專利名稱：：核苷酸分子septin1sr2及其在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。表現(xiàn)為正常血細胞生成減少，周圍血白細胞發(fā)生質(zhì)和量的異常，白細胞及其幼稚細胞(即白血病細胞)在骨髓或其它造血組織中進行性、失控制的異常增生，浸潤并損害各種組織，產(chǎn)生不同癥狀。根據(jù)白血病的病程及細胞形態(tài)學(xué)可將白血病分為(1)急性白血病病情發(fā)展迅速，骨髓及周圍血中主要是異常原始和幼稚細胞。其自然病程多在6個月以內(nèi)。急性白血病又分A、急性淋巴細胞白血病(急淋)；B、急性非淋巴細胞白血病(急非淋)。包括急性粒細胞白血病(急粒)、急性單核細胞白血病(急單)。(2)慢性白血病病程較長，骨髓及血中主要是較成熟的異常細胞，其次為幼稚細胞。自然病程多在一年以上。慢性白血病主要包括慢性粒細胞白血病(慢粒)；慢性淋巴細胞白血病(慢淋)；多毛細胞白血?。挥琢馨图毎籽?。(3)特殊類型白血病如低增生性白血病、綠色瘤或粒細胞肉瘤、嗜酸粒細胞白血病、嗜堿粒細胞白血病等。白血病是一種常見的惡性腫瘤，我國己將其列入重點防治的十大惡性腫瘤之一。白血病占惡性腫瘤總發(fā)病數(shù)的5%左右，發(fā)病以兒童和青年居多，在我國各年齡組惡性腫瘤的死亡率中占第六位(男性)和第八位(女性)，在兒童及35歲以下的人群中則占第一位。人類白血病的確切病因至今未明。有關(guān)研究表明，病毒可能是主要的因素，此外尚有遺傳因素、放射、化學(xué)毒物和藥物等因素。某些染色體的異常與白血病的發(fā)生也有直接關(guān)系，染色體的斷裂和易位可使癌基因激活或位置發(fā)生移動，染色體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)的改變可直接引起細胞發(fā)生突變。免疫功能的降低，也有助于白血病的發(fā)生。40年代以前，白血病被認為是"不治之癥"。診斷后除了輸血等支持療法外，一般無其它特殊治療。進入70年代，在綜合支持療法的基礎(chǔ)上，采取聯(lián)合化療、免疫治療、細胞生長因子與造血干細胞移植、中醫(yī)治療等有計劃地科學(xué)綜合療法，使患者緩解率明顯提高。然而，由于目前白血病的治療大多需要進行骨髓移植，這就阻礙了進一步提高治愈率或者緩解率。首先，找到可以配型的骨髓機率就不高；其次，在骨髓移植手術(shù)期間，由于成熟免疫細胞被一率殺滅，患者的免疫力極其低下，需要住在無菌室進行治療，給患者帶來了非常大的痛苦；再次，骨髓移植手術(shù)耗費巨大人力、物力，給患者及其家屬都帶來了很大的負擔(dān)和壓力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于制備治療白血病藥物的核苷酸分子。本發(fā)明的另一個目的是提供上述核苷酸分子的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種分離出的核苷酸分子，它的序列包括5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5，-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'。本發(fā)明中稱為SEPTIN1SR2。在本發(fā)明中，術(shù)語"核苷酸分子SEPTIN1SR2"指具有抑制SEPTIN1蛋白活性并且含有與5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3'、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'序列高度同源的核苷酸序列。該術(shù)語還包括與5，-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3，的同源性至少70%，較佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。該術(shù)語還包括5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'的核苷酸序列變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為l-15個，較佳地1-10個，更佳地l-5個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加數(shù)個(通常為IO個以內(nèi)，較佳地為5個以內(nèi))核苷酸。例如，在5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'(3'端)加入若干dT(脫氧胸苷)后形成的序列。在本發(fā)明中，可在SEPTIN1SR2后(3'端)連接dTdT，從而形成5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3，或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3，。在本發(fā)明中，SEPTIN1SR2的序列可以包括GGAAGAGGAGATCCACATC和GATGTGGATCTCCTCTCC。在本發(fā)明中，SEPTIN1SR2的序列可以包括5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3，或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3，。在本發(fā)明中，SEPTIN1SR2的序列可以是5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3'或者5'陽GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'。在本發(fā)明中，SEPTIN1SR2的序列可以是GGAAGAGGAGATCCACATC和GATGTGGATCTCCTCTCC。在本發(fā)明中，SEPTIN1SR2的序列可以是5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3'禾口5，-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3'。本發(fā)明還提供了一種載體，它含有上述的核酸分子，即SEPTIN1SR2。在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域己知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將含有本發(fā)明SEPTIN1SR2核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，可以形成重組載體。本發(fā)明還提供了上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在本發(fā)明中，術(shù)語"宿主細胞"包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS7、NIT、293細胞等。另一方面，本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子SEPTIN1SR2的制備方法，即按5，-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'的序列，將各核糖核酸分子依次脫水縮合。本發(fā)明的核苷酸分子SEPTIN1SR2可以采用各種常規(guī)的制備方法制備。本發(fā)明的核苷酸分子SEPTIN1SR2序列通?？梢杂妹附夥ɑ蛉斯ず铣傻姆椒ǐ@得。本發(fā)明還提供了上述的核苷酸分子SEPTIN1SR2在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的SEPTIN1SR2可以作為Septinl蛋白的抑制劑，可以抑制淋巴細胞的增殖。Septinl表達組織譜分析表明，在胰腺、腎、骨胳肌、肝、肺、胎盤、腦、心臟、外周血白細胞、大腸、小腸、卵巢、睪丸、前列腺、胸腺和脾臟等16種組織中，Septinl只在外周血、胸腺和脾臟的淋巴細胞中大量表達，這說明Septinl蛋白主要在淋巴細胞中發(fā)揮功能，而不會對其它組織或者細胞起作用。細胞結(jié)果顯示，Septinl可被磷酸化，而在206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)锳時，Septinl就不能被磷酸化。在淋巴系統(tǒng)來源細胞中表達本發(fā)明的Septinl、SeptinlS206A突變體(即在Septinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)锳)和SeptinlS206E突變體(即在Septinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)镋)，結(jié)果顯示，以表達正常Septinl的細胞為對照，SeptinlS206A突變體會使細胞不進入G2期，即細胞不能分裂；SeptinlS206E突變體使G2期細胞大大增加，即促進細胞分裂。這說明Septinl可調(diào)控細胞分裂，尤其是206位的絲氨酸殘基。這也說明，如果將Septinl蛋白206位氨基酸殘基由絲氨酸突變?yōu)锳、抑制Septinl蛋白活性或者使Septinl蛋白失活，就可以使細胞停止分裂增殖。這說明了206位絲氨酸殘基是Septinl被磷酸化的關(guān)鍵。因而，可以將Septinl蛋白作為藥靶，篩選Septinl蛋白的抑制劑和失活劑。一旦篩選到了Septinl蛋白的抑制劑或者失活劑，施用于細胞，就可以使細胞停止分裂。另一方面，一旦篩選到了Septinl蛋白的增強劑，施用于細胞，就可以使細胞加速分裂生長。有絲分裂是細胞周期過程中很重要的一個階段。大多數(shù)的腫瘤其發(fā)生原因是有絲分裂所致的基因組的不穩(wěn)定性，基因組的不穩(wěn)定又來源于染色體的不穩(wěn)定，染色體的不穩(wěn)定是癌癥的特征性標志。染色體的分離、中心粒的復(fù)制和分離發(fā)生異常，會導(dǎo)致每個細胞染色體數(shù)目的異常，既非整倍體，增加雜合性缺失的機會，抑癌基因的缺失或原癌基因的數(shù)目增加都會使細胞生命代謝和信號傳導(dǎo)發(fā)生紊亂，增加癌變的機會。腫瘤與正常細胞的區(qū)別就是無限制增生，即有絲分裂失去正常調(diào)控。綜上所述，Septinl可調(diào)控細胞分裂，尤其是淋巴細胞的細胞分裂。Septinl的突變體可以特異性的促進淋巴細胞的分裂停滯或者凋亡。由此，本發(fā)明的SeptinlSR2可以特異性的促進淋巴細胞的分裂停滯或者凋亡。流式細胞儀結(jié)果表明，本發(fā)明的SeptinlSR2可以使淋巴細胞不進入G2期，即細胞不能分裂；將其施用于淋巴細胞白血病患者，就可以特異性的使淋巴細胞停止分裂或者凋亡，而不影響其它免疫細胞，例如中性粒細胞，單核細胞等等，的生長增殖，這將大大增加患者的存活率、改善患者的生存狀態(tài)、縮短患者的恢復(fù)時間，減輕患者及其家屬的負擔(dān)。將其轉(zhuǎn)入了內(nèi)源表達septinl的人T細胞淋巴瘤細胞株Jurkat中，48小時后western印跡法檢測了內(nèi)源septinl的表達水平，結(jié)果如圖7所示，在所取細胞量相同的條件下(P-actin蛋白表達水平大致相同)，轉(zhuǎn)入干擾siRNA的細胞中內(nèi)源表達septinl的水平明顯下降(下降水平>50%)。為了驗證SEPTIN1SR2的功能，本發(fā)明首先檢測了干擾septinl后，Jurkat細胞在不同濃度的PHA刺激下的增殖能力，結(jié)果如圖8所示，與轉(zhuǎn)入對照siRNA(序列如下正義鏈5'-AGAAGAGGGGAUCCACAUGtt-3'或者反義鏈5'-CAUGUGGAUCCCCUCUUCUtt-3')的Jurkat細胞相比，干擾了septinl后的Jurkat細胞對PHA刺激的敏感性明顯下降，對比lpg/ml的PHA刺激與O.l^g/ml的PHA刺激下Jurkat細胞的增殖水平，對照組升高約200%，而干擾組只升高了約25%。隨后本發(fā)明又檢測了在lpg/ml的PHA刺激下，60小時內(nèi)干擾septinl的Juricat細胞的增殖水平。結(jié)果如圖9所示，對照組在60小時后增殖了161%，而千擾組只增殖了44%。本發(fā)明的核苷酸分子SEPTIN1SR2及其類似物，當(dāng)在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質(zhì)的性質(zhì)以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、或局部給藥。以本發(fā)明的核苷酸分子SEPTIN1SR2，可以將其與合適的藥學(xué)上可接受的載體聯(lián)用。這類藥物組合物含有治療有效量的化合物和藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的核苷酸分子SEPTIN1SR可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的SEPTIN1還可與其他治療劑一起使用。當(dāng)本發(fā)明的核苷酸分子SEPTIN1SR2被用作藥物時，可將治療有效劑量的該多肽施用于哺乳動物，其中該治療有效劑量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約l毫克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明中，所述的治療白血病藥物是由含有效治療量的核苷酸分子SEPTIN1SR2和藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。所述藥物組合物可以是針劑或者片劑。其有效治療量可以為每天1微克/千克至10微克/千克體重。本發(fā)明中，所述藥物是針劑、粉劑或者片劑。白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。目前可以通過骨髓移楦進行治療，給患者及其家屬都帶來了很大的負擔(dān)和壓力。本發(fā)明的核苷酸序列包括5，-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3，、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5，-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'。該核苷酸可以使淋巴細胞停止分裂，因此將其與藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥劑組合物，可以作為新的治療白血病藥劑，為緩解和治療淋巴細胞白血病提供了一種新的途徑和手段。圖1為Septinl的組織表達譜圖。其中，1為心臟、2為腦、3為胎盤、4為肺、5為肝、6為骨胳肌、7為腎、8為胰腺、9為脾臟、IO為胸腺、11為前列腺、12為睪丸、13為卵巢、14為小腸、15為大腸、16為外周血白細胞。圖2為septinl蛋白在17種人類細胞系中的表達情況圖。圖3為septinl蛋白與CK2互作IB-免疫印跡雜交試驗的結(jié)果。圖4為septinl蛋白在Jurkat細胞株的定位結(jié)果。圖5為septinl蛋白被CK2體內(nèi)磷酸化的結(jié)果。圖6為septinl蛋白被CK2體外磷酸化的結(jié)果。圖7為septinl蛋白在Jurkat細胞株內(nèi)被SEPTIN1SR抑制的結(jié)果。圖8為SEPTIN1SR抑制Jurkat細胞株分裂受PHA濃度影響的結(jié)果。圖9為在相同PHA濃度條件下SEPTIN1SR抑制Jurkat細胞株分裂的結(jié)果。圖10為空載體轉(zhuǎn)染Jurkat細胞株的細胞周期分析結(jié)果。橫坐標為基因組數(shù)。為圖11-13的空白對照，由流式細胞儀分析而得。圖11為野生型septinl蛋白轉(zhuǎn)染Jurkat細胞株的細胞周期分析結(jié)果。橫坐標為基因組數(shù)。為圖12-13的對照，由流式細胞儀分析而得。圖12為septinl蛋白S206A突變體轉(zhuǎn)染Jurkat細胞株的細胞周期分析結(jié)果。橫坐標為基因組數(shù)，由流式細胞儀分析而得?？梢姡c圖10和11相比，G2期細胞幾乎沒有。圖13為septinl蛋白S206A突變體轉(zhuǎn)染Jurkat細胞株的細胞周期分析結(jié)果。橫坐標為基因組數(shù)，由流式細胞儀分析而得?？梢?，與圖10和11相比，G2期細胞明顯增加。圖14為Jurkat細胞株中轉(zhuǎn)入對照siRNA的的細胞周期分析結(jié)果。橫坐標為基因組數(shù)，由流式細胞儀分析而得。此圖為圖15的對照。圖15為Jurkat細胞株中轉(zhuǎn)入有效siRNA的的細胞周期分析結(jié)果。橫坐標為基因組數(shù)，由流式細胞儀分析而得。具體實施方式下列實施例中，未注明具體條件的實驗方案，通常按照常規(guī)條件，如Sambrook等人的《分子克隆》實驗室手冊(NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或者按照生產(chǎn)商建議的條件進行操作。實施例1Septinl的組織中的表達情況1.1Northern探針制備用ClontechMultipleTissuenorthen膜檢測成人組織中septinl基因的分布情況，所用探針為克隆到的septinl全長開放閱讀框(即NCBI登陸號NM—052838所示核苷酸序列中第188到1291位)。1)用septinl基因的特異的引物從構(gòu)建好并已經(jīng)測序的質(zhì)粒中擴增得到PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用QIAquickPCR純化試劑盒純化后，用GeneQuantII型紫外分光光度計測定純化后DNA的濃度。2)DNA模板經(jīng)100'C熱變性2min后，用隨機引物標記試劑盒以隨機引物標記法摻入Y-32PdCTP。標記反應(yīng)結(jié)束后，加入EDTA至終濃度20mmol/L中止反應(yīng)，10(TC熱變性5min，置于冰上。3)將探針用MicroSpinG-25純化柱純化。純化前后分別取樣lp稀釋IOO倍，取3pl稀釋液點樣在WhatmanDE81濾紙上，用Monitor900型放射性檢測儀測定其放射強度(cps)。將純化后的放射性強度除以純化前的放射性強度記為摻入率，摻入率大于30%則認為探針制備合格。1.2Northen雜交1)將雜交膜用2XSSC液潤濕后將膜帶RNA的一面朝上放入雜交管中，每10cm2膜面積加入lml甲酰胺預(yù)雜交液，預(yù)雜交液含50%甲酰胺，5XSSPE，10XDenhardt試劑，2%SDS，1000mg/L小牛胸腺DNA。42'C預(yù)雜交2-4小時。2)預(yù)雜交結(jié)束后，將純化后的標記探針加入剩余的預(yù)雜交液中。42。C雜交48小時。3)雜交反應(yīng)結(jié)束后，將雜交液棄去，加入雜交洗脫液l(2XSSC,0.05%SDS)室溫洗滌3次，每次30min，其間不?；蝿幽ぁＨ缓蠹尤腚s交洗脫液2(0.1XSSC，0.1%SDS)，50'C洗滌2次，每次30min。用Monitor900型放射性檢測儀測定整張膜上的放射強度。如果背景的放射強度過高，可以適當(dāng)?shù)奶岣呦茨囟?，再次洗滌?)將洗滌完畢的膜放入保鮮袋中封口，進行放射自顯影.結(jié)果顯示，在胰腺、腎、骨胳肌、肝、肺、胎盤、腦、心臟、外周血白細胞、大腸、小腸、卵巢、睪丸、前列腺、胸腺和脾臟等16種組織中，Septoil的mRNA僅在外周血、胸腺、脾臟等組織中有表達，而且在胸腺中表達量最高。詳見圖l。實施例2western-blot分析septinl蛋白在17種人類細胞系中的表達情況1、17種人類細胞系的培養(yǎng)所選17種細胞均來自中國科學(xué)院細胞庫，其組織來源及培養(yǎng)條件如下名稱種屬組織來源培養(yǎng)條件HEK293T人類胚胎腎90%DMEM高糖完全培養(yǎng)基，10%胎牛血清，37°C，5%C02HELA人類子宮頸同HEK293TU20S人類肌肉90。/。5A培養(yǎng)基，10%胎牛血清，37°C,5%C02PANC人類胰腺同HEK293TSMMC7721人類肝臟同HEK293TMCF7人類乳腺同HEK293TH1299人類肺90%RPMI1640培養(yǎng)基，10%胎牛血清，37°C，5%C02<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>2.Western印跡檢測septinl蛋白的表達水平(1)分別收獲17種細胞各約106個，加入50(^1細胞裂解液，振蕩混勻后4°C孵育30min。12000rpm/min離心15分鐘，取上清。(2)分別取每種上清l(Hil進行SDS-PAGE電泳。(3)用BIORAD轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將蛋白從聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素薄膜上，冰浴中轉(zhuǎn)移2hr，電壓為100V。置于麗春紅染色液中510min，水洗去染料，標記蛋白標準分子量條帶。(4)封閉將膜放置于30ml封閉緩沖液中，室溫下置于搖床震蕩lhr。(5)—抗反應(yīng)按推薦的稀釋比加入septinl特異性抗體(購于SANTACRUZ公司)，將膜浸于稀釋好的一抗中，室溫下?lián)u床孵育2hr;用洗滌緩沖液洗膜4次，每次10min;(6)二抗反應(yīng)按l:l，OOOO的稀釋比加入HRP耦聯(lián)的抗羊抗體，將膜浸于稀釋好的二抗中，室溫下?lián)u床孵育lhr;用洗滌緩沖液洗膜4次，每次10min。(7)ECL發(fā)光反應(yīng)把膜用三倍稀釋或不稀釋的ECL發(fā)光試劑顯影曝光。結(jié)果顯示，Septinl主要在T細胞(Jurkat，ATCC;6T-CEM，購自中國科學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院)和B細胞(EB-3，ATCC)中表達。實施例3Septinl在Jurkat細胞中的定位本發(fā)明中，首先將全長septinl的cDNA構(gòu)建入Ds-Red-Cl熒光表達載體。將所得的RFP—septinl重組子轉(zhuǎn)染入Jurkat細胞中，培養(yǎng)48小時，經(jīng)過固定處理后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。具體步驟如下(1)收取懸浮培養(yǎng)的Jurkat細胞，充分打散后滴加在涂有多聚賴氨酸的載波片上，靜置5min后置于4X的多聚甲醛中室溫固定10min(分鐘)。(2)PBS洗三遍，于0.2%TritonX-100中室溫打孔15min。(3)PBS洗三遍，于含有10%馬血清、1%BSA的TBS中室溫封閉1hr(小時)。(4)TTBS洗一遍，在蓋玻片上滴加入用抗體稀釋液按比例稀釋的一抗(抗septinl抗體，1:20)，37°C孵育2hr。(5)TTBS洗三遍，在蓋玻片上滴加入用抗體稀釋液按比例稀釋的二抗(Rhodamine-抗羊，1:100)，37°C孵育lhr。(6)TTBS洗三遍，于lng/nlDAPI溶液中37°C染色20min。(7)TTBS洗三遍，封片，上熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)septinl呈細胞質(zhì)分布(如圖4)，且其分布具有一定的極性，另外，其分布隨細胞周期的變化有所不同，在細胞分裂的全過程中，septml極有可能在紡錘體兩極的中心粒周圍分布，在中期以后，septinl還會在兩細胞分裂溝處聚集。實施例4pull-down檢測septinl蛋白與CK2激酶的互作1、將瞬時轉(zhuǎn)染有PCMV-Myc-CK2a的細胞裂解液(細胞數(shù)5X106)與50pl50。/。的谷胱甘肽瓊脂糖珠和20ng的GST在搖床上4。C孵育2h.2、4°C,2000rpm離心2分鐘。3、將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，分為兩等份，各加入50pl谷胱甘肽瓊脂糖珠，其中一管加入10pg的GST蛋白，另一管加入10嗎的GST-septinl融合蛋白，4°C搖床孵育2小時。4、2000rpm離心2分鐘，上清取到新的離心管中，4°C保存，以備后用。5、用lml冰浴的裂解緩沖液(20mMTris-clpH8.0，500mMNaCl，lmMEDTA，l%NP-40)洗珠子，2000rpm離心1分鐘，棄上清，再重復(fù)洗3次。6、用20nl20mM的還原谷胱甘肽(在50mM的Tris-ClpH8.0的緩沖液中)從珠子上洗脫GST融合蛋白和與它結(jié)合的蛋白。2000rpm離心2分鐘。7、洗脫的蛋白加入等體積的2XSDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸4分鐘。8、WesternBlotting檢測。結(jié)果顯示，如圖3所示，Septinl與CK2能相互作用。實施例5CK2激酶在體外、體內(nèi)磷酸化septinl1、體外磷酸化(1)取His-CK2a激酶0.2ug,底物蛋白5ug(GST-septinl，GST-septin1-206A),加入lXKinasebuffer(cellsignal公司)，反應(yīng)體系中另含有200nMr-32p-ATPlnl(5(xCi棒(2)在30r讓反應(yīng)物作用30分鐘，然后加5ial5XSDS上樣緩沖液終止反應(yīng)。(3)取20|^1反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，膠染色、脫色。(4)真空干燥儀上干膠60。C2小時，冷卻后，壓上X-光片，-801:曝光。(5)顯影2、體內(nèi)磷酸化(1)將PCMV-HA-CK2a分別與PCMV-myc-septin1、PCMV-myc-septinl(206A)共轉(zhuǎn)染人H1299細胞系(2)37°C培養(yǎng)48hr后收獲細胞并裂解。(3)向每500nl細胞裂解液中加入3planti-myc—抗(sigma)，25piProteinGPlus/ProteinAAgarose(sigma公司)，置于4°C搖床緩慢震蕩1小時。(4)2000rpm離心l分鐘后用lXPBS洗滌Agarose三次(5)向Agarose中加入2XSDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸4分鐘。取上清20pl進行SDS-PAGE電泳(6)用磷酸化蛋白染色試劑盒(invitrogen)染色結(jié)果顯示，在體外和體內(nèi)，Septinl均可被CK2激酶磷酸化。體外磷酸化詳見圖5，體內(nèi)磷酸化詳見圖6。實施例6檢測septinl的磷酸化突變體對Jurkat細胞生長及周期的影響1、分別將PCMV-myc，PCMV-myc-septinl，PCMV-myc-septinl(S206A),PCMV-myc-septinl(S206E)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細胞2、37°C培養(yǎng)60hr后流式細胞儀檢測個細胞的周期結(jié)果顯示，如圖10-13所示，septinl(S-A)突變體(即將septinl蛋白第206位絲氨酸突變?yōu)楸彼?alanine，Ala，A))導(dǎo)致細胞凋亡增加，G2/M期細胞明顯減少，而septinl(S-E，即將septinl蛋白第206位絲氨酸突變?yōu)楣劝彼?glutamicacid,Glu，E))突變體則不能誘導(dǎo)細胞凋亡，但引起細胞G2/M期增高。這提示，septinl可以維持細胞分裂的正常進行，septinl206位絲氨酸突變時，細胞不能正常分裂。實施例7細胞中RNA干擾septinl的表達1、將合成的siRNA溶于去RNAase的ddH20中，制成50mM的工作母液2、取5pl脂質(zhì)體(GIBCO公司脂質(zhì)體Lipfectmine2000)與250plOPTI—MEM培養(yǎng)基混合均勻，靜置5min3、取25plsiRNA工作母液與250nlOPTI—MEM培養(yǎng)基混合均勻4、將2與3溶液混合均勻，室溫靜置20min5、將lX10e的懸浮細胞離心收集并用lXPBS洗滌一次，用400plOPTI—MEM培養(yǎng)基重懸后與4所得溶液混合，加入6孔板一孔6、37°C培養(yǎng)5hr后更換完全培養(yǎng)基7、繼續(xù)培養(yǎng)48-60hr后收獲細胞，取出一半細胞進行western-blot檢測septinl的表達情況，同時另一半細胞用于流式細胞檢測。結(jié)果顯示，在lpg/ml的PHA刺激下，60小時內(nèi)干擾septinl的Jurkat細胞的增殖水平。結(jié)果顯示，干擾組與對照組相比，在60小時后細胞增殖數(shù)大大減少。這同時也提示，septinl是淋巴系統(tǒng)來源的細胞增殖所必需的。權(quán)利要求1.一種分離出的核酸分子，其特征在于，它的序列包括5’-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3’、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5’-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3’。2.—種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列包括GGAAGAGGAGATCCACATC禾卩GATGTGGATCTCCTCTCC。3.—種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列包括5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT陽3，或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3，。4.一種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUC-3'、GGAAGAGGAGATCCACATC、GATGTGGATCTCCTCTCC、或者5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCC-3'。5.—種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是GGAAGAGGAGATCCACATC禾卩GATGTGGATCTCCTCTCC。6.—種如權(quán)利要求1所述的核酸分子，其特征在于，它的序列是5'-GGAAGAGGAGAUCCACAUCdTdT-3，和5'-GAUGUGGAUCUCCUCUUCCdTdT-3'。7.—種如權(quán)利要求1所述的核苷酸分子的制備方法，其特征在于，按權(quán)利要求1所述的核苷酸分子的序列，將各核糖核酸基團或者脫氧核糖核酸基團依次脫水縮合。8.如權(quán)利要求1所述的核苷酸分子在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是所述的藥物是由含有效治療量的權(quán)利要求1所述的核苷酸分子和藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥物組合物。10.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是，所述藥物是針劑、粉劑或者片劑。全文摘要本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種核苷酸分子及其在制備治療白血病藥物中的應(yīng)用。白血病是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。目前可以通過骨髓移植進行治療，給患者及其家屬都帶來了很大的負擔(dān)和壓力。本發(fā)明的核苷酸序列包括AUUCAUCGAGGAGCAAUUU、ATTCATCGAGGAGCAATTT、AAATTGCTCCTCGATGAAT或者AAAUUGCUCCUCGAUGAAU。該核苷酸可以使淋巴細胞停止分裂，因此將其與藥學(xué)上的載體或者賦形劑組成的藥劑組合物，可以作為新的治療白血病藥劑，為緩解和治療淋巴細胞白血病提供了一種新的途徑和手段。文檔編號A61K31/7088GK101240274SQ20071003718公開日2008年8月13日申請日期2007年2月6日優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日發(fā)明者丁向明,龍余,余文博,唐麗莎申請人:復(fù)旦大學(xué)