2所示核苷酸序列的序列同一性至少達95％的核苷酸序列。
6.一種基本純凈的殺蟲毒素，該毒素包括一與下列之一的序列同一性至少達70％的氨基酸序列(i)如SEQ ID NO3所示的氨基酸序列，(ii)如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，(iii)(i)或(ii)的具殺蟲活性毒素片段的氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的殺蟲毒素，其中該毒素包括一與SEQ ID NO3所示氨基酸序列的序列同一性至少達85％的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的殺蟲毒素，其中該毒素包括一與SEQ ID NO3所示氨基酸序列的序列同一性至少達95％的氨基酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的殺蟲毒素，其中該毒素包括一與SEQ ID NO3所示氨基酸序列基本相符合的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求6的殺蟲毒素，其中該毒素包括一與SEQ ID NO4所示氨基酸序列的序列同一性至少達85％的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求6的殺蟲毒素，其中該毒素包括一與SEQ ID NO4所示氨基酸序列的序列同一性至少達95％的氨基酸序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求6的殺蟲毒素，其中該毒素包括一與SEQ ID NO4所示氨基酸序列基本相符合的氨基酸序列。
13.一種重組微生物，該重組微生物的特征在于它由根據(jù)權(quán)利要求1～5的任一的多核苷酸分子轉(zhuǎn)化并表達該多核苷酸分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的重組微生物，其中該微生物選自細菌、原生動物和酵母。
15.一種生產(chǎn)殺蟲毒素的方法，所述的方法包括(i)在適合于編碼毒素的多核苷酸分子表達的條件下培養(yǎng)一種根據(jù)權(quán)利要求13或14的微生物；以及(ii)可任選地回收表達的殺蟲毒素
16.一種殺死有害昆蟲的方法，所述的方法包括將有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求13或14的重組微生物以可任選的與一種可接受的農(nóng)用載體混合的方式應(yīng)用到所述昆蟲大批滋生的地區(qū)。
17.一種昆蟲特異性重組病毒，該昆蟲特異性重組病毒的特征在于其基因組的非必需區(qū)內(nèi)包含一根據(jù)權(quán)利要求1～5的任一多核苷酸分子，該多核苷酸分子可操作地與一種合適的誘導(dǎo)型或組成型啟動子序列連接起來。
18.一種殺死有害昆蟲的方法，所述的方法包括將有效劑量的根據(jù)權(quán)利要求17的重組病毒以可任選的與一種可接受的農(nóng)用載體混合的方式應(yīng)用到所述昆蟲大批滋生的地區(qū)。
19.一種由根據(jù)權(quán)利要求1～5的任一多核苷酸分子轉(zhuǎn)化并能夠表達該多核苷酸分子的植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種編碼由致病桿菌屬(Xenorhabdus)和光桿狀菌屬(Photorhabdus)細菌產(chǎn)生的對昆蟲具有特異性的新型蛋白毒素的多核苷酸分子鑒定和分離。該多核苷酸分子可引入例如昆蟲特異性病毒(包括昆蟲痘病毒和核型多角體病毒)、細菌(包括薄壁菌門(Gracilicutes)、厚壁菌門(Firmicutes)、軟壁菌門(Tenericutes)和疵壁菌門(Mendosicutes))、酵母以及植物內(nèi)以用于蟲害控制的技術(shù)。
文檔編號C12N1/21GK1270497SQ98809216
公開日2000年10月18日 申請日期1998年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月17日
發(fā)明者P·D·伊斯特 申請人:聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織