專利名稱：一種前列腺癌相關(guān)的基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及前列腺癌相關(guān)的N-myc 下游調(diào)節(jié)3型基因(NDRG3)及其應(yīng)用；針對(duì)NDRG3基因或蛋白的拮抗劑及其 應(yīng)用。
背景技術(shù)：
前列腺癌是歐美國(guó)家男性常見(jiàn)病，在過(guò)去20年中，中國(guó)前列腺癌發(fā)病率 的增加也居各種腫瘤之首。前列腺癌患者被確診時(shí)， 一半左右的病例都屬晚期， 大部分病例有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，不僅失去了早期根治的機(jī)會(huì)，而且處于該階段的治 療預(yù)后效果很不理想。因此，前列腺癌已成為危害老年男性人群健康的重大疾 病。前列腺癌的分子病理學(xué)機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的，不但多基因參與其發(fā)病，而且 外部的環(huán)境因素如飲食、炎癥、生活方式、病毒、化學(xué)物質(zhì)、射線等也參與其 進(jìn)程。
迄今為止，多方面的研究已經(jīng)論證了多基因和環(huán)境因素間的復(fù)雜關(guān)系在前 列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。
在癌組織中通常表達(dá)上調(diào)的基因產(chǎn)物可作為研發(fā)新的抗癌藥物的潛在靶 點(diǎn)，事實(shí)上，針對(duì)某些類(lèi)型癌癥中異常表達(dá)的、導(dǎo)致癌癥生長(zhǎng)和發(fā)展的分子， 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了有效的新藥，這類(lèi)藥物包括治療治療慢性粒細(xì)胞白血病的Glivec (STI-571)、乳腺癌的Herceptin等。
已知有多種分子在前列腺癌組織中過(guò)度表達(dá)，因而被鑒定為前列腺癌標(biāo)記 物或者治療靶標(biāo)，然而這些分子多數(shù)在其他主要器官中同樣過(guò)度表達(dá)，以這些 分子為耙的藥物可能對(duì)癌細(xì)胞是有毒的，但同樣對(duì)其他器官的正常細(xì)胞造成損 害。因此，在腫瘤組織中大量表達(dá)并且僅在腫瘤組織中表達(dá)的基因有希望成為 候選靶。
綜上，本領(lǐng)域迫切需要找到與前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的、且在前列腺 癌中特異表達(dá)的基因，作為前列腺癌的治療靶標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種前列腺癌相關(guān)的N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因 (NDRG3)及其應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述NDRG3的拮抗劑及其在制備預(yù)防或治療 前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一目的在于提供基于所述的NDRG3作為藥物篩選靶點(diǎn)，篩選 預(yù)防或治療前列腺癌的潛在物質(zhì)的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供以所述的NDRG3作為標(biāo)志物，檢測(cè)前列腺癌 的方法、試劑或試劑盒。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因(NDRG3)或蛋 白的拮抗劑的用途，用于制備預(yù)防或治療前列腺癌的組合物。 在另一優(yōu)選例中，所述的前列腺癌細(xì)胞表達(dá)NDRG3。 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于抑制前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 在另一優(yōu)選例中，所述的拮抗劑選自(但不限于)
特異性干擾N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因表達(dá)的小干擾RNA分子或反義核苷 酸；或
特異性與N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因編碼的蛋白結(jié)合的抗體或配體。
在另一優(yōu)選例中，所述的小干擾RNA分子是
SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；
SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；
SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或
SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小千擾RNA分子。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種用于預(yù)防或治療前列腺癌的小干擾RNA 分子，所述的小干擾RNA分子選自
SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干擾RNA分子； SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干擾RNA分子； SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或 SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干擾RNA分子。在本發(fā)明的第三方面，提供一種預(yù)防或治療前列腺癌的組合物，所述的組 合物含有
(1) 有效量的N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或蛋白的拮抗劑，以及
(2) 藥學(xué)上可接受的載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有有效量的以下抗腫瘤藥物溶瘤病毒。
在另一優(yōu)選例中，所述的溶瘤病毒是ZD55-IL24。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種篩選預(yù)防或治療前列腺癌的潛在物質(zhì)的方
法，所述方法包括
(1) 用候選物質(zhì)處理表達(dá)N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的體系；和
(2) 檢測(cè)所述體系中N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的表達(dá)或活性；
其中，若所述候選物質(zhì)可降低N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的表達(dá)或活性，則 表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療前列腺癌的潛在物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(l)包括在測(cè)試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)N-myc 下游調(diào)節(jié)3型基因的體系中；和/或
步驟(2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的表達(dá)或活 性，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)N-myc 下游調(diào)節(jié)3型基因的體系；
如果測(cè)試組中N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的表達(dá)或活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu) 選顯著低于，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對(duì)照組， 就表明該候選物是預(yù)防或治療前列腺癌的潛在物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述的體系是細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì) 胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于預(yù)防或治療前列 腺癌有用的物質(zhì)。
在本發(fā)明的第五方面，提供一種特異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或其 編碼的蛋白的試劑的用途，用于制備檢測(cè)前列腺癌的試劑或試劑盒。
在另一優(yōu)選例中，所述的特異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或其編碼的 蛋白的試劑選自特異性擴(kuò)增N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的引物； 特異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的探針；或 特異性結(jié)合N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因編碼的蛋白的抗體或配體。 在另一優(yōu)選例中，所述的特異性擴(kuò)增N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的引物具有 SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的序列。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種檢測(cè)前列腺癌的試劑盒，所述的試劑盒中 含有特異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或其編碼的蛋白的試劑。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見(jiàn)的。


圖h NDRG3在人的組織和前列腺癌細(xì)胞株的表達(dá)情況。
A:利用大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)檢測(cè)NDRG3在33種人正常組織中的表達(dá)模式。
B:前列腺癌細(xì)胞株LNCaP、 CL-l、 PC-3、 DU145和前列腺永生化間質(zhì)細(xì) 胞株WPMY-l中NDRG3的表達(dá)情況，左圖為RT-PCR檢測(cè)mRNA，右圖為 Western blot檢測(cè)NDRG3蛋白，以P -actin作為上樣量對(duì)照。
C: LNCaP細(xì)胞中NDRG3受雄激素調(diào)節(jié)，左圖為RT-PCR檢測(cè)mRNA右 圖為Western blot檢測(cè)NDRG3蛋白(泳道1與4:未受雄激素處理；泳道2與5: 受雄激素(lOnM)處理24小時(shí)；泳道3與6:受雄激素(10nM)處理48小時(shí)。以 P-actin作為上樣量對(duì)照。
圖2: NDRG3在人前列腺癌組織中的表達(dá)情況。
在組織芯片上用免疫組化方法檢測(cè)NDRG3的表達(dá)情況，圖A， B， E， F 為前列腺癌樣品和圖C， D為BPH樣品。其中圖F中的樣品未受一抗處理， 作為陰性對(duì)照。
圖3: NDRG3的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞PC-3的致癌潛能。
A: Western blot分析穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NDRG3的細(xì)胞株P(guān)N3， PN5和PN10的表達(dá)水平。其中，Parental表示未轉(zhuǎn)染的親本PC-3細(xì)胞；PNK表示陰性對(duì)照。 B: PN3， PN5和PN10細(xì)胞的生長(zhǎng)速率，NDRG3穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆生
長(zhǎng)率明顯快于對(duì)照PNK。
C:創(chuàng)傷修復(fù)試驗(yàn)的照片。
D: NDRG3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株(PN3， PN10),禾[I PNK，親本PC-3細(xì)胞在裸 鼠上腫瘤形成試驗(yàn)。
圖4:在CL1細(xì)胞中降低NDRG3表達(dá)降低了細(xì)胞的生長(zhǎng)速度和克隆形成 能力。
A: Western blot結(jié)果顯示NDRG3-siRNA組(泳道l)的蛋白表達(dá)量明顯低 于GFP-siRNA組(泳道2)。
B:轉(zhuǎn)染NDRG3-siRNA和GFP-siRNA后72小時(shí)、120小時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)的比較。
C: CL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染NDRG3-siRNA后的克隆形成試驗(yàn)。
圖5:過(guò)量表達(dá)NDRG3的細(xì)胞株P(guān)N3， PN10在ZD55-IL24作用下的存活率。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，首次揭示N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因 (NDRG3)在前列腺癌中高表達(dá)，并且NDRG3的異常表達(dá)或活化與前列腺癌的 發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。NDRG3的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而抑制NDRG3 的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。并且，NDRG3的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)于 抗腫瘤藥物的抵抗能力。因此，NDRG3是一種在腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮重要功能的 基因，不僅可作為前列腺癌的診斷標(biāo)志，還可作為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)預(yù)防或治療前列腺 癌的藥物。
NDRG3
N-myc下游調(diào)節(jié)基因(N-myc downstream regulated gene， NDRG)是最近 發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的基因家族，它至少包括NDRG1、 NDRG2、 NDRG3和NDRG4 四個(gè)成員。其中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NDRG1、 NDRG2作為腫瘤生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)因子參與細(xì)胞的增殖與分化，因此具有腫瘤生長(zhǎng)抑制的功能。然而，在現(xiàn)有技術(shù)中NDRG3 的功能還沒(méi)有得到深入研究，尤其是NDRG3的功能以及是否與癌癥之間存在 關(guān)系并不清楚。
NDRG3基因(參見(jiàn)NP—114402.1)編碼374個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。為揭示前 列腺癌的發(fā)生機(jī)理，鑒定新的癌癥診斷標(biāo)記物和/或者藥物耙點(diǎn)以治療癌癥，本 發(fā)明人聯(lián)合大規(guī)模并行測(cè)序(MPSS)和組織芯片等技術(shù)分析了NDRG3在前列 腺和前列腺癌中的基因表達(dá)情況。利用MPSS技術(shù)對(duì)人類(lèi)多種組織進(jìn)行了 NDRG3表達(dá)分析，研究顯示NDRG3表達(dá)具有高度組織特異性，其中在睪丸和 前列腺中具有高表達(dá)。前列腺中每百萬(wàn)有30個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，睪丸每百萬(wàn)有92個(gè) 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其表達(dá)明顯高于其他組織，這說(shuō)明NDRG3在前列腺中是一個(gè)特異 表達(dá)基因。
本發(fā)明人用RT-PCR和Western印跡分析顯示，NDRG3在五種前列腺細(xì)胞 (包括PC3， DU145， CL-1， LNCaP和WPMY-1)中都有不同水平的表達(dá)，并 且在LNCaP細(xì)胞中NDRG3的表達(dá)可以被雄激素類(lèi)似物R1881顯著上調(diào)。本發(fā) 明人還在組織芯片上檢測(cè)到NDRG3在前列腺癌樣本中的表達(dá)率為58.6%，而 在良性前列腺增生(BPH)樣本中僅為13.2%，兩者差異顯著。上述結(jié)果說(shuō)明 NDRG3可以作為前列腺癌診斷的標(biāo)志物。
為了研究NDRG3是否能夠影響前列腺癌細(xì)胞的致癌潛能，本發(fā)明人制備 了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并高表達(dá)NDRG3的腫瘤細(xì)胞株，從而研究過(guò)表達(dá)NDRG3對(duì)腫瘤 細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示NDRG3能夠顯著促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，在克隆形 成試驗(yàn)和創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)中也表明它能夠增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的惡性度和遷移性。 NDRG3過(guò)表達(dá)可在裸鼠模型上促進(jìn)腫瘤形成。證明NDRG3具有腫瘤促進(jìn)功能 并在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起相當(dāng)重要的作用。上述研究結(jié)果不僅肯定了 NDRG3具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的功能，而且提示它對(duì)于治療或預(yù)防前列腺癌有重 要意義。
進(jìn)一步的，本發(fā)明人利用干擾NDRG3表達(dá)的siRNA轉(zhuǎn)染前列腺癌細(xì)胞， 研究所述siRNA對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的影響和作用。結(jié)果顯示RNAi后的前列腺癌細(xì)胞 中大部分內(nèi)源性的NDRG3蛋白表達(dá)降低，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度顯著降低，細(xì)胞形 成的克隆數(shù)明顯減少，即生長(zhǎng)率和克隆形成能力顯著降低。這說(shuō)明降低NDRG3 的表達(dá)可以抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此NDRG3可以作為前列腺癌的藥物 設(shè)計(jì)的靶標(biāo)。目前生物治療已成為腫瘤治療的發(fā)展方向，其中以溶瘤病毒為載體的病毒 -基因治療技術(shù)已顯示較好的療效。本發(fā)明人使用了 ZD55-IL24溶瘤病毒株。該 病毒株主要通過(guò)兩個(gè)基本點(diǎn)途徑殺死腫瘤細(xì)胞1，通過(guò)溶瘤病毒ZD55選擇性 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)繁雜，最后直接殺死宿主腫瘤細(xì)胞；2，通過(guò)溶瘤病毒ZD55選擇 性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)繁雜時(shí)，合成IL24。 IL-24分泌后，能選擇性殺死腫瘤細(xì)胞。 結(jié)果，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)，ZD55-IL24溶瘤病毒能有效殺死前列腺癌細(xì)胞，但 在同樣的ZD55-IL24用量的條件下，過(guò)量表達(dá)NDRG3的前列腺癌細(xì)胞的存活 率顯著增高。這充分說(shuō)明過(guò)量表達(dá)NDRG3的前列腺癌細(xì)胞能明顯的抵抗溶瘤 病毒的作用。N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的拮抗劑基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種NDRG3基因或蛋白的拮 抗劑的用途，用于制備預(yù)防或治療前列腺癌的組合物。如本文所用，所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑包括了抑制劑、下調(diào)劑、 阻滯劑、阻斷劑等。所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑是指任何可降低NDRG3蛋白的活性、 降低NDRG3基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)NDRG3蛋白的表達(dá)、減少NDRG3 蛋白有效作用時(shí)間、或抑制NDRG3基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可 用于本發(fā)明，作為對(duì)于下調(diào)NDRG3有用的物質(zhì)，從而可用于預(yù)防或治療前列 腺癌。例如，所述的拮抗劑是特異性干擾N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因表達(dá)的小 干擾RNA分子或反義核苷酸；或是特異性與N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因編碼的 蛋白結(jié)合的抗體或配體。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的拮抗劑是一種NDRG3特異性的小干 擾RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的"小干擾RNA (small interfering RNA， siRNA)"是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA 為耙目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過(guò)程就是RNA千擾(RNA interference)過(guò) 程。作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，提供了一種效果良好的小干擾RNA分子， 所述的小干擾RNA分子可特異性的干擾NDRG3基因的表達(dá)，與其它的人類(lèi)核 酸序列沒(méi)有顯著的同源性；并且經(jīng)驗(yàn)證，其具有良好的干擾NDRG3表達(dá)的效 果。所述的小干擾RNA分子是選自SEQIDNO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQIDNO:9或SEQIDNO: IO所示小干擾RNA分子的一種或多種。更優(yōu)選的，所述的小 干擾RNA分子是SEQ ID NO: 7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10所示小干擾RNA分子的組合分子；該組合分子中各小干擾RNA分子的比例 是(1-10): (1-10): (1-10): (1-10);較佳的是(l-5): (1-5): (1-5): (1-5);更佳的是(1國(guó)2): (1-2): (1-2): (1-2)。本發(fā)明對(duì)小干擾RNA的制備方法沒(méi)有特別的限制，包括但不限于化學(xué) 合成法，體外轉(zhuǎn)錄法等。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了本發(fā)明所提供的 siRNA的序列以后，可以以各種途徑方便地制備或表達(dá)所述的小干擾RNA。例 如，在本發(fā)明的一種優(yōu)選例中，所述的小干擾RNA是化學(xué)合成的。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義 鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。 一個(gè)雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互 分離的正義鏈和反義鏈來(lái)制備。因此，舉例來(lái)講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔?學(xué)合成的，其后可通過(guò)退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。所述的小干擾RNA可通過(guò)采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可 采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。此外，小干擾RNA包含的正義鏈和反義鏈可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)編碼正義鏈 和反義鏈的表達(dá)盒來(lái)制備。當(dāng)正義鏈和反義鏈由一個(gè)單獨(dú)的表達(dá)盒編碼時(shí)，它 們可以從生成的轉(zhuǎn)錄物中斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈 小干擾RNA。檢測(cè)前列腺癌的試劑或試劑盒基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，可以將NDRG3作為診斷前列腺癌的標(biāo)志物 (i)進(jìn)行前列腺癌的分型、鑒別診斷、和/或易感性分析；(ii)評(píng)估相關(guān)人群的 前列腺癌治療藥物、藥物療效、預(yù)后，以及選擇合適的治療方法；(iii)早期評(píng) 估相關(guān)人群前列腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)，早期監(jiān)測(cè)早期防治。比如，可分離出由NDRG3 基因表達(dá)異常而導(dǎo)致前列腺癌的人群，從而可進(jìn)行更有針對(duì)性地治療。因此，本發(fā)明提供了NDRG3基因或蛋白的用途，用于制備診斷(或檢測(cè))前 列腺癌的試劑或試劑盒。可釆用各種本領(lǐng)域已知的技術(shù)來(lái)檢測(cè)NDRG3基因的存在與否以及表達(dá)情 況，這些技術(shù)均包含在本發(fā)明中。例如可用已有的技術(shù)如Southern印跡法、序列分析、PCR等，這些方法可結(jié)合使用。本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)NDRG3基因的存在與否以及表達(dá)情況 的試劑。優(yōu)選的，當(dāng)進(jìn)行基因水平的檢測(cè)時(shí)，可以采用特異性擴(kuò)增NDRG3的引 物；或特異性識(shí)另IJNDRG3的探針來(lái)確定NDRG3基因的存在與否；當(dāng)進(jìn)行蛋白水 平的檢測(cè)時(shí)，可以采用特異性結(jié)合NDRG3編碼的蛋白的抗體或配體來(lái)確定 NDRG3蛋白的表達(dá)情況。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑是引物，其可特異性擴(kuò)增出NDRG3 基因或基因片段。更優(yōu)選的，所述的引物具有SEQIDNO: l和SEQIDNO:2所示 的序列。該引物擴(kuò)增獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物具有合適的長(zhǎng)度，且特異性高，對(duì)于復(fù)雜體系 的擴(kuò)增也具有良好的特異性。針對(duì)NDRG3基因的特異性探針的設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)，例如，制備 一種探針，其可與NDRG3基因上特定位點(diǎn)發(fā)生特異性結(jié)合，而不與NDRG3基因以 外的其它基因特異性結(jié)合，且所述探針帶有可檢測(cè)信號(hào)。利用特異性結(jié)合NDRG3蛋白的抗體來(lái)檢測(cè)分析物中NDRG3蛋白表達(dá)情況的方法也是本領(lǐng)域人員熟知的技術(shù)。本發(fā)明還提供了用于在分析物中檢測(cè)NDRG3基因的存在與否以及表達(dá)情 況的試劑盒，該試劑盒包括特異性擴(kuò)增N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的引物；特 異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的探針；或特異性結(jié)合N-myc下游調(diào)節(jié)3型 基因編碼的蛋白的抗體或配體。此外，所述的試劑盒中還可包括用于提取DNA、 PCR、雜交、顯色等所需 的各種試劑，包括但不限于抽提液、擴(kuò)增液、雜交液、酶、對(duì)照液、顯色液、 洗液等。此外，所述的試劑盒中還可包括使用說(shuō)明書(shū)和/或核酸序列分析軟件等。 藥物篩選在得知了NDRG3的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而抑制NDRG3的表達(dá) 可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)這一特征后，可以基于該特征來(lái)篩選抑制NDRG3的表達(dá) 或活性的物質(zhì)?？蓮乃龅奈镔|(zhì)中找到對(duì)于預(yù)防或治療前列腺癌真正有用的藥物。因此，本發(fā)明提供一種篩選抑制淀粉樣蛋白產(chǎn)生的潛在物質(zhì)的方法，所述 的方法包括用候選物質(zhì)處理表達(dá)NDRG3的體系；和檢測(cè)所述體系中NDRG3 的表達(dá)或活性；若所述候選物質(zhì)可抑制NDRG3的表達(dá)或活性，則表明該候選 物質(zhì)是預(yù)防或治療前列腺癌的潛在物質(zhì)。所述的表達(dá)NDRG3的體系較佳的是 細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)體系，所述的細(xì)胞可以是內(nèi)源性表達(dá)NDRG3的細(xì)胞； 或可以是重組表達(dá)NDRG3的細(xì)胞。例如所述的細(xì)胞選自前列腺癌細(xì)胞PC-3， DU145， CL-1或LNCaP。在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到NDRG3的表 達(dá)或活性的改變，還可設(shè)置對(duì)照組，所述的對(duì)照組可以是不添加所述候選物質(zhì) 的表達(dá)NDRG3的體系。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對(duì)獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一 步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對(duì)于預(yù)防或治療前列腺癌真 正有用的物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明還提供了釆用所述篩選方法獲得的預(yù)防或治療前列腺癌 的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫(kù)，以便于人們最終可以 從中篩選出能夠?qū)τ谝种芅DRG3的表達(dá)和活性，進(jìn)而預(yù)防或治療前列腺癌有 用的物質(zhì)。組合物本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt。/。；較佳的 0.0000l-20wt%;更佳的，0.0001-10wt%)的所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗 劑，以及藥學(xué)上可接受的載體。任何前述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑均可用 于組合物的制備。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，提供了一種用于預(yù)防或治療前列腺癌的組合 物，所述的組合物含有有效量的本發(fā)明所述的小干擾RNA分子，以及藥學(xué)上可 接受的載體。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，提供了一種用于預(yù)防或治療前列腺癌的組合 物，所述的組合物含有有效量的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑，以及有效量的 抗腫瘤藥物溶瘤病毒(優(yōu)選ZD55-IL24)。由于高表達(dá)NDRG3的腫瘤細(xì)胞比普 通腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的生命力，其抵抗腫瘤細(xì)胞的能力更強(qiáng)，因此在使用所述抗腫瘤藥物的同時(shí)或之前使用所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑來(lái)下調(diào) NDRG3的表達(dá)或活性，可使得所述腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物更敏感，從而達(dá)到 更理想的治療效果。如本文所用，所述"有效量"是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且 可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給 藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體它們本身 并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、 緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤(rùn)滑劑、助 流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試 劑。在得知了所述NDRG3基因或蛋白的拮抗劑的用途后，可以釆用本領(lǐng)域熟知 的多種方法來(lái)將所述的拮抗劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動(dòng) 物。包括但不限于皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋 給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進(jìn)行。比如，可直接將NDRG3的拮抗劑通 過(guò)諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過(guò)一定的途徑將攜帶NDRG3的拮 抗劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等，或siRNA)遞送到靶點(diǎn)上，并使之表達(dá) 活性的NDRG3拮抗劑，具體情況需視所述的拮抗劑的類(lèi)型而定，這些均是本領(lǐng) 域技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明所述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑的有效量可隨給藥的模式和待 治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù) 人員根據(jù)各種因素來(lái)確定(例如通過(guò)臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于所 述的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半 衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給 藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的NDRG3基因或蛋白的拮抗劑每天以約 0.00001mg-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的0,0001mg-10mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予， 能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分 開(kāi)的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。實(shí)施例1.細(xì)胞培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株LNCaP細(xì)胞，PC-3， DU145, CL-1和前列腺永生化間質(zhì) 細(xì)胞WPMY-1皆購(gòu)自ATCC。LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)在含5% FBS和100U/ml青鏈霉 素的DMEM培養(yǎng)基中。其他細(xì)胞株培養(yǎng)在含10% FBS和100U/ml青鏈霉素的 RPMI 1640培養(yǎng)基中。所有細(xì)胞均在37'C含5% (302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)施例2. MPSS檢測(cè)NDRG3在人體組織的表達(dá)提取各種人組織(見(jiàn)圖1)總RNA，用生物素標(biāo)記的寡核苷酸引物 (oligo-dT)將mRNA合成為cDNA雙鏈；限制性內(nèi)切酶Mbol (酶切位點(diǎn)為 GATC)消化cDNA片段，利用標(biāo)記的生物素純化消化的cDNA片段；合成包 含1.67 ><107個(gè)長(zhǎng)為32 bp的寡核苷酸片段的標(biāo)簽載體；將純化的cDNA片段克 隆入標(biāo)簽載體中，并通過(guò)標(biāo)簽載體上的PCR引物擴(kuò)增插入片段。酶切消化PCR 產(chǎn)物，生成含cDNA片段與32 bp標(biāo)簽相連接的產(chǎn)物；通過(guò)tag和anti-tag雜 交連接將cDNA片斷與微球體連接起來(lái)，每一個(gè)微球體上也可承載104-105個(gè) 相同的cDNA拷貝。進(jìn)一步消化結(jié)合在微球體上cDNA模板，用不同寡核苷酸接頭與連接在微 球體上的cDNA模板相連接，另外每一種接頭的3'端還帶有一個(gè)熒光標(biāo)記，可 與熒光探針雜交，分別加入能產(chǎn)生紅黃藍(lán)綠雜交信號(hào)的四套熒光探針，進(jìn)行雜 交用顯微拍照的方法記錄熒光信號(hào)，并將四種信號(hào)的圖像輸入計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存。MPSS檢測(cè)結(jié)果NDRG3在前列腺和睪丸組織中分別有30 tpm(每百萬(wàn)個(gè) 轉(zhuǎn)錄本具有的轉(zhuǎn)錄本數(shù))和92 tpm(圖1A),其表達(dá)明顯高于其他組織，這說(shuō)明 NDRG3在前列腺中是一個(gè)特異表達(dá)基因。實(shí)施例3.半定量RT-PCR檢測(cè)NDRG3在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá) 用Trizol試劑(Invitrogen)從各培養(yǎng)細(xì)胞(PC-3， DU145, CL-l， WPMY-1 和LNCaP)中提取總RNA，用Oligo-dT做引物和逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成cDNA，適當(dāng)?shù)南♂屆總€(gè)單鏈cDNA以進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增，用P -actin作為定量對(duì)照， 引物序列分別如下-NDRG3:正向(SEQIDNO: 1):5，- CtgCCtCCtgttC加CCC3CCt3 -3，,反向(SEQ ID NO: 2):5 '-ggcga3ttgtcccctaccacc3gt-3' <=P -actin:正向(SEQ ID NO: 3):5 ，-agaaaatctggcaccacacc-3'，反向(SEQ ID NO: 4):5 '-ctccttaatgtcacgcacga-3'。NDRG3的PCR條件是首先94t:變性10分鐘；然后94°C30秒，55°C 30秒，72°C l分鐘共26個(gè)循環(huán)；最后72'C延伸5分鐘。e -actin的PCR條件是首先94"C變性10分鐘；然后94°C30秒，55°C 30秒，72°C l分鐘共25個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸5分鐘。結(jié)果如圖1B， NDRG3 mRNA在5種細(xì)胞中都有表達(dá)，在CL-1細(xì)胞中表 達(dá)量多，而在WPMY-1細(xì)胞中表達(dá)量少。實(shí)施例4. Western blot檢測(cè)NDRG3蛋白在前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)提取前列腺癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)，分別取等質(zhì)量的五種細(xì)胞的總蛋白加1/4體 積的4X樣品緩沖液于100'C煮5分鐘，使其變性。12%的SDS-PAGE分離樣 品；電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；用0.05%的PBS-T[137mmol/LNaCl， 2.7 mmol/L KC1， 10mmol/LNa2HPO4， 2mmol/L KH2P04， 0.05% Tween20 (pH 7.4)]配置 的5。/J兌脂奶粉37t:封閉1小時(shí)；0.05%的PBS-T洗膜5分鐘X3次。 一抗山 羊抗NDRG3多克隆抗體(l: 200)37'C孵育2小時(shí)；洗膜15分鐘X3次；二抗 兔抗山羊IgG-HRP(l: 2000)37。C孵育1小時(shí)；0.05%的PBS-T洗膜15分鐘x3 次；加入ECL顯影液室溫放置3分鐘，壓片于暗盒中曝光。顯影、定影、讀片。結(jié)果如圖1B， NDRG3蛋白在LNCaP、 CL-1、 DU145和PC3有較高水平 的表達(dá)，而在WPMY-1中表達(dá)量低。將LNCaP細(xì)胞培養(yǎng)在含10。/。石碳粉過(guò)濾得FBS的培養(yǎng)液中。48小時(shí)后， 加入10nMR1881。分別在此24和48小時(shí)后收集細(xì)胞，并按前述的方法制備 樣品，通過(guò)半定量RT-PCR與Western blot技術(shù)檢測(cè)NDRG3的表達(dá)。結(jié)果如圖 1C,表明NDRG3的表達(dá)可以被雄激素類(lèi)似物R1881顯著上調(diào)。實(shí)施例5.免疫組化檢測(cè)前列腺癌組織芯片中NDRG3的表達(dá)帶有前列腺癌組織和BPH樣本的芯片購(gòu)自陜西超英生物技術(shù)有限公司。 3% 11202室溫處理IO分鐘。蒸餾水洗滌2分鐘x3次，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物 酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS(PH7.4)浸泡5分鐘；抗原修復(fù)，將切片放入一定 量的10mM檸檬酸鹽緩沖液中(PH6.0)，于微波修復(fù)加熱至沸騰18分鐘后離開(kāi) 熱源，室溫放置20分鐘自然冷卻，PBS(PH7.4)洗3次，每次5分鐘；(5)滴加 正常的兔血清封閉液，室溫20分鐘甩掉封閉液，勿洗；滴加山羊抗NDRG3多 克隆抗體(l: 50)， 4。C孵育過(guò)夜。PBS沖洗，15分鐘x3次；滴加生物素化兔抗 山羊IgG， 37'C孵育15分鐘，PBS洗2分鐘x3次；滴加生物素親和素過(guò)氧化 物酶復(fù)合物，37。C孵育15分鐘，PBS沖洗5分鐘x4次；DAB顯色室溫顯 色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌；蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片； 顯微鏡觀察，顯示棕黃色顆粒者為陽(yáng)性。根據(jù)對(duì)組織芯片結(jié)果的最后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，NDRG3在前列腺癌樣本中的表達(dá) 率為58.6% (41/70)，而B(niǎo)PH樣本只有13.2%，兩者差異明顯。部分表達(dá)NDRG3 的前列腺癌樣本或BPH樣本的染色結(jié)果如圖2所示。實(shí)施例6.表達(dá)載體的構(gòu)建 用下述引物擴(kuò)增NDRG3全長(zhǎng)編碼序列， 正向(SEQ ID NO: 5):GATCGGATCCGCCACCATGGATGAACTTCAGG; 反向(SEQ ID NO: 6):TAGAAAGCTTGGGCAGGACACCTCCATG;產(chǎn)物經(jīng)處理后插入到pcDNA3.1/myc-His(-)B (Invitrogen)的BamH I和 Hind m位點(diǎn)，通過(guò)測(cè)序確定構(gòu)建體，稱為pcDNA3.1/myc-His(-)B/NDRG3。實(shí)施例7.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立和對(duì)細(xì)胞的影響1. 對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響按照 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 的說(shuō)明書(shū)操作，將 pcDN A3.1 /my c-His(-)B/NDRG3重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC-3細(xì)胞，4小時(shí)后換含10。/。 FBS無(wú)抗生素的RPMI1640新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；24小時(shí)后換含10% FBS和 100U/ml青鏈霉素的RPMI1640新鮮培養(yǎng)液；再過(guò)24小時(shí)換含0.4mg/ml G418、 10% FBS和100U/ml青鏈霉素的RPMI1640新鮮培養(yǎng)液篩選培養(yǎng)；挑選單克隆 (PN3， PN5和PN10)擴(kuò)大培養(yǎng)，Western blot鑒定。此外，本發(fā)明人還通過(guò)轉(zhuǎn) 染空載體建立了這些克隆的陰性對(duì)照住克隆PNK。Western blot分析結(jié)果顯示，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NDRG3的細(xì)胞株P(guān)N3， PN5和PN10 比普通的PC-3細(xì)胞NDRG3蛋白的表達(dá)水平顯著提高(圖3A)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)l-5天，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示，NDRG3能夠顯著促 進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)率(圖3B)。2. 對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響轉(zhuǎn)移性強(qiáng)是腫瘤惡性程度的一個(gè)重要標(biāo)記。本發(fā)明人通過(guò)創(chuàng)傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)研 究了NDRG3的表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移的影響。當(dāng)PN3、 PNIO， PC-3和陰性對(duì)照 PNK在培養(yǎng)碟中的生長(zhǎng)達(dá)到完全飽和時(shí)，用一個(gè)微量移液器用的槍頭在培養(yǎng)孔 中劃出一條"道"，并完全清除其中所有的細(xì)胞。此外，更換培養(yǎng)液以除去懸 浮細(xì)胞。IO小時(shí)后，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，和PC-3和PNK等陰性對(duì)照相比，遷移進(jìn) 入"道"中的PN3、 PN10細(xì)胞明顯增加，說(shuō)明NDRG3能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷 移性(圖3C)。實(shí)施例8.裸鼠腫瘤生成試驗(yàn)NDRG3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株P(guān)N3、 PN10和陰性對(duì)照PNK和PC-3細(xì)胞在指數(shù) 生長(zhǎng)期收獲，重懸于無(wú)血清的RPMI 1640中，接種于5周齡雄性BALB/C裸鼠 的背側(cè)部，lOOial每只，裸鼠兩側(cè)分別接種NDRG3過(guò)表達(dá)的PN3或PN10細(xì)胞 和陰性對(duì)照細(xì)胞，每6天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬，腫瘤體積V二(長(zhǎng)X寬,/2 。
注射后18-48天的腫瘤體積如圖3D所示，表明NDRG3過(guò)表達(dá)在裸鼠模型 上促進(jìn)腫瘤形成。
實(shí)施例9. NDRG3-siRNA對(duì)CL-1細(xì)胞生長(zhǎng)和克隆形成的影響 CL-1細(xì)胞用4種NDRG3-siRNA寡核苷酸(Dharmacon， Lafayette， CO)混 合物(以按照摩爾比1:1:1:1混合)轉(zhuǎn)染，它們的序列為 GAUCAAACCACUUCUAAAU (SEQ ID NO: 7); AAACAGACCAGUUAUACUA (SEQ ID NO: 8); GCUAAAGGCUGGAUUGACU (SEQ ID NO: 9);禾口 CGCCUGAACCCUAUAAAUA (SEQ ID NO: 10)。
陰性對(duì)照為綠色熒光蛋白siRNA(GFP-siRNA)，它們的序列為 CGCUGACCCUGAAGUUCAUUU (SEQ ID NO: 11);或 GAGACCUGCUGAACACAAUU (SEQ ID NO: 12)。
按照TransMessenger Transfection Reagent (Qiagen， Hilden， Germany)說(shuō) 明書(shū)操作。CL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染NDRG3-siRNA和陰性對(duì)照后48小時(shí)，鋪到24孔 板，每孔300個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)14天，形成的克隆用4%甲醛固定，0.2%的 結(jié)晶紫染色。
結(jié)果顯示，NDRG3-siRNA組的NDRG3蛋白表達(dá)量明顯低于GFP-siRNA 組(圖4A)。
并且，轉(zhuǎn)染NDRG3-siRNA后，CL-1細(xì)胞生長(zhǎng)速度下降(圖4B和圖4D); 并且，CL-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染NDRG3-siRNA后形成的克隆數(shù)明顯少于對(duì)照組 GFP-siRNA (圖4C);
因此，降低NDRG3的表達(dá)可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)和克隆形成。
實(shí)施例10. ZD55-IL24對(duì)PC3細(xì)胞的殺傷性及其受NDRG3影響的研究 在96孔板每個(gè)孔中分別加入2萬(wàn)個(gè)普通PC細(xì)胞，PNK克隆，PN3和PN5 克隆。24小后再分別加入不同量(MIO1-MIO100)的溶瘤病毒ZD55-IL24(獲自 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，可殺死腫瘤細(xì)胞)。在本研究中，病毒加入后72小時(shí)，對(duì)存活細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。坐標(biāo)縱軸代表存活細(xì)胞數(shù)；坐標(biāo)橫軸代表溶瘤 病毒用量。將最初加入的細(xì)胞量設(shè)置為100%。
結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)溶瘤病毒ZD55-IL24能有效殺死PC-3前列腺癌細(xì) 胞。在同樣的ZD55-IL24用量(MIO100)的條件下，過(guò)量表達(dá)NDRG3的PC-3 細(xì)胞(PN3和PN10)的存活率比對(duì)照組(PNK)高出3-4倍。這充分說(shuō)明過(guò)量表達(dá) NDRG3的PC-3前列腺癌細(xì)胞能明顯的抵抗ZD55-IL24的作用。
實(shí)施例11.藥物篩選
細(xì)胞模型穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了 pcDNA3.1/myc-His(-)B/NDRG3的PC3細(xì)胞(制備方 法見(jiàn)實(shí)施例6和7)，其中表達(dá)NDRG3蛋白。
測(cè)試組用候選物質(zhì)處理的上述細(xì)胞的培養(yǎng)物； 對(duì)照組不用候選物質(zhì)處理的上述細(xì)胞的培養(yǎng)物。
如果與對(duì)照組相比，測(cè)試組中的NDRG3蛋白的表達(dá)顯著下降50%以上， 則說(shuō)明該候選物質(zhì)是潛在的預(yù)防前列腺癌的物質(zhì)。
釆用上述方法，將由SEQ ID NO: 7-10(等量混合)的siRNA(候選物質(zhì)1)， 以及SEQ ID NO: 11-12(等量混合)的siRNA(候選物質(zhì)2)作為候選物質(zhì)，轉(zhuǎn)染所 述細(xì)胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，候選物質(zhì)1是預(yù)防前列腺癌的物質(zhì)；而候選物質(zhì)2沒(méi) 有作用。
實(shí)施例12.組合物
將各5 nmol的SEQ ID NO: 7-10的siRNA加入到500 u 1純水中，或也可 加入到500" 1常規(guī)溶解緩沖液中，配制成含siRNA的組合物。
實(shí)施例13.檢測(cè)試劑盒
一種檢測(cè)前列腺癌的試劑盒，該試劑盒中含有 容器1，以及裝于該容器中的SEQ ID NO: 1所述序列的引物1; 容器2，以及裝于該容器中的SEQIDNO:2所述序列的引物2; 以及，其它一些容器，其中分別裝有dNTP; DNA聚合酶；MgCl: 以及，說(shuō)明檢測(cè)方法的適用說(shuō)明書(shū)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申 請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表
<110>上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所；
中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院； 浙江大學(xué)
<120> —種前列腺癌相關(guān)的基因及其用途 <130> 084386 <160> 12
<170〉 Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 24
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc—feature <223〉 引物
<400〉 1
ctgcctcctg ttcttaccca ccta 24
<210〉 2
〈211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
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<221> misc—feature <223> 引物
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ggcgaattgt cccctaccac cagt 24
<210〉 3
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<212〉 DNA
<213〉 人工序列
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<221〉 misc—feature <223> 引物<400〉 3
agaaaatctg gcBccacscc 20
<210〉 4
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<212〉 DNA
<213〉 人工序列
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<221〉 misc一feature
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ctccttaatg tcacgcacga 20
<210〉 5
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<212〉 DNA
<213〉 人工序列
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<221> misc—feature <223〉 引物
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gatcggatcc gccaccatgg atgaacttca gg
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<212> DNA <213>人工序列
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<221〉 misc一feature
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tagaaagctt gggcetggaca cctccatg 28
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<212〉 腿 <213〉人工序列<220〉
<221〉 misc_feature <223〉寡核苷酸
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ganca33cc3 cuucu3aau 19
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<212〉 RNA <213〉人工序列
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<221〉 misc_feature <223〉寡核苷酸
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aaacagacca guuauacua 19
<210〉 9
<211> 19
<212〉 腿 <213>人工序列
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<221〉 misc_feature <223〉寡核苷酸
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gcuaaaggcu ggaxiugacu 19
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<212〉 脆 <213〉人工序列
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<221〉 misc一feature <223〉寡核苷酸
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cgccugaacc cuaimaaus 19<210〉 11
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<212〉 艦
<213〉 人工序列
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cgcugacccu g犯guucauu u
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<211> 20
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
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<221〉 misc—feature <223〉 人工序列
<400> 12
gagaccugcu gaacacaauu
權(quán)利要求
1.一種N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或蛋白的拮抗劑的用途，用于制備預(yù)防或治療前列腺癌的組合物。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的拮抗劑選自特異性干擾N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因表達(dá)的小干擾RNA分子或反義核苷 酸；或特異性與N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因編碼的蛋白結(jié)合的抗體或配體。
3. 如權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于，所述的小干擾RNA分子是 SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干擾RNA分子。
4. 一種用于預(yù)防或治療前列腺癌的小干擾RNA分子，其特征在于，所述 的小干擾RNA分子選自SEQ ID NO: 7所示核苷酸序列的小干擾RNA分子； SEQ ID NO: 8所示核苷酸序列的小干擾RNA分子； SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或 SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的小干擾RNA分子。
5. —種預(yù)防或治療前列腺癌的組合物，其特征在于，所述的組合物含有(1) 有效量的N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或蛋白的拮抗劑，以及(2) 藥學(xué)上可接受的載體。
6. 如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述的組合物還含有有效量 的以下抗腫瘤藥物溶瘤病毒。
7. —種篩選預(yù)防或治療前列腺癌的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括(1) 用候選物質(zhì)處理表達(dá)N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的體系；和(2) 檢測(cè)所述體系中N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的表達(dá)或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的表達(dá)或活性，則 表明該候選物質(zhì)是預(yù)防或治療前列腺癌的潛在物質(zhì)。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(l)包括在測(cè)試組中， 將候選物質(zhì)加入到表達(dá)N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的體系中；和/或步驟(2)包括檢測(cè)測(cè)試組的體系中N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的表達(dá)或活 性，并與對(duì)照組比較，其中所述的對(duì)照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)N-myc 下游調(diào)節(jié)3型基因的體系；如果測(cè)試組中N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的表達(dá)或活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對(duì)照 組，就表明該候選物是預(yù)防或治療前列腺癌的潛在物質(zhì)。較佳的，所述的體系是細(xì)胞體系。
9. 一種特異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或其編碼的蛋白的試劑的用 途，用于制備檢測(cè)前列腺癌的試劑或試劑盒。較佳的，所述的特異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或其編碼的蛋白的試劑選自特異性擴(kuò)增N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的引物； 特異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的探針；或 特異性結(jié)合N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因編碼的蛋白的抗體或配體。 較佳的，所述的特異性擴(kuò)增N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因的引物具有SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示的序列。
10. —種檢測(cè)前列腺癌的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有特 異性識(shí)別N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因或其編碼的蛋白的試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種前列腺癌相關(guān)的基因及其用途，所述的基因是N-myc下游調(diào)節(jié)3型基因(NDRG3)。NDRG3在前列腺腺癌組織中高表達(dá)，其過(guò)量表達(dá)可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖，并降低前列腺癌細(xì)胞的生物治療的效果。降低NDRG3蛋白的表達(dá)可明顯抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因而，NDRG3可作為新的前列腺癌診斷或治療的靶分子。
文檔編號(hào)A61K39/395GK101632833SQ200810040989
公開(kāi)日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2008年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月25日
發(fā)明者劉新垣, 揚(yáng) 李, 李潤(rùn)生, 李玉華, 林標(biāo)揚(yáng), 王偉群, 范鈞鍇, 顧錦法 申請(qǐng)人:上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所;中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院;浙江大學(xué)