專利名稱：人肌氨酸氧化酶及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞學(xué)、分子內(nèi)分泌學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、和基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種在人類腎上腺中表達(dá)的肌氨酸氧化酶(Sarcosine Oxidase，簡(jiǎn)稱為“SOX”)及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
哺乳動(dòng)物的SOX蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的，是普遍存在于原核生物的SOX蛋白的同源蛋白(J.Bio.Chem.1997 272(10)6766-76)(Genomics 1997 Dec 15；46(3)480-2)。兔(Oryctolagus cuniculus)SOX蛋白是一種黃素蛋白(flavoprotein)，序列分析顯示SOX的氨基末端具有結(jié)合ADP的β-α-β折疊，這是緊密結(jié)合黃素的黃素蛋白的一個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域。該蛋白共價(jià)結(jié)合有一分子的黃素作為輔酶，這在哺乳動(dòng)物的酶中是非常少見的。兔SOX的羧基末端具有過(guò)氧化物酶體的信號(hào)序列1(Peroxisomal targeting signal1)AHL，這是哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)運(yùn)入這過(guò)氧化物酶體的特征信號(hào)序列，這使該酶進(jìn)入并存在于過(guò)氧化物酶體中(J.Cell Biol.1989 108，1657-64)(J.Bio.Chem.1997 272(10)6766-76)。
SOX在過(guò)氧化物酶體中催化產(chǎn)生過(guò)氧化氫的氧化反應(yīng)。其催化的主要底物有肌氨酸(sarcosine)，L-六氫吡啶羧酸(L-pipecolic acid)和L-脯氨酸(L-proline)。在該酶催化下，肌氨酸被氧化產(chǎn)生甘氨酸和甲醛；L-六氫吡啶羧酸被氧化產(chǎn)生6-羧化△-哌啶(△-piperideine-6-carboxylate)；L-脯氨酸被氧化產(chǎn)生5羧化△-吡咯啉(△-pyrroline-5-carboxylate)；而D-六氫吡啶羧酸被氧化產(chǎn)生2-羧化△-哌啶(△-piperideine-2-carboxylate)。此外，該酶對(duì)天門冬氨酸的D-同分異構(gòu)體，丙氨酸，脯氨酸和六氫吡啶羧酸也有一定的活性。這一底物譜與從猴肝臟中分離得到的L-六氫吡啶羧酸氧化酶類似(J Biol Chem 1991 Mar 15；266(8)4822-30)。在實(shí)驗(yàn)條件下hSOX對(duì)肌氨酸有最大的催化活性，但從催化效率來(lái)看(kc/Km)L-六氫吡啶羧酸略具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。因此，L-六氫吡啶羧酸是其相對(duì)較主要的代謝底物。
作為過(guò)氧化物酶體中催化L-六氫吡啶羧酸的兩種酶之一(另一種酶為L(zhǎng)-六氫吡啶羧酸氧化酶)，SOX是過(guò)氧化物酶體生理功能得以實(shí)現(xiàn)的重要組成部分。過(guò)氧化物酶體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在且在細(xì)胞代謝中具有重要的功能。其中最重要的一些代謝功能包括縮醛磷脂、膽汁酸、膽固醇和多萜醇的合成，脂肪酸、分支脂肪酸、不飽和脂肪酸、前列腺素、六氫吡啶羧酸和戊二酸的氧化，以及嘌呤、多元胺、氨基酸、乙二醛和活性氧的代謝。已證實(shí)，一系列遺傳性疾病與過(guò)氧化物酶體代謝功能異常有關(guān)，這些疾病主要表現(xiàn)為神經(jīng)異常(neurological abnormality)(Mol Cell Biochem 1997Feb；167(1-2)1-29)。
過(guò)氧化物酶體異?？梢苑譃槿悊蚊富钚越档停欢嗝富钚越档颓疫^(guò)氧化物酶體數(shù)量減少；多酶活性缺失但肝組織中過(guò)氧化物酶體數(shù)量正常(J．Inherit.Metab.Dis.1987；10 Suppl.123-32)。
過(guò)氧化物酶體異常引起的疾病主要有Zellweger綜合征、新生兒腎上腺-腦百質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(neonatal adrenoleukodystrophy)、嬰兒多神經(jīng)炎型遺傳性運(yùn)動(dòng)失調(diào)(infantileRefsum disease)、血六氫吡啶羧酸鹽過(guò)多(hyperpipecolatemia)(J Biol Chem 1991 2664822-30)和成人多神經(jīng)炎型遺傳性運(yùn)動(dòng)失調(diào)(adult Refsum disease)(Hum.Mol.Genet.1995 Oct；4(10)1963-6)。這些疾病都與L-六氫吡啶羧酸水平升高有關(guān)(J Biol Chem 1991266 4822-30)(Hum Mol Genet 1995 Oct；4(10)1963-6)。
在本申請(qǐng)之前，尚沒(méi)有公開或報(bào)道過(guò)本發(fā)明所涉及的人hSOX蛋白。
本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的人基因hSOX(Genbank AccessionNo.AF136970)，該基因編碼人的肌氨酸氧化酶。
本發(fā)明的第二目的是提供一種新的人蛋白，即肌氨酸氧化酶hSOX。
本發(fā)明的第三目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)上述的新的人肌氨酸氧化酶和核酸序列的方法。
本發(fā)明還提供了這種肌氨酸氧化酶多肽和編碼序列的應(yīng)用。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有人hSOX蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的人hSOX蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中該宿主細(xì)胞是大腸桿菌；在另一實(shí)例中，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種產(chǎn)生具有人hSOX蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，該方法包括(1)將編碼具有人hSOX蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hSOX蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hSOX蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hSOX蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hSOX蛋白活性的多肽。
較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.6中第2-1171位的序列。
本發(fā)明還提供了與hSOX蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hSOX蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人hSOX蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.6中第2-1171位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.6序列的編碼框第2-1171位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.6中第2-1171位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.7所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與人hSOX相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.6中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計(jì))。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測(cè)量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測(cè)量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“人hSOX蛋白或多肽”指具有天然人hSOX蛋白活性的SEQ ID NO.7序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與人hSOX相同功能的、SEQ IDNO.7序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括hSOX蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明人hSOX多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與人hSOXDNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人hSOX多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人hSOX多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括人hSOX多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人hSOX多肽序列的至少約10個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。
在本發(fā)明中，“hSOX保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.7的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1
發(fā)明還包括人hSOX蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人hSOX多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的人hSOX多肽時(shí)，可以將hSOX編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成人hSOX蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
本發(fā)明還提供了對(duì)人hSOX特異的抗體，包括多克隆抗體和單克隆抗體。
在本發(fā)明中，可以使用一系列本領(lǐng)域已知的方法來(lái)制備針對(duì)hSOX特異的抗體。例如，將提純的人hSOX基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動(dòng)物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗體。同樣，表達(dá)人hSOX或它的抗原片段的細(xì)胞也可以用來(lái)對(duì)動(dòng)物致免疫而產(chǎn)生抗體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可以用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohler et a1.，Nature 256495，1975；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler et al.，Eur.J.Immunol.6292，1976)。本發(fā)明的抗體包括可以阻抑hSOX功能的抗體，也可以是不影響人hSOX功能的抗體。每一類抗體都可以通過(guò)對(duì)人hSOX基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人hSOX基因產(chǎn)物及其片段可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進(jìn)行合成。與非修飾形式的hSOX基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體，可以通過(guò)用在原核細(xì)胞例如E.coli中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來(lái)免疫動(dòng)物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以通過(guò)用在真核細(xì)胞如酵母或昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物的來(lái)免疫動(dòng)物而得到。
本發(fā)明的人hSOX抗體可以用來(lái)鑒定表達(dá)人hSOX蛋白或多肽的細(xì)胞，如Jurkat T細(xì)胞。例如，可以用一種可檢測(cè)的分子例如熒光素異硫氰酸(FITC)來(lái)標(biāo)記hSOX特異抗體，然后讓人hSOX特異抗體與細(xì)胞樣品接觸，再用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)出與hSOX特異抗體結(jié)合的細(xì)胞。
除了在細(xì)胞表面檢測(cè)人hSOX外，還可以用Western印跡技術(shù)分析該蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解液可以從培養(yǎng)細(xì)胞或取自病人的組織標(biāo)本如腎上腺中提取，并溶解在含有去污劑的裂解緩沖液中。然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細(xì)胞提取物(同時(shí)將提純的人hSOX多肽作為陽(yáng)性對(duì)照)，接著通過(guò)電泳雜交將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素上。為了用Western印跡免疫探測(cè)hSOX多肽，可以使用典型的抗體結(jié)合檢測(cè)方法，例如放射自顯影或堿性磷酸酶檢測(cè)方法。并可使用免疫接種血清或不相關(guān)的單克隆抗體作為非特異反應(yīng)的對(duì)照。
還可用Nothern印跡法技術(shù)分析hSOX基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析人hSOX的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
人hSOX DNA的Nothern印跡分析和人hSOX特異抗體的Western印跡分析可以聯(lián)合使用，以證實(shí)人hSOX在生物樣本中的表達(dá)。人hSOXDNA還可以用于Southern印跡分析或原位雜交分析，以將該基因定位于染色體上，并可進(jìn)行遺傳連鎖分析以找出其它可能的疾病相關(guān)基因。
此外，本發(fā)明還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hSOX核苷酸編碼序列的8-100個(gè)，較佳地15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼hSOX的核酸分子。
本發(fā)明還提供了檢測(cè)樣品中是否存在hSOX核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于hSOX核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的hSOX核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選hSOX同源基因或同源蛋白。
為了得到與hSOX基因相關(guān)的人cDNAs或基因組DNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選人cDNA或基因組DNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)緊條件下，用32P對(duì)hSOX的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來(lái)自人腎上腺組織的文庫(kù)。來(lái)自參與內(nèi)分泌的其它人體組織或特定人體細(xì)胞株的cDNA文庫(kù)也可用于篩選目的。構(gòu)建來(lái)自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買到，例如購(gòu)自Clontech，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與hSOX相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
根據(jù)核苷酸相似性篩選hSOX同源物可以按如下方法完成。人體腎上腺cDNA文庫(kù)，例如Clontech Cat.#7430-1(Clontech，Palo Alto，Cal.)可以使用一段包含hSOX基因序列的全部或部分的隨機(jī)引物化DNA探針篩選。要完成對(duì)與hSOX序列至少有70％同源性的DNA插入序列的克隆的鑒定，可以使用雜交溫度為55℃的雜交液，然后用0.5×SSC和0.1％SDS清洗。用這種方法識(shí)別的克隆的DNA插入序列可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序來(lái)評(píng)價(jià)它與hSOX基因的相似性。組織表達(dá)的分布可以用上述的Northern印跡法技術(shù)分析。
hSOX同源物也可以用針對(duì)hSOX蛋白或多肽的抗體來(lái)識(shí)別。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)商品化的或者用已知方法構(gòu)建的，來(lái)自細(xì)胞或者組織例如腎上腺的表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選。將文庫(kù)倒入平皿，菌落轉(zhuǎn)移到一張硝化纖維素膜上，使表達(dá)的重組蛋白結(jié)合到膜上。然后就可以用特異性的人hSOX抗體進(jìn)行典型的抗體結(jié)合和檢測(cè)。用這種方法所識(shí)別出克隆中的DNA插入序列，可以進(jìn)一步用DNA限制性內(nèi)切酶分析和DNA測(cè)序進(jìn)行分析以評(píng)價(jià)它與hSOX基因的相似性。新識(shí)別的基因的組織表達(dá)分布可以同樣地按上述方法進(jìn)行分析。
本發(fā)明的人hSOX核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆人載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工化學(xué)合成的方法來(lái)合成有關(guān)序列。在本申請(qǐng)之前，現(xiàn)有技術(shù)已完全可以通過(guò)先合成多個(gè)多核苷酸小片段，然后再進(jìn)行連接而獲得編碼本發(fā)明人hSOX蛋白的的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領(lǐng)域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來(lái)自動(dòng)合成肽?？梢苑謩e化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
本發(fā)明蛋白的編碼序列可用于基因定位。例如，通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)(FISH)，將cDNA克隆與分裂中期的染色體進(jìn)行雜交，可以準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體定位。該技術(shù)可以使用短至約500bp的cDNA；也可以使用長(zhǎng)至約2000bp或者更長(zhǎng)的cDNA。對(duì)于該技術(shù)，可參見Verma等人，Human ChromosomesA Manual ofBasic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦序列被定位于染色體上的某個(gè)精確位置，將可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些遺傳圖譜數(shù)據(jù)是可以獲得的，例如通過(guò)孟德爾(Mendelian)人遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)(可通過(guò)Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary在網(wǎng)上獲得)。然后，通過(guò)連鎖分析來(lái)鑒定基因與已定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的相關(guān)性。
接著，有必要確定患病個(gè)體和健康個(gè)體之間的cDNA或基因組序列方面的差異。如果某一突變存在于部分或全部患病個(gè)體但不存在于正常個(gè)體，那么該突變可能就是該疾病的致病因素。
利用本發(fā)明的人hSOX蛋白，通過(guò)各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與人hSOX發(fā)生相互作用的物質(zhì)或，如受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明人hSOX蛋白及其抗體、抑制劑、拮抗劑或受體等，當(dāng)在治療上進(jìn)行施用(給藥)時(shí)，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無(wú)毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常為約5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過(guò)常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。
以本發(fā)明的人hSOX蛋白為例，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的蛋白質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的人SOX蛋白可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無(wú)菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
當(dāng)本發(fā)明的人hSOX蛋白多肽被用作藥物時(shí)，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動(dòng)物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過(guò)約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
通過(guò)同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的新基因具有與已發(fā)表并被確認(rèn)為兔(Oryctolaguscuniculus)SOX蛋白的基因高度同源的序列，并且本發(fā)明的新蛋白具有兔(Oryctolagus cuniculus)SOX蛋白高度保守的氨基酸序列。所以，本發(fā)明的hSOX是兔(Oryctolagus cuniculus)SOX蛋白基因的一個(gè)同源基并具有相似的功能。


圖1為本發(fā)明的人hSOX與兔(Oryctolagus cuniculus)SOX基因核酸序列(GenBank Accession No.U82267)的同源比較(FASTA)圖。其中，相同的核苷酸用“｜”標(biāo)出。
圖2為本發(fā)明的人hSOX蛋白與兔(Oryctolagus cuniculus)SOX蛋白氨基酸序列(SwissProt ACCESSION AAB48443)，小家鼠(Mus musculus)SOX蛋白氨基酸序列(SwissProt ACCESSION AAB48443)以及兩種微生物Arthrobacter sp.SOX蛋白氨基酸序列(SwissProt ACCESSION 066180)，Bacillus sp.SOX蛋白氨基酸序列(SwissProt ACCESSION P40859)的同源比較(PILEUP)圖。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1hSOX基因的克隆1．組織分離(Tissue isolation)腎上腺來(lái)源于5個(gè)正常成年男性供體，在死后四小時(shí)內(nèi)取出腎上腺組織，立即置于液氮中冷凍保存。
2．mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRlzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3．cDNA文庫(kù)的構(gòu)建(Construction of cDNA library)
以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見SEQ ID NO.1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點(diǎn)的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO.2和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時(shí)，再進(jìn)行片段分離。過(guò)柱篩選長(zhǎng)度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無(wú)菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack Ⅲ Gold Cloning Kit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL l-Blue MRF’(Stratagene，CA9203，USA)細(xì)菌。涂板并測(cè)定滴度。
4．測(cè)序及數(shù)據(jù)庫(kù)建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫(kù)中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3′端和5′端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UNUltra450Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，將無(wú)同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫(kù)。
5．基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)在得到的新基因片段序列信息基礎(chǔ)上，進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分兩階段進(jìn)行(1)“電子克隆”(Electronic Cloning)以新基因片段序列作為探針?biāo)褜bEST數(shù)據(jù)庫(kù)，將重疊序列＞50bp，同源性在98％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，簡(jiǎn)稱“EST”)序列認(rèn)為同一序列(consensus sequence)，取出并用AUTOASSEMBLER軟件進(jìn)行拼接，部分EST可以延伸探針序列。再用STRIDER軟件分析被延伸的序列是否具有完整的開放閱讀框架(Open Reading Frame，ORF)，用BLAST搜尋Genbank或SwissProt以確定該序列在核苷酸和氨基酸水平上是否與其他物種有同源性，以幫助判別所得到的基因全長(zhǎng)完整性如何。通過(guò)電子克隆的方法，通常可獲取hSOX基因的全長(zhǎng)序列。
(2)cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)如果通過(guò)“電子克隆”方法仍未得到完整的cDNA全長(zhǎng)，則在已有序列的5′或3′端設(shè)計(jì)引物，在人類--Marathon-Ready cDNA文庫(kù)(Clontech Lab，Inc，USA)中進(jìn)行長(zhǎng)距離PCR反應(yīng)。然后對(duì)PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序。用AUTOASSEMBLER及STRIDER軟件分析被延長(zhǎng)的序列有無(wú)完整的ORF，如無(wú)，重復(fù)上述過(guò)程直至獲得全長(zhǎng)。
(3)RI-PCR對(duì)于5′和3′端已知的序列，如果中間尚有一段間隙(gap)無(wú)法從已有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)或自身數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，可考慮采用RT-PCR的方法。在序列5′端設(shè)計(jì)引物，3′端引物采用Oligo-dT，在腎上腺總RNA庫(kù)中進(jìn)行擴(kuò)增。然后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序。最后拼接并獲得全長(zhǎng)。
通過(guò)組合使用上述3種方法，獲得了候選的人hSOX蛋白的全長(zhǎng)編碼序列。在拼接得到全長(zhǎng)(至少包含完整的開放讀框)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)引物R15′-TATGGCGGCTCAGAAAGATCTC-3′(SEQ ID NO.4)為正向引物，寡核苷酸R25′-ACCCATCTCAAACGTCCTTGC-3′(SEQ ID NO.5)為反向引物，以腎上腺組織的總RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，R1/R2的PCR條件為94℃ 5分鐘，隨之以94℃30秒、60℃ 30秒和72℃1分鐘進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1498bp。然后按常規(guī)方法以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測(cè)序，獲得SEQ ID NO.6所示的序列。
實(shí)施例2hSOX基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的人hSOX全長(zhǎng)cDNA(GenBank Accession No.AF112371。因申請(qǐng)保密，故在本申請(qǐng)之前未對(duì)公眾公開)的長(zhǎng)度為1498bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.6，其中開放讀框位于2-1171位核苷酸。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出hSOX的氨基酸序列，共390個(gè)氨基酸殘基，分子量44065.87，pI為8.67。詳細(xì)序列見SEQ IDNO.7.
將hSOX的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與兔(Oryctolagus cuniculus)的基因存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它與兔(Oryctolagus cuniculus)SOX基因的mRNA全編碼序列(GenBank AccessionNo.U82267)的12-1509位堿基有99.8％的相同性(圖1)，在氨基酸水平上，它與兔(Oryctolagus cuniculus)SOX蛋白(SwissProtAccessionNo.P79371)的第1-390位氨基酸殘基有99.5％的相同性和100％的相似性。由上可見，hSOX基因與兔(Oryctolagus cuniculus)SOX基因無(wú)論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性，可以認(rèn)為兩者在功能上也有很高相似性。
本發(fā)明的人hSOX除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hSOX還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人hSOX蛋白的N端與小家鼠SOX蛋白的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對(duì)本發(fā)明人hSOX的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員)。
此外，本發(fā)明人hSOX核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人hSOX的表達(dá)水平或者抑制人hSOX的過(guò)度表達(dá)。本發(fā)明的人hSOX蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hSOX缺失、無(wú)功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
由于本發(fā)明的人hSOX蛋白具有源自人的天然氨基酸序列，因此，與來(lái)源于其他物種(如兔(Oryctolagus cuniculus))的同族蛋白相比，預(yù)計(jì)在施用于人時(shí)將具有更高的活性和/或更低的副作用(例如在人體內(nèi)的免疫原性更低或沒(méi)有)。
實(shí)施例3hSOX蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究1．將hSOX蛋白的氨基酸序列的羧基末端三個(gè)氨基酸AHL是哺乳動(dòng)物過(guò)氧化物酶體信號(hào)序列1 (Peroxisomal targeting signal l)，這是哺乳動(dòng)物蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)入過(guò)氧化物酶體的特征信號(hào)序列，這證實(shí)了該酶作用場(chǎng)所在過(guò)氧化物酶體中(J.Cell Biol.1989 108，1 657-64)。
2．將hSOX蛋白的氨基酸序列在motif數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址為http//www.motif.genome.ad．jp)中檢索結(jié)構(gòu)域，得到以下結(jié)果1 MAAQKDLWDA IVIGAGIQGC FTAYHLAKHR KRILLLEQFF LPHSRGSSHG51 QSRIIRKAYL EDFYTRMMHE CYQIWAQLEH EAGTQLHRQT GLLLLGMKEN101 QELKTIQANL SRQRVEHQCL SSEELKQRFP NIRLPRGEVG LLDNSGGVIY151 AYKALRALQD AIRQLGGIVR DGEKVVEINP GLLVTVKTTS RSYQAKSLVI201 TAGPWTNQLL RPLGIEMPLQ TLRINVCYWR EMVPGSYGVS QAFPCFLWLG
251 LCPHHIYGLP TGEYPGLMKV SYHHGNHADP EERDCPTART DIGDVQILSS301 FVRDHLPDLK PEPAVIESCM YTNTPDEQFI LDRHPKYDNI VIGAGFSGHG351 FKLAPVVGKI LYELSMKLTP SYDLAPFRIS RFPSLGKAHL在氨基酸序列中下劃線區(qū)(8-61；184-267；338-377)為肌氨酸氧化酶結(jié)構(gòu)域。
3．根據(jù)同源序列比較分析得到以下結(jié)果(并請(qǐng)參照附圖2)1 MAAQKDLWDA IVIGAGIQGC FTAYHLAKHR KRILLLEQFF LPHSRGSSHG51 QSRIIRKAYL EDFYTRMMHE CYQIWAQLEH EAGTQLHRQT GLLLLGMKEN101 ELKTIQANL SRQRVEHQCL SSEELKQRFP NIRLPRGEVG LLDNSGGVIY151 AYKALRALQD AIRQLGGIVR DGEKVVEINP GLLVTVKTTS RSYQAKSLVI201 TAGPWTNQLL RPLGIEMPLQ TLRINVCYWR EMVPGSYGVS QAFPCFLWLG251 LCPHHIYGLP TGEYPGLMKV SYHHGNHADP EERDCPTART DIGDVQILSS301 FVRDHLPDLK PEPAVIESCM YTNTPDEQFI LDRHPKYDNI VIGAGFSGHG351 FKLAPVVGKI LYELSMKLTP SYDLAPFRIS RFPSLGKAHLⅠ在氨基酸序列中下劃線區(qū)(9-37)為一個(gè)結(jié)合ADP的β-α-β折疊，這是緊密結(jié)合黃素的黃素蛋白的一個(gè)高度保守結(jié)構(gòu)域(Nature 1974 250，194-199)(J Mol Biol1974 89，339-354)。該區(qū)域也是肌氨酸氧化酶的一個(gè)保守區(qū)域(J Biol Chem 1997272(10)，6766-76)Ⅱ在氨基酸序列中粗體區(qū)(46-56，319-335，342-358)是肌氨酸氧化酶的保守區(qū)域(J Biol Chem 1997 272(1 0)，6766-76)
綜上所述，從hSOX蛋白的結(jié)構(gòu)和理化特性進(jìn)一步證實(shí)了該基因與兔(Oryctolaguscuniculus)SOX蛋白的相似性。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了功能特異性的生物化學(xué)原理，因此本發(fā)明的人SOX具有兔(Oryctolagus cuniculus)SOX相似或相同的功能。
實(shí)施例4hSOX基因的組織表達(dá)譜1．電子Northern表達(dá)譜。按Ton C.等人的方法(Ton C et al.，Biochem BiophysRes Commun 1997 Dec 18；241(2)589-594；Hwang DM，et al.，Circulation 1997 Dec16；96(12)4146-4203)，將hSOX cDNA序列在GCG軟件包中的dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中做BLAST檢索，在得到的人類EST中，概率值＜10e-10、相同性＞95％的EST有150個(gè)，可視為該基因在組織中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)本，由此得出表達(dá)該基因的組織譜，發(fā)現(xiàn)其在腎上腺、腦、乳腺、小腦、結(jié)腸、B細(xì)胞生發(fā)中心(B cell germinal center)、海馬區(qū)、腎、肝、肺、肌肉、神經(jīng)上皮、黑色素細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞、卵巢、胰腺、甲狀旁腺、甲狀腺、松果體、胎盤、前列腺、脾臟和睪丸中均有表達(dá)，表明它在人體許多組織器官中都發(fā)揮著重要作用。
實(shí)施例5hSOX多肽的制備和提純?cè)谠搶?shí)施例中，將全長(zhǎng)的hSOX編碼序列或片段構(gòu)建入商品化的蛋白質(zhì)融合表達(dá)載體之中，以表達(dá)和提純重組蛋白。
1．將hSOX多肽以GST融合蛋白的形式在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)。
原核表達(dá)載體的構(gòu)建，以及轉(zhuǎn)化大腸桿菌根據(jù)人hSOX的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物(分別對(duì)應(yīng)于編碼序列5′和3′端的約20個(gè)以上核苷酸)，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這根據(jù)選用的pGEX-2T載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hSOX基因在保證閱讀框正確的前提下克隆至pGEX-2T載體(Pharmacia，Piscataway，NJ)。鑒定好的表達(dá)載體利用CaCl2方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，篩選鑒定得到含有pGEX-2T-hSOX表達(dá)載體的工程菌DH5α-pGEX-2T-hSOX。
表達(dá)GST-hSOX重組蛋白的工程菌的分離鑒定挑取單菌落的DH5α-pGEX-2T-hSOX工程菌于3ml含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)過(guò)夜，按1∶100的濃度吸取培養(yǎng)液于新的LB培養(yǎng)基(含100μg/ml氨芐青霉素)中培養(yǎng)約3小時(shí)，至OD600達(dá)0.5后，加入IPTG至終濃度1mmol/L繼續(xù)于37℃分別培養(yǎng)0，1，2，3小時(shí)。取培養(yǎng)時(shí)間不同的1ml菌液離心，在細(xì)菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上樣緩沖液50μl，蒸餾水45μl，二巰基乙醇5μl)，混懸細(xì)菌沉淀，沸水浴中煮5分鐘，10000rpm離心1分鐘，上清加入12％SDS-PAGE膠中電泳。染色后觀察預(yù)期分子量大小的蛋白量隨IPTG誘導(dǎo)時(shí)間增加而增加的菌株即為表達(dá)GST-hSOX融合蛋白的工程菌。
GST-hSOX融合蛋白的提取純化按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)GST-hSOX融合表達(dá)蛋白的工程菌DH5α-pGEX-2T-hSOX。誘導(dǎo)后的細(xì)菌離心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重懸細(xì)菌，超聲破碎細(xì)菌。破菌完全的超聲液按每毫升加入20微升的量加入PBS飽和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振搖結(jié)合30分鐘，10000rpm離心10分鐘沉淀結(jié)合了GST-hSOX的谷胱苷肽Sepharose4B，棄上清。按每毫升超聲液所得沉淀加入100μlPBACILLUS SP.的量清洗兩次，而后按每毫升超聲液所得沉淀加入10ul還原型谷胱苷肽洗脫液，室溫置10分鐘，10000rpm離心10分鐘，上清即為洗脫的融合蛋白。重復(fù)洗脫兩次。洗脫的上清保存于-80℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)純化效果。在44kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為hSOX蛋白。
實(shí)施例6hSOX蛋白或多肽在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)1．hSOX桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞株根據(jù)人hSOX的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.6)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在正反引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將hSOX cDNA在保證閱讀框架的前提下克隆至pVL1392載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)。鑒定好的表達(dá)載體3μg，野生型線性桿狀病毒DNA(BaculoGoldTMACMNPV DNA，Pharmingen，San Diego，CA)1μg和Lipofection(Gibco-BRL，NY)25μl，加入1ml無(wú)血清的昆蟲培養(yǎng)基中，振蕩15秒混勻，室溫孵育15分鐘備用。取1ml(2×106)Sf9昆蟲細(xì)胞懸液于60mm組織培養(yǎng)板中，貼壁1小時(shí)后換轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，室溫孵育15分鐘后棄培養(yǎng)基，加入前面制備好的DNA載體轉(zhuǎn)染混合物，Parafilm密封培養(yǎng)板，于室溫27℃振搖培養(yǎng)4小時(shí)，而后換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，收集上清備用。
2．轉(zhuǎn)入重組表達(dá)載體的昆蟲細(xì)胞株的篩選鑒定轉(zhuǎn)染3天后的昆蟲細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(2×106/1ml)，取1ml細(xì)胞懸液置于60mm組織培養(yǎng)皿中，加入3ml培養(yǎng)基，100μl收集的培養(yǎng)上清，貼壁1小時(shí)，棄2ml培養(yǎng)基，繼續(xù)室溫培養(yǎng)1小時(shí)，棄去所有的培養(yǎng)基，加入預(yù)熱的含20μl4％X-gal的3ml半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)5-7天后挑取白色細(xì)胞克隆于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)3-5天，而后吸取上清感染Sf9昆蟲細(xì)胞。
收集感染的細(xì)胞進(jìn)行Western鑒定。將細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后的膠于Pharmacia的MultiphorⅡ半干電轉(zhuǎn)移儀中將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，將硝酸纖維膜置于封閉液中封閉1小時(shí)，而后于抗hSOX的抗體溶液中封閉1小時(shí)，TBS液振搖清洗5分鐘共2次，而后將膜置于生物素標(biāo)記的抗hSOX一抗的第二抗體溶液中振搖1小時(shí)，TBS清洗，加入親和素-堿性磷酸酶復(fù)合物反應(yīng)30分鐘，TBS清洗2次，加入新鮮配制的顯色液顯色觀察蛋白條帶。
挑取高表達(dá)hSOX的Sf9細(xì)胞克隆。
3．hSOX蛋白的提取純化用高表達(dá)hSOX的Sf9細(xì)胞克隆的上清大量感染Sf9細(xì)胞，感染48小時(shí)后收集細(xì)胞，PBS洗滌。每2×108細(xì)胞加入20ml細(xì)胞裂解液(0.5％Triton X-100，20mM Na3PO4(磷酸鈉，pH7.8)，500mM NaCl，1mM Na3VO4(釩酸鈉)，1mM Pefabloc，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)破細(xì)胞，12000×g離心20min去除細(xì)胞碎片，上清按每2×108的細(xì)胞加入2ml NTA-瓊脂糖(Qiagen，Germany)，4℃吸附1小時(shí)。而后用含100nM咪唑的His緩沖液洗滌兩次，用含20mMN，N′二哌嗪，500mM NaCl，300mM咪唑的緩沖液洗脫以得到純化的蛋白。洗脫液保存于4℃，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)提取的hSOX蛋白的純度。在44kDa處的蛋白質(zhì)條帶即為hSOX蛋白。
實(shí)施例7抗人hSOX抗體的制備1．免疫小鼠和脾細(xì)胞的制備將實(shí)施例5和實(shí)施例6中獲得的hSOX蛋白用層析法進(jìn)行分離后備用，也可以用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中割下，并用等體積的完全Freund′s佐劑乳化。取6-8周齡Balb/C雌鼠，用50-100μg/0.2ml乳化過(guò)的蛋白，對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund′s佐劑乳化的同樣抗原對(duì)小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量再加強(qiáng)免疫一次，3-5天后用于融合。其中，脾細(xì)胞制備見鄂征主編，《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》，北京出版社，第210頁(yè)。
2．按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第371頁(yè)中的方法，制備飼養(yǎng)細(xì)胞。
3．按《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》(同上)，第213頁(yè)中的方法，進(jìn)行細(xì)胞融合。
4．抗體的檢測(cè)在細(xì)胞融合10-15天后，需逐孔進(jìn)行檢查，一旦發(fā)現(xiàn)旺盛的雜交細(xì)胞集落生長(zhǎng)，就應(yīng)用hSOX蛋白做抗體活性的初步篩選，常用的方法有免疫熒光試驗(yàn)、發(fā)射免疫試驗(yàn)(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。檢查出抗體活性的孔后，立刻進(jìn)行克隆培養(yǎng)，并分離出抗體。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請(qǐng)人國(guó)家人類基因組南方研究中心(ⅱ)發(fā)明名稱人肌氨酸氧化酶及其編碼序列(ⅲ)序列數(shù)目7(2)SEQ ID NO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度50bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.1GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT50(2)SEQ ID NO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度13bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.2AATTCGGCACGAG 13(2)SEQ ID NO.3的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度9bp(B)類型核苷酸
(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型寡核苷酸(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.3GCCGTGCTC(2)SEQ ID NO.4的信息(ⅰ).序列特征(A)長(zhǎng)度22bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ).分子類型寡核苷酸(ⅸ).序列描述SEQ ID NO.4TATGGCGGCTCAGAAAGATCTC22(2)SEQ ID NO.5的信息(ⅰ).序列特征(A)長(zhǎng)度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ).分子類型寡核苷酸(ⅸ).序列描述SEQ ID NO.5ACCCATCTCAAACGTCCTTGC21(2)SEQ ID NO.6的信息(ⅰ).序列特征(A)長(zhǎng)度1508bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ).分子類型寡核苷酸(ⅸ).序列描述SEQ ID NO.61TATGGCGGCT CAGAAAGATC TCTGGGACGC CATTGTGATT GGGGCGGGGA51TCCAGGGCTG CTTCACTGCA TACCACCTGG CCAAACACAG GAAGAGGATC101CTCCTGCTGG AGCAGTTCTT TCTACCACAC TCCCGAGGAA GCTCCCATGG151ACAAAGCCGG ATAATCCGAA AGGCGTACCT GGAAGACTTT TACACCCGGA201TGATGCATGA GTGCTATCAG ATATGGGCCC AGCTGGAGCA CGAGGCTGGA251ACCCAATTGC ACAGGCAGAC TGGATTACTG CTGCTGGGAA TGAAAGAGAA301TCAAGAATTA AAGACAATCC AGGCCAATCT GTCGAGGCAG AGGGTAGAAC351ACCAGTGTCT TTCATCTGAG GAACTGAAGC AACGTTTCCC AAATATTCGG401TTGCCCAGGG GAGAAGTGGG GCTCTTGGAC AATTCCGGAG GAGTTATCTA451TGCATATAAG GCCCTCAGAG CCCTGCAGGA TGCAATTCGA CAGCTAGGAG501GCATAGTGCG TGACGGAGAG AAGGTGGTGG AGATAAACCC AGGGCTACTG551GTCACGGTGA AAACCACCTC CAGGAGCTAC CAAGCTAAGA GCTTGGTCAT601CACAGCAGGT CCTTGGACCA ACCAGCTCCT CCGTCCCCTG GGCATTGAGA651TGCCTCTCCA GACCCTGCGG ATCAACGTGT GTTACTGGCG AGAGATGGTT701CCTGGGAGCT ATGGTGTGTC CCAGGCCTTT CCGTGCTTCC TGTGGCTGGG751CTTGTGTCCC CACCACATCT ACGGACTGCC CACAGGAGAG TACCCAGGGC801TGATGAAGGT CAGCTATCAC CACGGCAACC ACGCAGACCC TGAGGAGCGG851GACTGCCCCA CAGCACGCAC AGACATCGGA GACGTCCAGA TCCTGAGCAG901CTTTGTCAGA GATCACTTAC CTGATCTGAA GCCCGAGCCT GCTGTCATTG951AGAGCTGCAT GTACACGAAT ACCCCTGATG AGCAGTTCAT TCTCGATCGC1001 CACCCAAAGT ATGACAACAT TGTCATTGGT GCTGGATTCT CTGGGCACGG1051 GTTCAAGCTG GCCCCTGTGG TGGGGAAGAT CCTGTATGAA TTAAGCATGA1101 AATTAACACC ATCTTATGAC TTGGCACCTT TTCGAATCAG CCGTTTCCCA1151 AGCCTGGGCA AAGCCCACCT TTGACCTCTG GCCAGAAGCC TCCCTTCTGT1201 GCACAGGAGC CAGTTTCACA GATGGAGAAG ATGTCTCAGA TGAAGGGAGT1251 GTCCCTGAGA TATCATCCTT TTCTTCTGCC TCGCCTGAAT CCCCCATAAA1301 CACCAGATGA TTGAGTCTAC CTTCTTTCCT TGGCCCGCTC CCTTTTTCTT1351 CTGCCTCACT TGAATCCCCC GTAAACACCA GACGATTGAG TCTACCTTCT1401 TTTCTTGGCC ACCTCCCCAT TCACAACTAC TTTCTCGCTC CCAGAAGGTT1451 GATCAGATAT TCTACAATCA CAGAGTAGCA AGGACGTTTG AGATGGGT(2)SEQ ID NO.7的信息(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度390氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型多肽(ⅸ)序列描述SEQ ID NO.71 Met Ala Ala Gln Lys Asp Leu Trp Asp Ala Ile Val Ile Gly Ala16 Gly Ile Gln Gly Cys Phe Thr Ala Tyr His Leu Ala Lys His Arg31 Lys Arg Ile Leu Leu Leu Glu Gln Phe Phe Leu Pro His Ser Arg46 Gly Ser Ser His Gly Gln Ser Arg Ile Ile Arg Lys Ala Tyr Leu61 Glu Asp Phe Tyr Thr Arg Met Met His Glu Cys Tyr Gln Ile Trp76 Ala Gln Leu Glu His Glu Ala Gly Thr Gln Leu His Arg Gln Thr91 Gly Leu Leu Leu Leu Gly Met Lys Glu Asn Gln Glu Leu Lys Thr106 Ile Gln Ala Asn Leu Ser Arg Gln Arg Val Glu His Gln Cys Leu121 Ser Ser Glu Glu Leu Lys Gln Arg Phe Pro Asn Ile Arg Leu Pro136 Arg Gly Glu Val Gly Leu Leu Asp Asn Ser Gly Gly Val Ile Tyr151 Ala Tyr Lys Ala Leu Arg Ala Leu Gln Asp Ala Ile Arg Gln Leu166 Gly Gly Ile Val Arg Asp Gly Glu Lys Val Val Glu Ile Asn Pro181 Gly Leu Leu Val Thr Val Lys Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Gln Ala196 Lys Ser Leu Val Ile Thr Ala Gly Pro Trp Thr Asn Gln Leu Leu211 Arg Pro Leu Gly Ile Glu Met Pro Leu Gln Thr Leu Arg Ile Asn226 Val Cys Tyr Trp Arg Glu Met Val Pro Gly Ser Tyr Gly Val Ser241 Gln Ala Phe Pro Cys Phe Leu Trp Leu Gly Leu Cys Pro His His256 Ile Tyr Gly Leu Pro Thr Gly Glu Tyr Pro Gly Leu Met Lys Val271 Ser Tyr His His Gly Asn His Ala Asp Pro Glu Glu Arg Asp Cys286 Pro Thr Ala Arg Thr Asp Ile Gly Asp Val Gln Ile Leu Ser Ser301 Phe Val Arg Asp His Leu Pro Asp Leu Lys Pro Glu Pro Ala Val316 Ile Glu Ser Cys Met Tyr Thr Asn Thr Pro Asp Glu Gln Phe Ile331 Leu Asp Arg His Pro Lys Tyr Asp Asn Ile Val Ile Gly Ala Gly346 Phe Ser Gly His Gly Phe Lys Leu Ala Pro Val Val Gly Lys Ile361 Leu Tyr Glu Leu Ser Met Lys Leu Thr Pro Ser Tyr Asp Leu Ala376 Pro Phe Arg Ile Ser Arg Phe Pro Ser Leu Gly Lys Ala His Leu
權(quán)利要求
1．一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hSOX蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列雜交。
2．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQ IDNO.7所示的序列的多肽。
3．如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列。
4．一種分離出的人hSOX蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.7氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5．如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.7序列的多肽。
6．一種載體，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA。
7．一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8．一種產(chǎn)生具有人hSOX蛋白質(zhì)活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(1)將編碼具有人hSOX蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人hSOX蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.6中從核苷酸第2-1171位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人hSOX蛋白的重組細(xì)胞；(3)在適合表達(dá)人hSOX蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(2)中的重組細(xì)胞；(4)分離出具有人hSOX蛋白活性的多肽。
9．一種能與權(quán)利要求7所述的人hSOX蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
10．一種核酸分子，其特征在于，它包含權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在人體正常腎上腺組織中表達(dá)的新的人肌氨酸氧化酶hSOX及其編碼序列,本發(fā)明還提供了該蛋白和核酸序列的制備方法,以及在樣品中檢測(cè)hSOX核酸序列和多肽的方法。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1285404SQ99118058
公開日2001年2月28日 申請(qǐng)日期1999年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月18日
發(fā)明者錢斌治, 黃秋花, 黃長(zhǎng)輝, 屠越峰, 韓澤廣, 陳竺 申請(qǐng)人:國(guó)家人類基因組南方研究中心