專利名稱：：誘導(dǎo)保護性應(yīng)答的登革病毒衣殼蛋白以及藥物組合物的制作方法誘導(dǎo)保護性應(yīng)答的登革病毒衣殼蛋白以及藥物組合物本發(fā)明涉及生物技術(shù)和制藥工業(yè)領(lǐng)域，特別是涉及獲得能夠誘導(dǎo)針對登革病毒(從現(xiàn)在開始稱為DEN)感染的免疫應(yīng)答的蛋白質(zhì)，同時避免在重新感染這種病毒的個人中描述的抗體依賴性增強現(xiàn)象。登革熱(DF)和登革出血熱(DHF)作為健康問題而獲得越來越大的重要性，其影響幾個熱帶和亞熱帶地區(qū)的國家。登革病毒已在超過IOO個國家中發(fā)現(xiàn)，并且估計有2500百萬人生活在危險區(qū)域內(nèi)。每年報道50-100百萬例DF和250000-500000例DHF。(Guzn^nM.G.和KouriG.2002.Dengue:anupdate.LancetInfect.Dis.2:33-42)。這種疾病的致病劑是黃病毒科黃病毒屬的登革病毒，所其通過埃及伊蚊Medesae^Fp〃)傳播(LeyssenP.，DeClercoE.，NeytsJ.2000.PerspectivesforthetreatmentofinfectionswithFlaviviridae.Clin.Microbiol.Rev.13:67-82)。迄今為止已報道了可以在相同區(qū)域中傳播的4種血清型。登革病毒是正RNA包被病毒，其基因組僅包含1個讀碼框。該RNA被翻譯成多蛋白，所述多蛋白被加工成3個結(jié)構(gòu)蛋白和7個非結(jié)構(gòu)蛋白。(RussellP丄，BrandtW.E.，DalrympleJ.M.1980.Chemicalandantigenicstructureofflaviviruses.Thetogaviruses:biology,structure,replication.SchelesingerR.W.(ed.).503-529)。已進行多個流行病學調(diào)查以確定造成登革疾病的最嚴重形式的危險因素。它的特征在于高熱、液體外滲、出血和最終地登革休克。(GublerD.J.1998.DengueandDengueHemorrhagicFever.Clin.Microbiol.Rev.11:480-496)。最重要的危險因素之一是經(jīng)由異源血清型的繼發(fā)感染。不存在不同血清型感染間的交叉保護。UouriG.，Guzm6nM.G.，BravoJ.，TrinaC.1989.Denguehemorrhagicfever/dengueshocksyndrome:lessonsfromtheCubanepidemic.WHOBulletin0MS.67:375-380)。存在幾種假設(shè)以解釋這種現(xiàn)象。最重要的一種是抗體依賴性增強。(HalsteadS.B.，ScanlonJ.E.，UmpaivitP.，UdomsakdiS.1969.DengueandChikungunyavirusinfectionin歸ninThailand,1962-1964.IV.EpidemiologicstudiesintheBangkokmetropolitanarea.Am.J.Trop.Med.Hyg.18:997-1021)。根據(jù)初步研究，提出DEN病毒在來自患者血液的外周單核細胞中更大量地復(fù)制，所述患者已經(jīng)歷該病毒的先前感染(HalsteadS.B.，O，RourkeE.J.，AllisonA.C.1977.Denguevirusesandmononuclearphagocytes.II.Identityofbloodandtissueleukocytessupportinginvitroinfection.J.Exp.Med.146:218-229)。后來，證實殘留抗體負責這種效應(yīng)(MorensDM,HalsteadSB,MarchetteNJ.1987.Profilesofantibody-dependentenhancementofdenguevirustype2infection.MicrobPathog.Oct;3(4):231-7)。在其中不存在中和的抗體特異性或濃度的條件下，抗體-病毒復(fù)合物可以被在膜中呈現(xiàn)Fey受體的細胞如單核細胞和巨噬細胞內(nèi)在化。稱為抗體依賴性增強(antibodydependenhancement,ADE)的這種機制在繼發(fā)感染期間出現(xiàn)(MorensDM,HalsteadSB,MarchetteNJ.1987.Profilesofantibody-dependentenhancementofdenguevirustype2infection.MicrobPathog.Oct;3(4):231-7;KliksS.C.，Nim,nityaS.，NisalakA.,BurkeD.S.1988.Evidencethatmaternaldengueantibodiesareimportantinthedevelopmentofdenguehemorrhagicfeverininfants.Am.J.Trop.Med.Hyg.38:411-419)。Halstead等人(HalsteadS.B.,ScanlonJ.E.，UmpaivitP.，UdomsakdiS.1969.DengueandChikungunyavirusinfectioninmaninThailand,1962—1964.IV.EpidemiologicstudiesintheBangkokmetropolitanarea.Am.J.Trop.Med.Hyg.18:997-1021)在泰國曼谷進行的3年研究中報道，在兒童中由于DEN感染的住院指數(shù)在7-8個月大的那些中達到最大。這些指數(shù)是在1-3個月的兒童中觀察到的4-8倍，并且是在3歲兒童中的2倍。Kliks等人(KliksS.C.，NimmannityaS.，NisalakA.，BurkeD.S.1988.Evidencethatmaternaldengueantibodiesareimportantinthedevelopmentofdenguehemorrhagicfeverininfants.Am.J.Trop.Med.Hyg.38:411-419)確定了針對DEN-2的母體中和抗體滴度與具有由同源病毒感染引起的DHF的13位兒童的年齡之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，當母體抗體水平減少至亞中和水平時，出現(xiàn)該病毒感染的嚴重病例。這些數(shù)據(jù)與這樣的假設(shè)相一致，該假設(shè)為母體抗體具有雙重作用，即首先防護和隨后刺激DHF發(fā)展。盡管具有這種免疫學現(xiàn)象，但現(xiàn)今全世界最先進的疫苗候選物基于包含包膜蛋白的4種不同血清型的減毒病毒。這些候選物在人志愿者中能夠誘導(dǎo)針對暴露的蛋白質(zhì)(PrM/M和包膜)的潛在擴大性抗體和針對4種病毒血清型的保護性中和抗體。(Kanesa-thasanN.，SunW.,Kim-AhnG.，VanAlbertS.,PutnakJ.R.，KingA.，RaengsakulsrachB.，Christ-SchmidtH.,GilsonK.，ZahradnikJ.M.,VaughnD.W.，InnisB丄，SaluzzoJ.F.yHokeC.H.2001.Safetyandimmunogenicityofattenuateddenguevirusvaccines(AventisPasteur)inhumanvolunteers.Vaccine.19:3179-3188)。盡管誘導(dǎo)了增強抗體，但是免疫接種后高水平的中和抗體仍可以防止病毒復(fù)制。當就中和抗體而言對于疫苗中的4種血清型的總血清轉(zhuǎn)化未獲得或者在血液中減少至低水平時，該問題可以出現(xiàn)，并且隨后個體將變得對于由其保護性抗體不存在的病毒血清型引起的嚴重繼發(fā)感染易感。事實上，已在猴和人中進行了幾種測試以確定疫苗制劑中的病毒量。(GuirakhooF.，ArroyoJ.，PugachevK.V.，MillerC.,ZhangZ.-X.，WeltzinR.,GeorgakopoulosK.，CatalanJ.，0cranS.,SoikeK.,RaterreeM.，MonathT.P.2001.Construction,safety,andimmunogenicityinnonhumanprimatesofachimericyellowfever-denguevirustetravalentvaccine.J.Virol.75:7290-7304)。在某些情況下，未獲得關(guān)于4種血清型的血清轉(zhuǎn)化平衡(SabchareonA，LangJ，ChanthavanichP,YoksanS，F(xiàn)orratR，AttanathP，SirivichayakulC，PengsaaK，Pojjaroen-AnantC，ChokejindachaiW，JagsudeeA，SaluzzoJF，BhamarapravatiN.2002.Safetyandimmunogenicityoftetravalent1ive-attenuateddenguevaccinesinThaiadultvolunteers:roleofserotypeconcentration,ratio,andmultipledoses.AmJTropMedHyg.66(3):264-72)。此外，在兒童中對于就中和抗體而言的總血清轉(zhuǎn)化必需施用高達3次劑量的減毒疫苗，并且這些是否將長期持續(xù)仍是未知的。(SabchareonA，LangJ，ChanthavanichP,YoksanS，F(xiàn)orratR,AttanathP，SirivichayakulC，PengsaaK,Pojjaroen-AnantC,ChambonneauL，SaluzzoJF，BhamarapravatiN…2004.Safetyandimmunogenicityofathreedoseregimenoftwotetravalent1ive-attenuateddenguevaccinesinfive—totwelve-year-oldThaichildren.PediatrInfectDisJ.;23(2):99-109)。在包含登革病毒的包膜蛋白的疫苗制劑中，從而在開發(fā)中的疫苗候選物中，這是最值得懷疑的關(guān)注之一。目前在I/II期中的減毒疫苗的另一個缺點是安全性。已在幾項研究中證實了，第一次劑量后，在成人和兒童中存在不良反應(yīng)例如發(fā)熱、肌痛、癡斑和頭痛(SabchareonA,LangJ，ChanthavanichP，YoksanS，F(xiàn)orratR，AttanathP，SirivichayakulC,PengsaaK，Pojjaroen-AnantC，ChambonneauL,SaluzzoJF，BhamarapravatiN.2004.Safetyandimmunogenicityofathreedoseregimenoftwotetravalent1ive-attenuateddenguevaccinesinfive-totwelve—year—oldThaichildren.PediatrInfectDisJ.;23(2):99-109)。一般而言，可能出現(xiàn)與活疫苗潛在相關(guān)的毒力回復(fù)現(xiàn)象。在新的備選方案的研究中，已開發(fā)了通過重組方法獲得的基于包膜蛋白或其片段的疫苗候選物的不同變體。這些重組候選物避免了與活病毒接種相關(guān)的安全性問題，并且如果沒有誘導(dǎo)針對4種血清型的平衡應(yīng)答，那么能夠使個體致敏(VelzingJ，GroenJ,DrouetMT，vanAmerongenG，CopraC,OsterhausAD，DeubelV.1999.InductionofprotectiveimmunityagainstDenguevirustype2:comparisonofcandidateliveattenuatedandrecombinantvaccines.Vaccine.Mar17;17(11-12):1312-20)。另一方面，這些候選物需要強效的佐劑一一關(guān)于其在人中的使用仍未獲得批準一一以刺激血清型特異性的合適的保護性免疫應(yīng)答(HermidaL,RodriguezR，LazoL，SilvaR，ZuluetaA，ChineaG，LopezC,GuzmanMG，GuillenG.2004.Adengue-2EnvelopefragmentinsertedwithinthestructureoftheP64kmeningococcalproteincarrierenablesafunctionalimmuneresponseagainstthevirusinmice.JVirolMethods.2004Jan;115(1):41-9)。中和抗體的體液應(yīng)答已在動物中得到廣泛研究，并且其保護效應(yīng)已得到證實。在登革熱中作為保護機制的細胞毒性細胞免疫應(yīng)答仍未深入探究。相反地，存在幾個報道，其中證實了細胞應(yīng)答的誘導(dǎo)與疾病的最嚴重形式之間的關(guān)聯(lián)(RothmanA.L.yEnnisF.A.1999.I鵬unopathogenesisofDengueHemorragicFever.Virology.257:1-6)。這些研究基于在顯示出DHF的那些個體中存在高水平的激活的T-細胞(GreenS，PichyangkulS，VaughnDW，KalayanaroojS，NimmannUyaS，NisalakA，KuraneI，RothmanAL，EnnisFA.1999.EarlyCD69expressiononperipheralMoodlymphocytesfromchildrenwithdenguehemorrhagicfever.JInfectDis.180(5):1429-35)。已報道T-細胞表位主要在非結(jié)構(gòu)蛋白中(KuraneI，ZengL,BrintonMA，ErmisFA.1998.DefinitionofanepitopeonNS3recognizedbyhumanCD4+cytotoxicTlymphocyteclonescross-reactivefordenguevirustypes2，3，and4.Virology.1998Jan20;240(2):169-74)，但也存在于包膜和衣殼蛋白中(Bukowski，J.F.，I.Kurane，C.-J.Lai，M.Bray,B.Falgout和F.A.Emiis.1989.Denguevirus-specificcross-reactiveCD8humancytotoxicTlymphocytes.J.Virol.63:50865091;Gag纖S.J.，ZengW.，KuraneI.，EnnisF.A.1996.Identificationoftwoepitopesonthedengue4viruscapsidproteinrecognizedbyaserotype-specificandapanelofserotype-cross-reactivehumanCD4+cytotoxicT-lymphocyteclones.JVirol.70:141-147)。然而，通過僅i秀導(dǎo)細胞免疫應(yīng)答的這些蛋白質(zhì)中的一些蛋白質(zhì)的保護特性仍未得到證實。在避免免疫增強現(xiàn)象的疫苗候選物的研究中，已進行了使用非結(jié)構(gòu)蛋白NSl和NS3的研究。在NS1的情況下，在用重組蛋白質(zhì)免疫的小鼠中已達到了一定水平的保護。通過ADCC機制，使用包含NSl基因的棵露DNA已獲得了類似結(jié)果(WuSF，LiaoCL，LinYL，YehCT，ChenU，H畫gYF,ChouHY，H醒gJL,ShaioMF,SytwuHK.2003.Evaluationofprotectiveefficacyandimmunemechanismsofusinganon-structuralproteinNSlinDNAvaccineagainstdengue2virusinmice.Vaccine.Sep8;21(25-26):3919-29)。然而，還存在這樣的報道，即由于誘導(dǎo)識別人內(nèi)皮細胞的抗體，它們可能涉及自身免疫現(xiàn)象(Chiou-FengLin,H磁-YaoUi，Ai-LiShiau，Hsiao-ShengLiu，Trai-MingYeh，Shun-HuaChen,Ching-ChuanUu，Shu-ChenChiu和Yee-ShinUn.2002.Endothelia1Cel1ApoptosisInducedbyAntibodiesagainstDengueVirusnonstructuralProtein1viaProductionofNitricOxide.J.Immunol.657-664)。此外，存在使用包含NS3基因的棵露DNA制劑獲得了保護的報道；然而，證實了這種保護由產(chǎn)生的抗體介導(dǎo)，因為使用被動免疫接種獲得了相同的保護(TanCH，YapEH,SinghM,DeubelV,ChanYC.1990.Passiveprotectionstudiesinmicewithmonoclonalantibodiesdirectedagainstthenon-structuralproteinNS3ofdengue1virus.JGenVirol.1990Mar;71(Pt3):745-9)。此外，值得注意的是這樣的假設(shè)，即基于NS3蛋白表位的研究，對于異源病毒感染來說細胞應(yīng)答可以潛在地有害(ZivnyJ，DeFronzoM,JarryW，JamesonJ，CruzJ,EnnisFA，RothmanAL.1999.PartialagonisteffectinfluencestheCTLresponsetoaheterologousdenguevirusserotype.JImmunol.Sepl;163(5):2754-60)。在登革病毒的衣殼蛋白的情況下，沒有報道在使用致死登革病毒的攻擊中具有保護的證據(jù)。關(guān)于相關(guān)的黃病毒，公開了其中作者用包含日本腦炎(JE)衣殼蛋白的基因的棵露DNA制劑接種小鼠的報道。這種制劑在小鼠中不誘導(dǎo)針對使用致死JE攻擊的保護性應(yīng)答，盡管證實了細胞毒性應(yīng)答(KonishiE，AjiroN，NukuzumaC，MasonPW，KuraneI.2003.ComparisonofprotectiveefficaciesofplasmidDNAsencodingJapaneseencephalitisvirusproteinsthatinduceneutralizingantibodyorcytotoxicTlymphocytesinmice.Vaccine.Sep8;21(25-26):3675-83)。使用重組衣殼蛋白的保護僅在人乳頭瘤病毒的情況下得到證實。然而，已提出它關(guān)于其他病毒如丙型肝炎病毒的保護作用。不過，在所有情況下，它們是慢性感染或腫瘤，其中細胞的細胞毒性應(yīng)答是免疫系統(tǒng)清除病毒感染的唯一手段(Duenas-CarreraS，Alvarez-LajonchereL，Alvarez-0bregonJC，HerreraA,LorenzoU,PichardoD，MoralesJ.2000.AtruncatedvariantofthehepatitisCviruscoreinducesaslowbutpotentimmuneresponseinmicefollowingDNAimmunization.Vaccine.Nov22;19(7-8):992-7;SuzichJA，GhinSJ，Palmer-Hi11FJ，等人，1995.SystemicimmunizationwithpapillomavirusLIproteincompletelypreventsthedevelopmentofviralmucosalpapillomas.ProcNatlAcadSciUSA;92:11553-57)。這些疾病與在人中的登革感染所顯示的急性特征不一致(VaughnD.W.，GreenS.，KalayanaroojS.，ImiisB丄，NimmamiityaS.，SuntayakornS.，EndyT.P.，RaengsakulrachB，，RothmanA丄，EnnisF.A.yNisalakA.2000.Dengueviremiatiter,antibodyresponsepattern,andvirusserotypecorrelatewithdiseaseseverity.JInfectDis.181:2-9)。登革病毒的衣殼蛋白具有9-12kDa(112-127個氨基酸)的分子量，并且具有顯著的堿性特征，因為它的25%氨基酸是精氨酸和賴氨酸。由于多陽離子肽做到這點的能力，這些氨基酸的存在可以有利于向免疫系統(tǒng)呈遞抗原。(LingnauK.，EgyedA.，SchellackC.，MattnerF，BuschleM.,SchmidtW.2002.Poly-l一argininesynergizeswitholigodeoxynucleotidescontainingCpG-motifs(CpG-0DN)forenhancedandprolongedimmuneresponsesandpreventstheCpG-ODN-inducedsystemicreleaseofpro—inflammatorycytokines.Vaccine.20:3498-3508)。該蛋白質(zhì)完全位于病毒粒子結(jié)構(gòu)內(nèi)而無任何暴露區(qū)域(KuhnRJ,ZhangW，RossmannMG，PletnevSV,CorverJ，LenchesE，JonesCT，MukhopadhyayS，ChipmanPR，StraussEG,BakerTS，StraussJH.2002.Structureofdenguevirus:implicationsforflavivirusorganization,maturation,andfusion.Cell,Mar8;108(5):717-25)。Jones等人(ChristopherT.Jones,LixinMa，JohnW.Burgner，TeresaD.Groesch，CarolB.Post和RichardJ.Kuhn.2003.FlavivirusCapsidIsaDimericAlpha-HelicalProtein.JournalofVirology,第7143-7149頁，第77巻，No.12)純化了在大腸桿菌(^yc力er/c力/aco//)中通過重組方法獲得的VD2的衣殼蛋白，并且證實這種蛋白質(zhì)在不存在核酸的情況下在溶液中的表現(xiàn)如同二聚體。它的二級結(jié)構(gòu)主要是a-螺旋的形式，并且由這些螺旋中的4個組成，在C-末端發(fā)現(xiàn)長度更長的螺旋。N-末端不呈現(xiàn)確定的結(jié)構(gòu)，并且它的刪除不影響該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性。本發(fā)明首次描述了，通過重組方法在大腸桿菌中獲得且僅具有40%純度的DEN-2病毒的衣殼能夠在小鼠中誘導(dǎo)針對用致死DEN-2病毒的攻擊的保護性免疫應(yīng)答。證實了這種高度純化的蛋白質(zhì)保留了其保護能力，所述保護能力在用顆粒形式的分子免疫接種小鼠中被超過。此外，證實了所達到的保護由CD8+T-細胞介導(dǎo)，考慮到目前為止報道的關(guān)于衣殼的T-細胞表位由CD4+T細胞識別，這是新型元素(GagnonSJ，ZengW，KuraneI，EnnisFA.1996.Identificationoftwoepitopesonthedengue4viruscapsidproteinrecognizedbyaserotype-specificandapanelofserotype-cross-reactivehumanCD4+cytotoxicT-lymphocyteclones.JVirol.70(1):141-7;SimmonsCP，DongT，ChauNV，DungNT,ChauTN，ThaoleTT，DungNT,HienTT，Rowland-JonesS，F(xiàn)arrarJ.2005.EarlyT一cellresponsestodenguevirusepitopesinVietnameseadultswithsecondarydenguevirusinfections.JVirol.79(9):5665-75)。此外，將這種重組分子與PD5蛋白相混合，所述PD5蛋白由腦膜炎奈'H氏球菌(We/sser/a邁e/H./]^7t/c^s0的P64k蛋白和登革-2病毒的包膜蛋白的III結(jié)構(gòu)域形成。這種融合蛋白能夠產(chǎn)生高度血清型特異性的、保護性的和中和性的免疫應(yīng)答，具有產(chǎn)生抗體依賴性增強現(xiàn)象的低可能性(HermidaL,RodriguezR，LazoL，SilvaR，ZuluetaA,ChineaG，LopezC，GuzmanMG，GuillenG.2004.Adengue-2EnvelopefragmentinsertedwithinthestructureoftheP64kmeningococcalproteincarrierenablesafunctionalimmuneresponseagainstthevirusinmice.JVirolMethods.2004Jan;115(1):41-9)。還描述了獲得通過使衣殼蛋白與包膜蛋白的III結(jié)構(gòu)域融合而形成的遺傳構(gòu)建體以達到相同目的。因此，其中衣殼與DEN-2的III結(jié)構(gòu)域相組合的這2種制劑在小鼠中產(chǎn)生比單獨的衣殼更高的淋巴組織增生性應(yīng)答，并且另外，產(chǎn)生比單獨的PD5更高的血清型特異性抗體應(yīng)答。后面這個結(jié)果證實登革病毒的衣殼蛋白在通過異源抗原的抗體產(chǎn)生中的免疫增強能力，這是對于來自其他病毒如乙型肝炎病毒的其他重組衣殼所描述的現(xiàn)象(AlvarezJC，Guill紐G.Formulationscontainingviruslikeparticlesasimmunoenhancersbymucosalroute.CubanofficeoftheIndustrialproperty.CU1998/183)。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是獲得相應(yīng)于登革病毒的衣殼蛋白的重組蛋白質(zhì)，所述重組蛋白質(zhì)當在小鼠中接種時產(chǎn)生針對用致死病毒感染的保護性應(yīng)答。將編碼登革病毒的衣殼蛋白的基因插入包含噬菌體T5啟動子的質(zhì)粒中。用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞we表達高水平的所得到的蛋白質(zhì)。將這種蛋白質(zhì)大約純化至40%的純度，并且在氫氧化鋁中佐劑化(adjuvated)以在Balb/c小鼠中進行接種。最后1次劑量后1個月，測量抗病毒抗體應(yīng)答。同時測定在體外用登革病毒刺激的脾中的淋巴組織增生性應(yīng)答。結(jié)果，沒有誘導(dǎo)抗病毒抗體，而是檢測到顯著的淋巴組織增生性應(yīng)答。平行地，在未出血的小鼠中，進行保護測定法。接種相應(yīng)于100LD5。的登革病毒的致死劑量，并在21天期間觀察疾病癥狀和死亡。結(jié)果，在經(jīng)免疫的小鼠中獲得44.4%的存活，而在陰性對照組中所有小鼠都死亡。這是通過僅用衣殼蛋白的免疫接種而產(chǎn)生針對登革病毒的保護性應(yīng)答的第一個證據(jù)。隨后，進行高分辨率的純化過程，獲得純度>95%的重組蛋白質(zhì)。2種制劑即半純化的和純化的制劑通過HPLC進行分析，以了解每種樣品中的蛋白質(zhì)聚集狀態(tài)。在半純化的制劑中檢測到具有更少保留時間的級分，而在純化的樣品中檢測到相應(yīng)于二聚體形式的分子的保留時間。為了在純化的變體中獲得聚集狀態(tài)，進行使用少量寡核苷酸的體外顆?；^程。由于該過程，獲得了直徑21nm的顆粒。均具有超過95%純度的二聚化和顆?；闹苿┰谛∈笾羞M行接種。二聚化制劑用弗氏佐劑和氫氧化鋁進行佐劑化，而顆粒化的變體僅用氫氧化鋁進行佐劑化。類似于半純化的制劑，檢測到高水平的淋巴組織增生。在保護測定法中，用由弗氏佐劑和氫氧化鋁佐劑化的二聚化制劑分別獲得40和20%的存活；然而，用氫氧化鋁佐劑化的顆?；鞍踪|(zhì)誘導(dǎo)更高的保護百分比。這些結(jié)果連同用半純化的蛋白質(zhì)獲得的那些結(jié)果一起顯示了衣殼蛋白在Balb/c小鼠中誘導(dǎo)保護性應(yīng)答的能力，并且證實了顆粒化形式的蛋白質(zhì)的優(yōu)越性，使得其可連同作為佐劑的氫氧化鋁一起在未來用于人類。此外，未誘導(dǎo)抗病毒應(yīng)答將消除抗體依賴性增強現(xiàn)象，其作為關(guān)于出現(xiàn)疾病的最嚴重形式(登革出血熱)的危險因素。為了確定保護的可能機制(由于其證實不存在，所以所述機制與抗體的誘導(dǎo)無關(guān))，進行CD8+細胞耗竭的研究。結(jié)果，用每種變體的純化蛋白質(zhì)而達到的保護依賴于呈現(xiàn)這種標記物的細胞的存在，因為當消除它們時，誘導(dǎo)的保護效應(yīng)消失。類似地，進行研究以了解顆粒化的重組衣殼與誘導(dǎo)體液應(yīng)答的抗原的組合是否不影響淋巴組織增生性應(yīng)答的產(chǎn)生，并且計數(shù)能夠促成免疫應(yīng)答的這2種分支的免疫原混合物。為此，在小鼠中接種衣殼的純化的顆粒化變體和包含登革-2病毒的包膜蛋白的III結(jié)構(gòu)域的融合蛋白，所述小鼠能夠產(chǎn)生減少ADE現(xiàn)象的血清型特異性的免疫應(yīng)答(HermidaL,RodriguezR，LazoL,SilvaR,ZuluetaA，ChineaG，LopezC，GuzmanMG，GuillenG.2004.Adengue-2EnvelopefragmentinsertedwithinthestructureoftheP64kmeningococcalproteincarrierenablesafunctionalimmuneresponseagainstthevirusinmice.JVirolMethods.2004Jan;115(1):41-9)。當施用3次劑量并分析產(chǎn)生的抗體時，證實了抗病毒的血清型特異性抗體的更高誘導(dǎo)。同樣地，檢測到比僅由衣殼誘導(dǎo)的那種更高且比由該融合蛋白誘導(dǎo)的那種顯著更高的淋巴組織增生性應(yīng)答。平行地，為了了解使用這2種抗原的基因融合物是否能夠獲得組合效應(yīng)，構(gòu)建了包含DEN-2病毒的包膜蛋白的III結(jié)構(gòu)域(其與衣殼蛋白基因的N-末端融合)的質(zhì)粒。所得到的具有40%純度的蛋白質(zhì)在Balb/c小鼠中產(chǎn)生比由單獨的衣殼誘導(dǎo)的那種更高的淋巴組織增生性應(yīng)答，和產(chǎn)生比由PD5誘導(dǎo)的那種更高的血清型特異性抗體應(yīng)答。附圖描述圖1.DEN-2病毒的衣殼蛋白的克隆策略以產(chǎn)生PDC-2。DEN2C:DEN-2的衣殼蛋白的片段。圖2.在15%的PDC-2半純化過程時通過SDS-PAGE的分析。1.破裂上清液。2和3.不吸附至(^e/7力aro"尸,的級分。4.用NaCl1M洗脫的級分。圖3.在15%的PDC-2半純化過程時通過SDS-PAGE的分析。1.破裂上清液。2.不吸附至凝膠的級分。3.洗滌的(350mMNaCl)。4.洗脫的級分(750mMNaCl)。5.在TrislOmM，EDTA1mM中的級分。圖4.半純化的(A)和純的(B)PDC-2制劑在Superdex200中的色譜圖。圖5.在用寡核苷酸處理前(A)和后(B)，純的PDC-2制劑的電子顯微鏡照片。圖6.DEN-1病毒的衣殼蛋白的克隆策略以產(chǎn)生PDC-1。DEN1C:DEN-1的衣殼蛋白的片段。圖7.在15%的PDC-1半純化過程時通過SDS-PAGE的分析。1.分子量標準。2.破裂上清液。3.不吸附至(？Sep力ar"e的級分。實施例實施例1.PDC-2的克隆和表達。使用在序列表中被標識為序列號1和序列號2的寡核香酸從DEN-2病毒株基因型Jamaica中擴增編碼來自DEN-2病毒的衣殼蛋白的氨基酸1一99的核苷酸序列(序列號3)(DeubelV.，KinneyR.M.，TrentD.W.NucleotidesequenceanddeducedaminoacidsequenceofthenonstructuralproteinsofDenguetype2virus,Jamaicagenotype:Comparativeanalysisofthefull-lengthgenome.Virology1988.165:234-244)。通過用5a/^//iWj3cT/i7消化質(zhì)粒pQE-30(序列號6)來制備栽體，所述質(zhì)粒pQE-30包含噬菌體T5啟動子和在N-末端區(qū)域中的6-組氨酸尾。連接后，通過限制酶消化來分析潛在的重組體，并且對陽性克隆進行測序以檢查連接狀況。用稱為pDC-2的所選克隆(圖1和序列號4)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞XL-1Blue(HanahanD.1983.Studiesontransformationofi^c力e"'c力/aco"withplasmids.J.Mol.Biol.166:557-580)。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌林在補充有50pg/mL氨節(jié)青霉素的LuriaBertani培養(yǎng)基(LB)中于37。C培養(yǎng)10小時。終濃度為1mM的異丙基-^D-吡喃硫代半乳糖苷(IPTG)用于誘導(dǎo)啟動子。菌落生長后，進行細胞裂解物的SDS-PAGE。結(jié)果獲得15-kDA條帶。蛋白質(zhì)通過抗DEN-2超免疫腹水(HMAF)進行識別。將這種蛋白質(zhì)命名為PDC-2(序列號5)。實施例2.PDC-2的半純化和表征。將從用pDC-2轉(zhuǎn)化并于37X:生長的大腸桿菌菌林中獲得的生物量通過弗氏壓碎器進行破壞。獲得重組蛋白質(zhì)，在可溶性和不溶性級分之間相等地分布。使用Q^e;力"o"尸尸柱和緩沖液Tris10mMpH8，對可溶性級分實施陰離子交換色語法。存在于非吸附級分中的蛋白質(zhì)以40%的純度被獲得，并用于免疫學研究(圖2)。實施例3.半純化的PDC-2的免疫學評估。使用3組30只Balb/c小鼠。其中的2組用10ug重組蛋白質(zhì)通過腹膜內(nèi)途徑進行免疫，在一個組中使用弗氏佐劑(FA)和在另一個組中使用氫氧化鋁。將用FA佐劑化的由于經(jīng)pQE-30轉(zhuǎn)化的細胞破裂而獲得的可溶性級分用作陰性對照；10只動物在第3次劑量后15天進行抽血，并且通過ELISA測定針對DEN-2的抗體滴度。在用任一種佐劑中配制的重組蛋白質(zhì)進行免疫接種后，沒有獲得抗體滴度。表l.在用半純化的PDC-2免疫接種小鼠后獲得的血清中針對DEN-2的抗體滴度。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>實施例4.^呆護測定法。為了評估通過用所述變體免疫接種而賦予給小鼠的針對用致死的同源DEN病毒攻擊的保護，使用來自用吸附在氫氧化鋁中的重組蛋白質(zhì)和用對照制劑免疫的每個組的10只小鼠。每只動物通過顱內(nèi)接種接受100LDs。的致死DEN-2病毒的劑量，并且觀察21天以獲得關(guān)于由于病毒性腦炎死亡的致死率百分比。作為陽性對照，使用由感染性DEN-2病毒(104pfu)免疫的一組10只小鼠。陽性對照組中的所有小鼠都存活，而陰性對照組中的所有小鼠都在攻擊后第7-11天時生病，并且到第21天時獲得100%的死亡率。最后，用重組蛋白質(zhì)PDC-2免疫的組呈現(xiàn)出44.4%的保護(表2)。表2.用同源的致死登革病毒攻擊后在經(jīng)PDC-2免疫的小鼠中的存活百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>*計算為(存活者數(shù)目)/(小鼠總數(shù)目)。存活者的數(shù)據(jù)在攻擊后21天獲取。實施例5.淋巴組織增生性應(yīng)答。在最后l次劑量后30天處死來自用由氫氧化鋁佐劑化的衣殼蛋白進行免疫的組的其余動物。隨后，取出它們的脾并且研究針對DEN-2的淋巴組織增生性應(yīng)答。表3中的結(jié)果顯示了獲得的刺激指數(shù)。表3.來自經(jīng)免疫小鼠的淋巴細胞的針對同源血清型的刺激指數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>7*刺激指數(shù)關(guān)于DNA自發(fā)合成，樣品的每分鐘計數(shù)與對照的每分鐘計數(shù)的商平均值。**從受DEN-2感染的小鼠腦中制備。***從未受感染的小鼠腦中制備。****促分裂原，植物凝集素(陽性對照)。實施例6.PDC-2的純化。將從用pDC-2轉(zhuǎn)化并于37C生長的大腸桿菌菌林中獲得的生物量通過弗氏壓碎器進行破壞。獲得重組蛋白質(zhì)，在可溶性和不溶性級分之間相等地分布。使用SP-Se/7力arose尸尸柱和緩沖液Tris10mM，Tween0.5%,尿素7M，pH8,對可溶性級分實施陽離子交換色i普法。柱用緩沖液二乙醇胺30mM，NaCl350mM,pH10.3進行洗滌。用緩沖液二乙醇胺30mM，NaCl750mM，pH10.3來洗脫目的蛋白。洗脫了蛋白質(zhì)后，使用G-25柱交換緩沖液。最后，在緩沖液Tris10mM,EDTA1mM中獲得具有96%純度的蛋白質(zhì)(圖3)。實施例7.半純化的和純化的變體的表征。為了表征半純化的和純化的制劑的聚集狀態(tài)，使用TSK-5000柱(Tosohbioscience,Japan)進行凝膠過濾色鐠法。在施加半純化的樣品后，獲得均勻和主要的峰，保留時間為15-20分鐘，表明存在高分子量種類(圖4A)。相反地，在來自衣殼蛋白的高度純化級分的樣品中，檢測到30分鐘的保留時間，相應(yīng)于二聚體形式的分子(圖4B)。實施例8."體外"再顆粒化的研究。為了使二聚體形式的純衣殼蛋白再顆粒化，將緩沖液交換成Hepes25mM，KAc100mM，MgAc21.7mM,pH7.4。在使蛋白質(zhì)以及寡核苷酸混合物一起于37。C加熱1分鐘后，使它們以等體積于30'C溫育30分鐘。作為實驗的陰性對照，在沒有寡核苷酸的情況下溫育蛋白質(zhì)。當用電子顯微鏡觀察這2種制劑時，在先前與寡核苷酸混合物一起溫育的蛋白質(zhì)樣品中觀察到大量直徑約21nm的顆粒，而在對照樣品中沒有觀察到顆粒(圖5)。實施例9.純化的衣殼在小鼠中的免疫學評估。使用5組20只Balb/c小鼠。其中的2組用10ug二聚體的純化的重組蛋白質(zhì)通過腹膜內(nèi)途徑進行免疫，使用氫氧化鋁和弗氏佐劑。另一組用由氫氧化鋁佐劑化的10ug純化且顆粒化的衣殼蛋白進行免疫。將來自用質(zhì)粒pQE-30轉(zhuǎn)化的Wi/e細胞破裂的可溶性級分(經(jīng)歷與PDC-2相同的純化步驟)用作陰性對照，其中用弗氏佐劑進行佐劑化。第5組用作為陽性對照的DEN-2病毒進行免疫。最后1次劑量后1個月，來自每個組的IO只動物通過顱內(nèi)接種接受100LDs。的致死DEN-2的劑量，并且觀察21天以獲得存活百分比。陽性對照組中的所有小鼠都存活，而陰性對照組中的所有小鼠都在攻擊后第7-ll天時生病，并且獲得0%的死亡率。最后，對于用重組蛋白質(zhì)免疫的組，用純的二聚體PDC-2免疫的組在與氫氧化鋁一起免疫時呈現(xiàn)出20%的保護，和在使用弗氏佐劑時呈現(xiàn)出40%的保護。此外，在接受用氫氧化鋁佐劑化的再顆?；募兊鞍踪|(zhì)的組中，90%的小鼠得到保護(表4)。表4.用同源的致死登革病毒攻擊后測定的在用蛋白質(zhì)變體免疫的小鼠中的存活百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>*計算為(存活者數(shù)目)/(小鼠總數(shù)目)。存活者的數(shù)據(jù)在攻擊后21天獲取。實施例10.淋巴組織增生性應(yīng)答。在最后1次劑量后15天處死來自用由氫氧化鋁佐劑化的、二聚或再顆?；囊職さ鞍走M行免疫的組的其余動物(IO只動物)。隨后，取出它們的脾并且研究針對DEN-2的淋巴組織增生性應(yīng)答。表5中的結(jié)果顯示了獲得的刺激指數(shù)。表5.來自經(jīng)免疫小鼠的淋巴細胞的針對同源血清型的刺激指數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*刺激指數(shù)關(guān)于DNA自發(fā)合成，樣品的每分鐘計數(shù)與對照的每分鐘計數(shù)的商平均值。**從受DEN-2感染的小鼠腦中制備。***從未受感染的小鼠腦中制備。****促分裂原，植物凝集素(陽性對照)。實施例11.由PD5和PDC-2形成的混合物的免疫學評估。20只動物用10ug顆?；募円職さ鞍缀?0ug蛋白質(zhì)PD5(序列號23)的混合物以間隔15天的3次劑量進行接種。用10ug純的衣殼蛋白進行免疫的組，用與等體積的PDC-2混合的20ug蛋白質(zhì)PD5進行免疫但從陰性對照運行獲得的組，和用蛋白質(zhì)P65k(在PD5構(gòu)建中存在的栽體蛋白)進行免疫的組用作對照。在所有情況下，氫氧化鋁用作佐劑。最后1次劑量后15天，動物進行抽血，并且通過ELISA就抗病毒抗體測試血清。如表6和7中所示，用混合物免疫的組發(fā)展出血清型特異性抗體，其滴度高于僅用蛋白質(zhì)PD5免疫的組些，并且同時在這2個組中的滴度高于用蛋白質(zhì)PDC-2免疫的組，在所述用蛋白質(zhì)PDC-2免疫的組中沒有檢測到針對DEN-2病毒的抗體。另一方面，從每個組中取另外10只動物用于淋巴組織增生測定法。從這些動物的脾中提取細胞，并且用感染性DEN-2病毒進行刺激。如表8中所示，在用混合物免疫的組中，刺激指數(shù)高于僅用衣殼蛋白免疫的組。在用蛋白質(zhì)PD5免疫的組中獲得最低的刺激指數(shù)。表6.在免疫接種后獲得的血清中針對DEN-2病毒的抗體滴度。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>畫-4<1:100<1:200<1:200<1:100表8.來自經(jīng)免疫小鼠的淋巴細胞的針對同源血清型的刺激指數(shù)。PDC-2PDC-2/PD5PD5P64k匿-2"9*112.11.1對照(-)抗原***1.31.61.51.2PHA****7.57.37.98*刺激指數(shù)關(guān)于DNA自發(fā)合成，樣品的每分鐘計數(shù)與對照的每分鐘計數(shù)的商平均值。**從受DEN-2感染的小鼠腦中制備。***從未受感染的小鼠腦中制備。****促分裂原，植物凝集素(陽性對照)。實施例12.CD8耗竭研究。將再顆?；暮投鄣囊職さ鞍捉臃N入Balb/c小鼠中以獲得誘導(dǎo)了細胞免疫應(yīng)答的某些證據(jù)。將從由用于產(chǎn)生pDC-2的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細胞獲得的制劑用作陰性對照，通過類似于對于蛋白質(zhì)PDC-2所使用的那種的純化方法獲得。給20只動物的組施用3次劑量的蛋白質(zhì)(20ug)，使用氫氧化鋁作為佐劑。最后1次劑量后1個月，給每組的一半動物施用1mg大鼠抗小鼠CD8mAb,所述大鼠抗小鼠CD8mAb能夠耗竭小鼠免疫系統(tǒng)的包含這種標記的細胞。在第二天時，所有動物用100LDs。(半數(shù)致死劑量)的DEN-2病毒進行攻擊。就疾病征兆的出現(xiàn)來觀察它們，并且記錄死亡。在經(jīng)免疫的未處理組的情況下，在用二聚的和再顆?；囊職っ庖叩慕M中分別獲得200/。和80%的保護。平行地，在處理組中，保護百分比低于未處理組對于二聚PDC-2為0%的保護，和對于再顆粒化的蛋白質(zhì)為10%的保護。在陰性對照組的情況下，在處理和未處理的動物中都沒有獲得保護。表9.用重組衣殼的變體進行免疫的動物中用致死DEN-2病毒的攻擊測定法<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*計算為(存活者數(shù)目)/(小鼠總數(shù)目)。存活者的數(shù)據(jù)在攻擊后21天獲取。實施例13:DEN-1蛋白質(zhì)的獲得和半純化。使用在序列表中被標識為序列號8和序列號10的寡核苷酸從DEN-1病毒林中擴增編碼DEN-1病毒的衣殼蛋白的氨基酸1-100的核苷酸序列(序列號7)。通過質(zhì)粒pQE-30(序列號6)的^3/z^//#//7￡////消化來制備載體，所述質(zhì)粒pQE-30包含噬菌體T5啟動子和在N-末端區(qū)域中的6組氨酸尾。連接后，通過限制性消化來分析重組體，并且對陽性克隆進行測序以檢查連接狀況。用稱為pDC-l的所選克隆(圖6和序列號10)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞XL-lBlue(HanahanD.1983.Studiesontransformationofi^c力er/c力/aco7/withplasmids.J.Mol.Biol.166:557-580)。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌林在補充有50pg/mL氨千青霉素的LB中于37。C培養(yǎng)10小時。終濃度為1mM的異丙基-5-D-吡喃硫代半乳糖苷(IPTG)用于誘導(dǎo)啟動子。菌落生長后，進行細胞裂解物的SDS-PAGE。結(jié)果獲得15-kDA條帶。蛋白質(zhì)通過抗DEN-1HMAF進行識別。將這種蛋白質(zhì)命名為PDC-l(序列號11)。實施例14.PDC-l的半純化和表征。將從用pDC-l轉(zhuǎn)化并于37X:生長的大腸桿菌菌株中獲得的生物量通過弗氏壓碎器進行破壞。獲得重組蛋白質(zhì)，在可溶性和不溶性級分之間相等地分布。使用QSep力ar。se尸F(xiàn)柱和緩沖液Tris10mMpH8，對可溶性級分實施陰離子交換色謙法。存在于非吸附級分中的蛋白質(zhì)以45%的純度被獲得，并用于免疫學研究。實施例15.半純化的PDC-1的免疫學評估。使用2組30只Balb/c小鼠。其中之一用10ug重組蛋白質(zhì)通過腹膜內(nèi)途徑進行免疫，使用氫氧化鋁作為佐劑。將用氫氧化鋁佐劑化的由于經(jīng)pQE-30轉(zhuǎn)化的細胞破裂而獲得的可溶性級分用作陰性對照。部分動物(10只小鼠)在第3次劑量后15天進行抽血，并且通過ELISA測定針對DEN-1的抗體滴度。在用重組蛋白質(zhì)免疫接種后，沒有獲得抗病毒抗體滴度。表IO.在用半純化的PDC-1免疫接種后獲得的血清中針對DEN-1的抗體滴度。小鼠抗-DEN-1ELISA滴度XL-1blue對照(-)PDC-11<1:100<1:1002<1100<11003<1100<11004<1100<11005<1100<11006<1100<11007<1100<11008<1100<11009<1:100<1:10010<1:100<1:100實施例16.保護測定法。為了評估通過用所述變體免疫接種而賦予給小鼠的針對用致死的同源DEN病毒攻擊的保護，使用來自用吸附在氫氧化鋁中的重組蛋白質(zhì)和用對照制劑免疫的每個組的10只小鼠。每只動物通過顱內(nèi)接種接受100LDs。的致死DEN-l的劑量，并且觀察21天以獲得關(guān)于由于病毒性腦炎死亡的致死率百分比。作為陽性對照，使用由感染性DEN-1病毒(104pfu)免疫的一組10只小鼠。陽性對照組中的所有小鼠都存活，而陰性對照組中的所有小鼠都在攻擊后第7-11天時生病，并且到第21天時獲得100%的死亡率。最后，用重組蛋白質(zhì)PDC-1免疫的組呈現(xiàn)出50%的保護(表11)。表ll.用同源的致死DEN病毒攻擊后測定的在用蛋白質(zhì)變體免疫的小鼠中的存活百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>*計算為(存活者數(shù)目)/(小鼠總數(shù)目)。存活者的數(shù)據(jù)在攻擊后21天獲取。實施例17.淋巴組織增生性應(yīng)答在最后l次劑量后15天處死用蛋白質(zhì)PDC-1進行免疫的組的其余動物。隨后，取出它們的脾并且研究針對DEN-1的淋巴組織增生性應(yīng)答。表12中的結(jié)果顯示了獲得的刺激指數(shù)。表12.來自經(jīng)免疫小鼠的淋巴細胞的針對同源血清型的刺激指數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>*刺激指數(shù)關(guān)于DNA自發(fā)合成，樣品的每分鐘計數(shù)與對照的每分鐘計數(shù)的商平均值。**從受DEN-2感染的小鼠腦中制備。***從未受感染的小鼠腦中制備。****促分裂原，植物凝集素(陽性對照).實施例18.PDC-2DomIII的克隆和表達。使用在序列表中被標識為序列號13和序列號14的寡核苷酸從DEN-2病毒株基因型Jamaica中擴增編碼來自DEN-2的包膜蛋白的氨基酸286-426(相應(yīng)于該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域III的區(qū)域)的核苷酸序列(序歹i〗號12)(DeubelV.,KinneyR.M.，TrentD.W.NucleotidesequenceanddeducedaminoacidsequenceofthenonstructuralproteinsofDenguetype2virus,Jamaicagenotype:Comparativeanalysisofthefull-lengthgenome.Virology1988.165:234-244)。通過用&頂#//^邁#/消化質(zhì)粒pDC-2來制備載體，所述質(zhì)粒pDC-2包含噬菌體T5啟動子、在N-末端區(qū)域中的6-組氨酸尾和相應(yīng)于DEN-2病毒的衣殼蛋白的100個氨基酸的區(qū)域。連接后，通過限制酶消化來分析潛在的重組體，并且對陽性克隆進行測序以檢查連接狀況。最后將所選克隆命名為pDC-2DomIII(序列號1"。用稱為pDC-2DomIII的所選克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞XL-1Blue(HanahanD.1983.Studiesontransformationof^cAe".c力/aco//withplasmids.J.Mol.Biol.166:557-580)。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株在補充有50pg/mL氨節(jié)青霉素的LB中于37。C培養(yǎng)10小時。終濃度為1mM的異丙基-步D-吡喃硫代半乳糖苷(IPTG)用于誘導(dǎo)啟動子。菌落生長后，進行細胞裂解物的SDS-PAGE。結(jié)果獲得30-kDA條帶。蛋白質(zhì)通過抗DEN-2HMAF進行識別。將這種蛋白質(zhì)命名為PDC-2DomIII(序列號16)。實施例19.PDC-2DOMIII的半純化和表征。將從用pDC-2DomIII轉(zhuǎn)化并于37。C生長的大腸桿菌菌林中獲得的生物量通過弗氏壓碎器進行破壞。獲得重組蛋白質(zhì)，在可溶性和不溶性級分之間相等地分布。使用QSe如arose尸尸柱和緩沖液Tris10mMpH8，對可溶性級分實施陰離子交換色鐠法。存在于非吸附級分中的蛋白質(zhì)以40%的純度被獲得，并用于免疫學研究(圖2)。實施例20.半純化的PDC-2DomIII在小鼠中的免疫學評估。使用5組30只Balb/c小鼠。其中一個組用10ug重組蛋白質(zhì)通過腹膜內(nèi)途徑進行免疫，使用氫氧化鋁作為佐劑。將用氫氧化鋁佐劑化的由于用質(zhì)粒pQE-30轉(zhuǎn)化的JZ-7Wi/e細胞破裂而獲得的可溶性級分用作陰性對照。包括另2組作為對照。其中之一用蛋白質(zhì)PDC-2進行免疫，和另一組用蛋白質(zhì)PD5(這種蛋白質(zhì)包含DEN-2病毒的包膜蛋白的結(jié)構(gòu)域III區(qū)域)進行免疫。第3次劑量后15天，對來自每個組的IO只動物進行抽血，并且通過ELISA測定針對DEN-2的抗體滴度。如表13和14中所示，用PDC-2DomIII免疫的組發(fā)展出高滴度的針對DEN-2的血清型特異性抗體，高于由蛋白質(zhì)PD5誘導(dǎo)的抗體滴度。這些結(jié)果證實，與衣殼蛋白的遺傳組合增強了由包膜蛋白的結(jié)構(gòu)域III引發(fā)的抗病毒免疫應(yīng)答。表13.在用DomIII-衣殼蛋白免疫接種后獲得的血清中針對DEN-2病毒的抗體滴度。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表14.在從每個組獲得的血清混合物中所包含的抗體的血清型特異性的測定。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>另一方面，從每個組中獲取另外IO只動物用于淋巴組織增生測定法。從這些動物的脾中提取細胞，.并且用感染性DEN-2病毒進行刺激。表15顯示了，在用組合進行免疫的組中，刺激指數(shù)高于僅用衣殼蛋白免疫的組。在用蛋白質(zhì)PD5免疫的組中的刺激指數(shù)是最低的。表15.來自經(jīng)免疫小鼠的淋巴細胞的針對同源血清型的刺激指數(shù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>*刺激指數(shù)關(guān)于DNA自發(fā)合成，樣品的每分鐘計數(shù)與對照的每分鐘計數(shù)的商平均值。**從受DEN-2感染的小鼠腦中制備。***從未受感染的小鼠腦中制備。****促分裂原，植物凝集素(陽性對照)。權(quán)利要求1.藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑是能夠在受者生物中誘導(dǎo)針對登革病毒的免疫應(yīng)答的疫苗，并且包含單獨或與其他抗原相組合的一種或幾種登革病毒血清型的衣殼蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑包含單獨、相互混合或組合的登革病毒1、2、3或4的衣殼蛋白。3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑包含與能夠誘導(dǎo)體液和/或細胞應(yīng)答的抗原相混合或相組合的衣殼蛋白。4.根據(jù)權(quán)利要求1和3的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑包含與在序列表中被標識為序列20、序列21、序列22和序列23的一種或幾種蛋白質(zhì)相混合的衣殼蛋白。5.根據(jù)權(quán)利要求1和3的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑包含與在序列表中被標識為序列17、序列18、序列19和序列24的一種或幾種序列通過化學或遺傳方法相融合的衣殼蛋白。6.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4和5的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑包含以聚集或顆粒形式的衣殼蛋白。7.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5和6的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑包含藥理學上可接受的媒介物和油性或非油性佐劑。8.根據(jù)權(quán)利要求l、2、3、4、5、6和7的藥物制劑，其特征在于，所述藥物制劑是針對登革病毒的預(yù)防或治療劑，用于口服、肌內(nèi)、皮下、粘膜或靜脈內(nèi)使用。全文摘要本發(fā)明涉及獲得包含登革病毒血清型的衣殼蛋白的藥物組合物，其能夠在受者中誘導(dǎo)針對病毒攻擊的保護性免疫應(yīng)答，而不誘導(dǎo)抗體依賴性增強現(xiàn)象。文檔編號A61K39/295GK101304760SQ200680042280公開日2008年11月12日申請日期2006年9月18日優(yōu)先權(quán)日2005年9月16日發(fā)明者A·祖?zhèn)愃账?B·D·L·C·希拉瓦茲奎茲,C·洛佩茲阿巴拉特圭,G·E·圭倫尼托,I·瓦爾德茲普拉多,L·拉佐瓦茲奎茲,L·赫米達克魯茲,M·G·古茲曼提拉多,S·瓦茲奎茲拉芒多申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心